1、Comment a1: 打开二硫键的作用SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS-PAGE) 实验原理和操作步骤实验原理：SDS-PAGE是对蛋白质进行量化，比较及特性鉴定的一种经济、快速、而且可重复的方法。该法是依据混合蛋白的分子量不同来进行分离的。SDS是一种去垢剂，可与蛋白质的疏水部分相结合，破坏其折叠结构，并使其广泛存在于一个广泛均一的溶液中。SDS 蛋白质复合物的长度与其分子量成正比。在样品介质和凝胶中加入强还原剂和去污剂后，电荷因素可被忽略。蛋白亚基的迁移率取决于亚基分子量。试剂和器材：试剂：1. 5x样品缓冲液（10ml）:0.6ml 1mol/L的 Tris-HCl(pH6.8),5
2、ml 50%甘油，2ml 10%的 SDS，0.5ml 巯基乙醇，1ml 1%溴酚蓝，0.9ml 蒸馏水。可在 4保存数周，或在20保存数月。2. 凝胶贮液：在通风橱中，称取丙烯酰胺30g，甲叉双丙烯酰胺0.8g，加重蒸水溶解后，定容到100ml。过滤后置棕色瓶中，4保存，一般可放置1个月。3. pH8.9分离胶缓冲液： Tris 36.3g ，加1mol/L HCl 48ml，加重蒸水80ml 使其溶解，调 pH8.9，定容至100ml ， 4保存。4. pH6.7浓缩胶缓冲液： Tris 5.98g ，加1mol/L HCl 48ml，加重蒸水80ml 使其溶解，调 pH6.7，定容至10
3、0ml ， 4保存。5. TEMED（四乙基乙二胺）原液6.10%过硫酸铵（用重蒸水新鲜配制）7. pH8.3 Tris-甘氨酸电极缓冲液：称取 Tris 6.0g，甘氨酸28.8g，加蒸馏水约900ml ，调 pH8.3后，用蒸馏水定容至1000ml。置4 保存，临用前稀释10倍。8. 考马斯亮蓝 G250染色液：称100mg 考马斯亮蓝 G250，溶于200ml 蒸馏水中，慢慢加入7.5ml 70%的过氯酸，最后补足水到250ml，搅拌1小时，小孔滤纸过滤。器材：电泳仪，电泳槽，水浴锅，摇床。Comment a2: 缓冲溶液，三羟甲基氨基甲烷Comment a3: 甲叉双丙烯酰胺Comme
4、nt a4: 十二烷基磺酸钠，使蛋白质变性Comment a5: 过硫酸铵，助氧化剂，加速胶的凝固Comment a6: 催化过硫酸钠产生自由基，从而加速丙烯酰胺凝胶的聚合Comment a7: 重蒸水实验操作（一）样品制备将蛋白质样品与5X 样品缓冲液（20ul5ul）在一个Eppendorf管中混合。放入100 加热 510min，取上清点样。（二）分离胶及浓缩胶的制备1 将玻璃板、样品梳、Spacer 用洗涤剂洗净，用 ddH2O 冲洗数次，再用乙醇擦拭，晾干；2 将两块洗净的玻璃板之间加入 Spacer，按照 Bio-Rad Mini /说明书提示装好玻璃板；3 按如下体积配制10 分
5、离胶8.0 ml，混匀；ddH2O 3.0 ml1.0 mol/LTris-HCl pH=8.8 2.1 ml30% Acr-Bis 2.8 ml10% SDS 80 ul10%AP 56 ulTEMED 6 ul4 向玻璃板间灌制分离胶，立即覆一层重蒸水，大约20 min后胶即可聚合；5 按如下体积配制6浓缩胶3.0 ml，混匀；ddH2O 1.0 mol/LTris-HCl pH=6.8 30% Acr-Bis2.0 ml 400 ul 600 ul10% SDS 10% AP TEMED36ul 24ul 4ul6 将上层重蒸水倾去，滤纸吸干，灌制浓缩胶，插入样品梳；7 装好电泳系统，加入电极缓冲液，上样20 l;8 稳压200V ，溴酚蓝刚跑出分离胶时，停止电泳，约需45 min1hr.9 卸下胶板，剥离胶放入染色液中，室温染色12 hr；加入脱色液，置于80 rpm 脱色摇床上, 每20 min 更换一次脱色液（10 ml 冰乙酸；45 ml 乙醇；45 ml 蒸馏水）至完全脱净。
