1、36 2 2008 M4 5.5 mg# L- 1;水温:(25.5? 0.2) e ;总硬度:200 250 mg# L- 1(以CaCO3计).1. 1.3 !AHANK. S溶液配方: Stock1: NaCl 8. 0 g, KCl0. 4 g加蒸馏水至100 mL; Stock2: KH2PO4 0.06 g,#137#第2期周 炳,等:4种农药对斑马鱼胚胎的毒理研究Na2HPO4 0. 358 g加蒸馏水至100 mL; Stock3:CaCl20. 72 g加蒸馏水至50 mL; Stock4: MgSO41.23 g加蒸馏水至50 mL, Hank. s(Final)100 m
2、L.Stock1+ 1 mL, Stock2+ 1 mL, Stock3+ 1 mL,stock4+ 1 mL加蒸馏水定容至1 000 mL即得10%Hank. s溶液.1. 2 LZE1.2. 1 L斑马鱼,试验前在养鱼室26 e条件下驯养2周以上,自然死亡率 1%,试验鱼平均体长4. 0 cm,早晚各投喂1次,进食30 min后吸除残饵和粪便,试验开始前24 h停止喂食.选体形正常、体色发亮、鱼鳞和鱼鳍无破损,游动灵活,捕食敏捷,无任何鱼病和异常行为,且体长4 5 cm的斑马鱼.根据Schulte等6的方法收集受精卵,用重组水迅速清洗鱼卵以除去残留物,用于毒性试验.1.2. 2 LZE(
3、OECDZ)在缸内放置曝气水约2/3处,然后放入纱网,避免成鱼吞食鱼卵;配对,将亲鱼按雌雄比为1B2(4雌8雄),放入经过曝气水温保持(26. 0? 1) e ,暗箱放置4 h左右;产卵后1 h内,用吸管将卵取出收集,同时去除非受精卵;染毒方式,可对胚胎进行静态染毒,选用24孔细胞培养板进行实验,将每个受精卵独立的放置在不同的孔中,5个实验浓度加上1个空白对照是满足统计要求的最少浓度梯度,开始染毒时,将鱼卵小心地转移到实验溶液中去,取每个浓度20枚卵把它们放入同浓度的多孔板中,每个多孔板为1个浓度,其中20个孔为受试物溶液.另外4个为空白样.每孔各方一枚卵和2 mL受试物溶液;实验浓度,本实验
4、采用浓度为10- 6 10- 3 mol/ L取一定量已知浓度的戊唑醇、烯唑醇、异丙甲草胺、阿特拉津加入装有50 mLHank. s溶液中,配成相应的浓度的受试物溶液;每隔12 h在显微镜下进行观察至72 h,并记录现象7.1. 3 d9s数据以孵化率、相对成活率、畸形类型率表示.(1)斑马鱼胚胎孵化率=孵化的斑马鱼胚胎数量/总的斑马鱼胚胎数量100%(2)相对成活率=成活的斑马鱼胚胎数量/阴性对照成活斑马鱼胚胎数量100%(3)畸形类型率=某种畸形斑马鱼胚胎的数量/总的发生畸形的斑马鱼胚胎100%所有实验均用不同批次的斑马鱼重复3次,将3次的实验结果进行ANOVA统计分析,表示为平均值? S
5、D,与相应的对照组相比, P 0.05为有显著差异.2 LT2. 1 410- 3 mol/L戊唑醇、烯唑醇、异丙甲草胺、阿特拉津处理的斑马鱼胚胎,在发育的不同时期形态学显微观察结果如下:从图片可以看出,在48 h阴性对照中的斑马鱼胚胎已经孵化成鱼,而四种药物处理的斑马鱼胚胎还未孵化,到72 h段,四种农药处理的斑马鱼胚胎都已经孵化成鱼,但都明显发生脊柱畸形的现象,其余我们在图片中还发现眼点收缩,心包囊水肿,无黑色素等现象(图5),以下各项指标的检测均选择10- 3 mol/L为测试浓度.m5 4 j0) HW ? f Fig. 5 Morphological development offo
6、ur pesticides on thegrowth of zebrafish embryo at different phases2. 2 12 h s x q实验结果显示:在10- 3 mol/ L的浓度下,经阿特拉津、异丙甲草胺处理的斑马鱼胚胎孵化率100%,经烯唑醇处理的斑马鱼胚胎孵化率90%,经戊唑醇处理的斑马鱼胚胎孵化率85%(图6).根据实验要求,这些发白的受精卵需用发育正常的受精卵替换.2. 3 HW q10- 3 mol/L的戊唑醇、烯唑醇、异丙甲草胺、阿特拉津处理斑马鱼胚胎,莱卡倒置显微镜观察胚胎#138#浙江工业大学学报第36卷m6 j0) 12 hpf s x qFig
7、.6 Percentageof hatching of fertilized egg of zebrafish at12h affected by four pesticides成活率.在实验开始12 36 h戊唑醇剂量组的斑马鱼死亡率差别不大,表明斑马鱼胚胎发育初期对戊唑醇的影响并不敏感,但烯唑醇、异丙甲草胺、阿特拉津剂量组有一定的差别,表明斑马鱼胚胎发育初期对上述3种农药反应较敏感.同时可以看出在12 h,24 h段异丙甲草胺、阿特拉津暴露下斑马鱼胚胎发育的成活率较戊唑醇、烯唑醇要来的高,72 h结束,斑马鱼胚胎的相对成活率保持在一个水平上(图7).m7 j0) HW qFig.7 Liv
8、ability of zebrafish embryo at different phases af2fected by four pesticides2. 4 j0) 我们以10- 3 mol/L戊唑醇、烯唑醇、异丙甲草胺、阿特拉津处理72 h的斑马鱼胚胎为实验统计,结果显示:戊唑醇造成的胚胎发育畸形中比率最高是心包囊肿,其次是脊柱弯曲;烯唑醇造成的胚胎发育畸形中比率最高是心包囊肿和脊柱弯曲;异丙甲草胺造成的胚胎发育畸形中比率最高的是脊柱弯曲,其次是心胞囊肿;阿特拉津造成的胚胎发育畸形中比率最高的是脊柱弯曲,其次是心包囊肿.比较四种农药暴露情况,结果显示:戊唑醇处理的胚胎心包囊肿率最高,其次
9、是烯唑醇;阿特拉津处理的胚胎脊柱弯曲率最高,其次是异丙甲草胺;烯唑醇处理的其它畸形率最高(图8).m8 j0) f Fig.8 Abnormality on zebrafish embryo affected by fourpesticides3 ) 近几年,斑马鱼胚胎实验在生物毒性研究中起到了主导作用.因为它们的卵透明,并且一些致死性和非致死性的终点不仅可以通过平行实验观察到,而且它还能提供潜伏的生物标记来评估农药对它们的更深一步的破坏,从而提高了实验的敏感度.实验从受精后12 h染毒至72 h结束,戊唑醇、烯唑醇、异丙甲草胺、阿特拉津四种农药对于斑马鱼胚胎的发育有一定的影响,主要表现为致死
10、和致畸两个效应,整体水平看致死效应不是十分显著,主要在高浓度时造成胚胎发育的终止,而致畸效应相对明显. 10- 3 mol/ L的阿特拉津、异丙甲草胺、烯唑醇、戊唑醇处理斑马鱼胚胎,在12 h段时观察受精卵孵化率,发现由于烯唑醇、戊唑醇暴露,出现肉眼观察受精卵发白,莱卡显微镜观察发黑的现象,同时观察各群的发育及存活率,胚胎-幼体期的斑马鱼死亡率随着实验时间的增加而逐步增加,呈现一定的时间依赖性.除了对斑马鱼胚胎发育有一定的致死效应外,戊唑醇、烯唑醇、异丙甲草胺、阿特拉津对斑马鱼胚胎发育有一定的致畸作用,本实验观察了染毒群,空白群12 72 h间的发育毒性,染毒群的幼鱼或胚胎出现了脊柱畸形,心包
11、囊水肿和其他形态的畸形包括原肠胚终止,无黑色素,无心跳,血流减慢、停滞、体节紊乱等畸形,主要的畸形类型表现为心包囊肿和脊柱弯曲,在胚胎染毒期间,各空白对照组,低剂量组的斑马鱼胚胎-幼体未见明显的异常症状,而高剂量组有明显的中毒症状,表现为在胚胎时期受精卵凝结,在孵化后斑马鱼脊柱弯曲,和眼#139#第2期周 炳,等:4种农药对斑马鱼胚胎的毒理研究点收缩,心包囊水肿,不能自由在水中游动等.4 (1)高浓度的4种农药对斑马鱼受精卵的孵育率有一定的影响,以戊唑醇最为明显.(2)中、高浓度的戊唑醇、烯唑醇和高浓度的异丙甲草胺、阿特拉津对斑马鱼胚胎发育有一定的致死和致畸效应.(3)不同的农药造成的斑马鱼胚
12、胎发育畸形的类型主要包括心包囊肿和脊柱弯曲.(4)以上实验说明这4种农药在低浓度时对斑马鱼胚胎发育的影响不是十分显著,但是高浓度时可以显著影响斑马鱼的胚胎发育. ID: 1 KARAKOTOV S D, ZHELTOVA E V, PUTSYKIN Y G, etal. Novel formulation for enhancing efficiency of tebuconazoleJ. Commun Agric Appl BiolSci, 2006, 71:23230.2 AMER M M, SHEHATA M A, LOTFY H M, et al. Deter2mination of
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