1、实验六 SDS-PAGE电泳,武汉生物医学研究院 2013年4月3日,实 验 目 的,学习SDS-PAGE电泳的基本原理掌握垂直板电泳的操作方法运用SDS-PAGE测定蛋白质分子量及染色鉴定,SDS-PAGE电泳的基本原理,电泳:带电颗粒在电场的作用下，向着与其电性相反的电极移动，称为电泳。,SDS-PAGE电泳的基本原理,聚丙烯酰胺凝胶(PAGE)电泳是以聚丙烯酰胺凝胶为载体的一种区带电 泳。该凝胶由丙烯酰胺（Acr）和交联剂N，N甲叉双丙烯聚酰胺（Bis）聚合 而成。利用电泳和分子筛的双重作用分离物质。在聚丙烯酰胺凝胶电泳中，蛋 白质的迁移率取决于它所带的净电荷的多少、分子的大小和形状等因
2、素 。如果用过量的还原剂（如巯基乙醇或二硫苏糖醇等）和十二烷基硫酸钠 （缩写SDS）加热处理蛋白质样品，蛋白质分子中的二硫键将被还原，蛋白质- SDS复合物具有相同的电荷密度，并引起蛋白质构象改变，使蛋白质在凝胶中 的迁移率不再受原带的电荷和形状的影响，而取决于相对分子质量的大小，电 泳时纯粹靠凝胶的分子筛效应进行分离。,SDS-PAGE电泳的基本原理,Acr和Bis单独存在或混合在一起时是稳定的，但在具有自由基团体系时就能聚合。引发自由基团的方法有化学法和光化学法两种。 化学法的引发剂是过硫酸胺（Ap），催化剂是四甲基乙二胺（TEMED）；光化学法是以光敏感物核黄素来代替过硫酸铵，在紫外光照
3、射下引发自由基团。 采用不同浓度的Acr、Bis 、Ap、TEMED使之聚合，产生不同孔径的凝胶。因此可按分离物质的大小，形状来选择凝胶浓度。,SDS-PAGE电泳的基本原理,SDS-PAGE电泳的基本原理,SDS-PAGE电泳的基本原理,SDS-PAGE电泳的基本原理,1. 材料： 前期实验中提取的蛋白 2试剂： (1) 30%丙烯酰胺(Acr)：称Acr30g，甲叉双丙烯酰胺(Bis)0.8g，加蒸馏水至100ml，过滤后置棕色瓶中， 4贮存可用1-2月。 (2) 10%SDS(十二烷基磺酸钠) (3) 1.5mol/l pH8.8 Tris-HCl缓冲液：称取Tris18.2g， 加入5
4、0ml水，用1mol/l盐酸调pH8.8，最后用蒸馏 水定容至100ml。 (4) 1.0mol/lpH6.8Tris-HCl缓冲液：称取Tris12.1g，加 入50ml水，用1mol/l盐酸调pH6.8，最后用蒸馏水定容至100ml。 (5) 0.05mol/lpH8.0Tris-HCl缓冲液：称取Tris0.6g，加入50ml水，用1mol/l盐酸调pH8.0，蒸馏水定容至100ml。,SDS-PAGE电泳的基本原理,(6) 10%过硫酸铵(AP) (7) TEMED(四甲基乙二胺) (8) 上样缓冲液：SDS(100mg)+巯基乙醇(0.1ml)+ 溴酚蓝(2mg)+ 甘油(2g) +
5、0.05mol/L pH8.0Tris-HCl(2ml)，最后定容至10ml。 (9) 固定液：取50%甲醇454ml，冰乙酸46ml混匀。 (10) 染色液：称取考马斯亮蓝R250 0.125g，加上述固定液250ml， 过滤后备用。 (11) 脱色液：冰乙酸75ml，甲醇50ml，加蒸馏水定容至1000ml。 (12) 电泳缓冲液: 称Tris6.0g，甘 氨酸28.8g，加入SDS1g，加蒸馏水使其溶解后定容至1000ml。,SDS-PAGE电泳的基本原理,垂直板电泳装置 直流稳压电源 移液管 滤纸 微量注射器 大培养皿,3. 实验设备,将红色玻璃夹子底座朝下、卡口打开呈直角状，放入厚薄
6、两片玻璃，薄玻璃朝向自己。注意厚玻璃箭头向上，旁边两条小玻璃条与薄玻璃接触，使之形成一个间隙。,在平整的桌面上放下玻璃与夹子，使玻璃和夹子的底面完全对齐，向外扳动塑料卡口，关紧夹子。,SDS-PAGE电泳的操作方法,1装配制胶用的玻璃板,将做好的玻璃夹放在制胶架上，注意薄玻璃朝向自己，厚玻璃上的箭头向上。按弹簧夹，将玻璃夹卡入制胶架。在玻璃的间隙内灌胶，放上梳子，待胶凝固。,SDS-PAGE电泳的操作方法,2. 制分离胶和浓缩胶,(1)制分离胶：按所需的浓度配制15分离胶。,TEMED最后加，快速混匀后用移液枪灌胶，由固定位置灌入，注意不能有气泡； 灌完分离胶后在胶面上小心加1毫升水封（注意不
7、要冲坏胶面），等胶自然凝聚（这时候在胶面与水封之间可以看见清晰的界限）。,SDS-PAGE电泳的操作方法,加入分离胶溶液 pH 8.8,制备分离胶,封水的目的是使分离胶上表面平直，并排除气泡。 凝胶聚合好的标志是胶与水层之间形成清晰的界面。,(2)制浓缩胶：按所需的浓度配制5浓缩胶。,SDS-PAGE电泳的操作方法,分离胶 pH 8.8,制备浓缩胶,取出制好的玻璃（连带胶），将玻璃放入电极架（卡在底面的卡口上），注意薄玻璃朝向电极架，厚玻璃的箭头朝上，玻璃与红色橡胶条必须完全紧贴。（需同时放置两块制好的胶，如只使用一块则另一面须用提供的塑料板代替，注意塑料板上的提示，必须使塑料板与橡胶条完全紧
8、贴。）正常安装则会形成一个密闭的容器。,SDS-PAGE电泳的操作方法,3.,将底座的开关打开，并向外拨动透明的架子，使中间空隙增大，放入电极架。,如图所示将电极架往下压（约12mm），使底面完全接触。,SDS-PAGE电泳的操作方法,4.,关上底座开关。,放入电泳槽内，加上加样架加样。注意加样架与刚才制胶所用的梳子齿数必须一致。,SDS-PAGE电泳的操作方法,5.,6加样：取蛋白样品加样，每个加样孔加样不宜过多，一般每孔加样1030l。,SDS-PAGE电泳的操作方法,浓缩胶 pH 6.8,分离胶 pH 8.8,上样及电泳,开始电压恒定在80V，当进入分离胶后改为120V，溴酚蓝距凝胶边缘
9、约5mm时，停止电泳。,7电泳：先恒压80V，待样品进入分离胶后，调电压为120V（恒压）。当溴酚蓝移动到离底部约0.5cm时，停止电泳。 8撬开玻璃板，将浓缩胶切掉, 剥下凝胶，准备染色。 9 凝胶染色：使用考马斯亮蓝R250染色。两块胶（小盒子）或四块胶（大盒子）同步染色脱色。盖上盖子用微波炉加热约15-20秒，摇床振荡15分钟，回收染液至指定容器。清水漂洗后加入脱色液（25%乙醇，7.5%乙酸）脱色，用量和步骤与染色相同，脱色两次，每次10分钟。,SDS-PAGE电泳的操作方法,注意事项 (1) Acr和Bis均为神经毒剂，对皮肤有刺激作用，操作时应戴手套和口罩。 (2) 玻璃板表面应光滑洁净，否则在电泳时会造成凝胶板与玻璃板之间产生气泡。 (3) 样品槽模板梳齿应平整光滑。 (4) 灌凝胶时不能有气泡，以免影响电泳时电流的通过。 (5) 切勿破坏加样凹槽底部的平整，以免电泳后区带扭曲。 (6)电泳时应选用合适的电流、电压，过高或者过低都会影响电泳效果。 (7) 稀释5SDS/电泳缓冲液至1浓度灌入电泳槽，需800毫升。,SDS-PAGE电泳的操作方法,蛋白质分子量测定,标难曲线只对同一块凝胶上的样品的分子量测定才具有可靠性。,以每个蛋白标准的分子量对数对它的相对迁移率作图得标准曲线，量出未知蛋白的迁移率即可测出其分于量。,请大家批评指正,
