1、SDS-PAGE 蛋白质凝胶电泳第一部 知识准备一、 双向凝胶电泳蛋白质组分析的先决条件是蛋白质的分离。分离过程一般可以分为 2 步，首先将蛋白质消化成肽段，通常由蛋白水解酶完成，然后将复杂的混合物分离成简单地形式。这 2 步没有明确的先后关系，也可先将蛋白质混合体分离成单个的蛋白质或肽段，然后消化分析。双向凝胶电泳是采取的先分离后消化的方法，是目前唯一可以在一块凝胶上同时分离数千乃至数万个蛋白质的方法，是当今蛋白质组学方法的主流。刚刚兴起的非胶系统蛋白质组学是先消化然后直接质谱分析，充分应用生物信息学方法，是蛋白质组学分离方法的一个发展方向。(一)双向电泳简介双向电泳技术建立于 20 世纪
2、70 年代，它的基本原理是首先根据蛋白质等电点的不同在 pH 梯度介质中等电聚焦（isoelectrofocusing,IEF）将其分离，然后按照其分子量大小在垂直或水平方向进行十二烷基磺酸钠聚丙烯酰胺凝胶电泳（SDS-APGE）进行分离。目前，根据第一向等电聚焦条件和方式的不同，可将双向凝胶电泳分为三种系统：载体两性电解质 pH 梯度-SDS 电泳技术（ISO-DALT） 、不平衡的 pH 梯度凝胶电泳（NEPHGE） 、固相 pH 梯度-SDS 电泳技术（IPG-DALT） 。在 ISO-DALT系统中，等电聚焦在聚丙烯酰胺管胶中进行，载体两性电解质在外加电场作用下形成 pH 梯度。其主要
3、缺点是在碱性区域不稳定（阴极漂移） 、重复性不易掌握和上样量低，并且一般不能分离等电点大于 8.0 的碱性蛋白质；优点是电泳设备要求不高，电泳溶液容易配制，易于展开工作。各种电泳条件经优化后，可达到非常高的分辨率，也可获得好的重复性，利用这一系统可以分辨 10000个蛋白质斑点。NEPHGE 为非平衡 pH 梯度电泳，是 IPG 胶发明之前用于分离碱性蛋白质的一种方法，蛋白质在等电点等电聚焦场中大道平衡前结束电泳，第一向的 pH 也是依靠载体两性电解质和电场来建立。在 IPG-DALT 是现在主要和常用的方法，它的优势表现在：pH 梯度稳定、梯度分辨率高；无阴极漂移及碱性蛋白质丢失现象；蛋白质
4、上样量大，可以提高低丰度蛋白质成分的分辨效果；样品中盐的干扰少，无边缘效应；pH 梯度和分离效果的重复性好。固相 IPG 胶条引入后，双向电泳技术的分辨率和重复性均得到大大的提高，可以更直观的提供蛋白质的分子量、等电点、表达丰度的相对量等信息，尤其是各个公司提供了多种不同 pH 范围的固相 IPG 胶条，使得双向电泳的分离效果得到进一步提高。但是双向电泳也存在以下问题：很多疏水的膜结合蛋白、低丰度蛋白以及极酸和极碱的蛋白无法坚持；同一实验中不同蛋白的染色强度不一致，不同的实验中同一种蛋白染色也可能不一致，这使得比较不同凝胶上含量变化的可信度低；蛋白质翻译后修饰，磷酸化等加大了分析的复杂性；双向
5、电泳操作步骤多，影响因素也多，因此它的操作自动化也是期待解决的难点之一。（二）样品制备蛋白质样品制备是至关重要的一步，合理恰当的制备方法是获得分辨率高、重复性好的双向凝胶图谱的先决条件。对不同类型的蛋白质进行样品制备时，需要采用不同的方法和条件。但不管怎样，我们首先要明确的是其实验的研究目的，既是获得尽可能多的蛋白，还是仅仅需要获得感兴趣的某些蛋白。另外，虽然我们会采用一些附加的样品制备方法提高二维电泳图谱的质量，但是同时也会导致某些种类蛋白质的丢失，以及因操作步骤过多造成的实验重复性差。因此，在进行样品制备前我们必须谨慎的权衡上述几者之间的关系。样品制备必须遵循严格的处理方法以避免蛋白质组成
6、的定性定量变化，如保证蛋白质不被修饰，避免其等电点的改变，尽可能扩大其溶解度和解聚，尽量减少蛋白提取过程中的降解和丢失。总的来说，样品制备的理想状态就是尽量简化处理步骤，最好一步完成蛋白质的完全处理。细胞和组织样品的制备应尽可能减少蛋白的降解，低温和蛋白酶抑制剂可以防止蛋白的降解；样品裂解液应该新鲜制备，并且分装冻存于-80。勿反复冻融已经制备好的样品；通过超速离心清楚所有的杂质；加入尿素之后加温不要超过 37，防止氨甲酰化而修饰蛋白。样品制备的裂解液主要是变性剂、表面活性剂和还原剂等。（三）变性剂变性剂通过断裂氢键和疏水建使蛋白质去折叠，暴露疏水核心，使蛋白质变性，增加其溶解性，而同时不影响
7、蛋白质所带电荷。尿素是常用的强变性剂。尿素和硫脲结合使蛋白质的溶解性更好，尤其是对疏水性的膜蛋白。（四）表面活性剂表面活性剂有离子型、非离子型和兼性离子型等几类。离子型表面活性剂虽然能有效地溶解蛋白，但是可以使蛋白质带上负电荷，干扰第一向等电聚焦而避免使用。传统的非离子型表面活性剂以前用得较多，但是慢慢被兼性型所代替，如丙磺酸 3-（3-胆酰胺丙基）二甲胺内盐（CHAPS） 。CHAPS 可以加大尿素地溶解性，但是在硫脲浓度高时，其溶解能力大大降低，而 SB3-10 溶解疏水性氨基酸残基的能力更好，较 CHAPS 更有效，但是很难溶于高浓度尿素。因此，为协调变性剂和表面活性剂有效性的矛盾，针对
8、不同样本应该采取不同的策略。（五）还原剂还原剂多使用 -巯基乙醇、二硫苏糖醇（dithiothreitol,DTT） ，通过打断二硫键，使蛋白彻底去折叠而变性。但是 DTT 由于带一定电荷，尤其是在碱性条件下，等电聚焦过程中会迁移出 pH 梯度，造成一些蛋白质重新形成二硫键而使蛋白质溶解度下降。三正丁基磷（tributyl phosphate,TBP）不带电荷，在等电聚焦中大大增加了蛋白质的溶解性，并提高了蛋白质从第一向到第二向的效率。（六）两性电解质及其他两性电解质能促使蛋白质的溶解，吸附高浓度尿素在溶液中形成的氰酸盐离子，离心时有利于核酸的沉淀。此外，样品处理中还可以加入蛋白酶抑制剂如 E
9、DTA 等，保持蛋白的完整性。为了去核酸，可用超速离心的方法或是加入核酸内切酶 Dnase 或 Rnase。二、等电聚焦（一）等电聚焦的原理等电聚焦是利用蛋白质的等电点不同，在凝胶中将蛋白质混合物分离开。蛋白质是两性分子，同时拥有酸性和碱性基团。在一定的 pH 条件下，蛋白质带上一定的电荷。在碱性环境中，酸性基团带负电，而在酸性环境中碱性基团就会带正电。蛋白质的净电荷就是氨基酸侧链中所以负电荷和正电荷的总和。这些净电荷可以绘制在以 pH 为刻度的图谱上。每一个蛋白质都有一个独特的净电荷曲线。该曲线与 X 轴的交点就是等电点（pI）-即在该 pH 值时，净电荷为零。在电场作用下，蛋白质分子分别向
10、正极或负极漂移，当达到与其等电点相同的 pH 位置时，蛋白质不带电，就不再发生漂移。最开始，由小分子载体两性电解质在电场作用下形成 pH 梯度，并将载体固定，于是形成了固相 IPG 胶条。载体两性电解质是一些可溶性的两性小分子，它们在其 pI 附近有很高的缓冲能力。蛋白质样品加入后，在电场作用下，蛋白质迁移至与其等电点相同的 pH 位置，带电状态达到平衡，不再迁移，使得等电点不同的蛋白质得到分离。需要再次强调的是，蛋白质带电状态取决于其二级结构，而聚焦过程中的蛋白质所带电荷只跟其一级结构相关，所以如果蛋白质的二级结构没有去除彻底的话，就可能产生连续分布的带电状态各异的同一蛋白质的各种构象，降低
11、了聚焦的分辨率。（二）等电聚焦的过程等电聚焦一般是由胶条的重泡胀、加样、聚焦三个步骤组成的。已普及的商品化固相 IPG 胶条使用前是以干胶条的形式和塑料支撑薄膜粘在一起，加样前需要先撕去薄膜在重泡涨液中泡涨。泡涨液的成分与裂解液成分基本相同，标准的“重泡胀溶液”的组成为 8mol/L 尿素，0.5%CHAPS，0.2%DTT，0.5%载体两性电解质，10%（v/v）甘油，0.002%溴苯酚蓝。其中甘油能降低电子内渗效应，防止凝胶干枯和尿素结晶。重泡涨和等电聚焦过程中的温度都稳定在 20，温度太低尿素会结晶出来，温度不稳定也会造成胶上蛋白质位置的变化。重泡胀的时间至少要 10 小时，泡胀不充分会
12、影响大分子量蛋白的吸收。一般来说，加样方式有两种，再水化上样和加样杯上样。前者是将溶解液中的蛋白质样品用再水化溶液稀释至所需要的蛋白浓度。胶条的再水化是在单独的持胶器或重泡胀池里进行的。干胶基质和蛋白同时吸收了。一开始，干胶基质孔径较小，小分子物质（如水、尿素、去污剂和还原剂）进入的速度比蛋白快；随后，大部分蛋白扩散进了完全再水化的凝胶。后者是将胶条先用再水化溶液进行预水化，在确定的 pH 梯度，酸性或碱性一侧，将样品加入上样杯。最适当的上样点非常重要，可根据每种蛋白的类型和所用的梯度来决定。在电泳作用下，蛋白质进入胶条。等电聚焦电泳是在凝胶表面的胶条中进行的。上样量的选择对高质量的双向电泳图
13、谱也是很重要的。制备型电泳较分析型电泳来说要求更高的上样量；对于同一类型的电泳，太多或太少的蛋白皆不能获得高分辨率的图谱；对于相同的上样量，不同的检测方法也会得到不同的结果。等电聚焦的电压上升分为三个阶段，首先加上一个比较低的电压，去除胶条中的过多的盐离子。然后开始加电压，电压上升的模式为缓慢上升。最后持续高压，电压上升的模式为快速上升。一般来讲，根据胶条的长度和 pH 范围，以及上样量的多少，总电压时间即可以在一定范围内调整。聚焦过程中提高电压可以提高蛋白质的分辨率，但是如果电压过高将产生大量的热量，反而不利于蛋白质的分离。因此等电聚焦过程中电压递增的幅度不能过大，缓慢递增以促进蛋白质进入
14、IPG 胶条，然后再以高电压聚焦。样品中的盐分会影响聚焦过程，当样品中含盐量过高时，电压无法达到规定数值，聚焦无法完成；盐分含量较高时，建议选择慢速升压；当样品中的盐分含量一般时，可选用线性升压；样品中含盐量较少时，可选用快速升压，节省聚焦时间。等电聚焦完成后的胶条若不能及时进行第二向电泳，胶条可于-20保存。（三）胶条的平衡平衡的目的是还原蛋白质的二硫键，使蛋白质充分去折叠，易于与 SDS 充分作用而变性，进而可以根据分子量的大小进行第二向迁移。SDS 是一种阴离子去污剂，可以与蛋白定量结合，此时蛋白质所带负电荷过量，而且与蛋白质相对分子质量成正比关系。一般的步骤是先在第一步平衡缓冲液（含
15、DTT）中平衡 10-15 分钟，再在第二步平衡缓冲液（含碘乙酰胺）中平衡 10-15 分钟。DTT 用于还原蛋白质的二硫键，使蛋白质去折叠，碘乙酰胺是为了去除多余的DTT。平衡缓冲液都要现配，因为 DTT 和碘乙酰胺在室温的半衰期很短。平衡过程将导致蛋白丢失 5%-25%，还会使分辨率降低，平衡超过 30 分钟后，蛋白质变宽，所以平衡时间不能过长。但是如果不经平衡，高分子量蛋白没有充分去折叠，会在第二向凝胶上产生纹理现象，并且等电聚焦凝胶会粘在 SDS 胶上。缩短平衡时间可以减少扩散，但是同时减少第二向的转移。所以平衡时间要严格控制，充分但不能过量。平衡后的等电聚焦固相 IPG 胶条与 SD
16、S 聚丙烯酰胺凝胶的良好接触也是影响双向电泳结果的一个重要因素。IPG 胶条商品化后，只需将胶条置于 SDS 胶上，用 1%的低熔点琼脂糖封胶，避免产生气泡即可。（四）十二烷基磺酸钠-多聚丙烯酰胺凝胶电泳（SDS-PAGE）SDS-PAGE 是根据蛋白的分子量进行分离的。十二烷基磺酸钠（SDS）是阴离子去污剂，与蛋白质结合后使之形成了一种项链状结构，即由柔性短肽连接并由蛋白质修饰的微粒结构。在这种 SDS-蛋白质复合物中以 1.4SDS/1g 蛋白质的比例融入了大量的 SDS。SDS 掩盖了蛋白质的电荷而形成了阴离子复合物，单位质量复合物所带的净电荷大致相等。通常在蛋白质样品中加入 DTT 等
17、还原剂用来切割半胱氨酸间的二硫键，之前的平衡过程也是这一目的。所有的蛋白质，包括等电点偏碱性的蛋白质（SDS 所带电荷远远超过蛋白自身电荷，消除了不同分子间原有的电荷差异，主要取决于蛋白质或亚基的大小） ，都会向电场的阳极方向移动。经 SDS 和 DTT 处理过的蛋白质的迁移率主要取决于蛋白质自身的分子量。在多聚丙烯酰胺百分比一定的情况下，蛋白质分子量的对数值与一定分子量范围内的 SDS-多肽复合物移动的距离基本成直线关系。将已知分子量的标准品与样品一起进行电泳迁移，则可估计出样品蛋白质的分子量。（五）凝胶的染色双向电泳分离结束后的蛋白质经显色后才能被鉴定。常用的非放射性染色方法中最敏感的为银
18、染法，其灵敏度可达到 1ng 甚至更低；其次是荧光染色以及铜染、锌染、考马斯亮蓝染色等，其中考马斯亮蓝的灵敏度为 50-100ng。虽然银染色的灵敏度很高，但是银染凝胶后的质谱鉴定较难，附着在凝胶基质上的肽片断胶内提取效率较低。因此很多实验室运用银染法寻找差异蛋白点，然后加大上样量，进行考马斯亮蓝染色，结合胶内切酶提取蛋白质，最后鉴定。放射性核素标记法显示蛋白质的灵敏度也非常高，放射性核素的渗入是以细胞代谢为基础的，不同蛋白质渗入放射性核素的量不同，有时很难反映各种蛋白质的实际丰度，而且实际操作带有一定风险，应用范围有限。（六）图像分析双向电泳最终可获得有数前个蛋白质点的复杂图谱，然后要分析每
19、一块胶的总蛋白点数，凝胶之间的重现性，蛋白点的缺失和出现，胶之间蛋白表达量的变化信息。面对这些海量数据信息，光凭肉眼的分辨能力完成是不现实的，这些工作多半依赖于图形图像分析软件。一般来说，图像分析可以分为以下几个步骤：图像采集、图像加工、点的检测和定量、凝胶匹配、数据分析和解释、构建数据库。图像采集是通过相机或扫描仪将凝胶图像转换为数字图像；图像加工一般是指去除非蛋白质点的杂质和凝胶背景，数字图像上的点是否是蛋白质需要人工来判断。点的检测盒定量采用的算法通常是高斯拟合或拉普拉斯算子高斯拟合。目前应用较广泛的图像分析软件有 PDQuest，ImageMaster2D Elite、Melanie 等，分辨率高，功能齐全。尽管如此，仍然有部分未检出点和假点，需要手工添加和删除。
