1、食品质量安全检测新技术,讲课教师： 谢远红,课程主要内容,一.现阶段存在的食品质量安全问题二.食品质量安全问题中检测技术,一. 现阶段存在的食品质量安全问题,1. 转基因食品的安全性 2. 食源微生物的安全性 3. 生物毒素的安全性 4. 食品原料中农药、兽药残留的安全性 5. 抗生素、激素与有害物质残留,转基因食品的安全性,转基因食品的概念“转基因” 是指利用分子生物学手段将外源性基因转移到某种特定生物体中，使其生物性状或机能发生部分改变。转基因食品（genetically modified foods, GM食品）：就是以转基因生物体直接作为食品或以其为原料加工生产的食品 。,转基因食品的
2、发展史 转基因食品的发展历史实际上就是基因工程、转基因技术等生物技术的发展史。 1982年，将大鼠生长激素重组基因导入小鼠受精原核内，获得了人类历史上第一个转基因动物转基因“超级鼠”，比一般的小白鼠大一倍。 1983年，世界上第一例转基因植物（一种含有抗生素药类抗体的烟草）在美国成功培植。 1994年，孟山都(Monsanto)公司下属Calgene公司研制的延熟保鲜转基因番茄在美国批准上市，这是发达国家批准商业化的第一个转基因作物。,转基因棉花,中国的转基因羊,日本研发的转基因大豆,各种各样的转基因水果,浙江省种植的转基因油菜,自1996年，转基因农作物获得批准进入田间试验以来，全球转基因作
3、物研发和产业迅猛发展，创造了巨大的经济、社会和生态效应。从此，世界上陆续有国家批准转基因作物的种植，转基因作物的种植面积、种类以及商业效应更是逐年攀升，这就是转基因作物的商业化种植。自1996年转基因作物首次商业化以来，转基因作物面积累计达到近10亿公顷，增长了80倍。,转基因农作物的种植是现代农业发展的重要手段和重要领域。2010年国际农业生物技术应用组织服务（ISAAA）在北京发表2009年度全球生物技术/转基因作物商业化发展态势报告，认为全球第二轮生物技术发展浪潮已经开始。ISAAA报告认为，去年全球生物技术发展一个最显著的进步是中国一项里程式的决策转基因抗虫水稻和植酸玉米获得生物安全发
4、展证书。水稻和玉米分别是世界上最重要的粮食作物和饲料作物，因此，对二者的生物安全的认证对未来转基因作物在中国、亚洲乃至全世界的推广有巨大的影响。,ISAAA报告显示，去年25个国家的1400万农民种植了1.34亿公顷转基因作物，面积较上一年增长了7%，其中90%来自发展中国家的小型农户。性状面积或“实际面积”达到1.8亿公顷，比2008年增长了1400万公顷。 美国（6400万公顷）、巴西（2140万公顷）、阿根廷（2130万公顷）分列转基因作物种植面积的前三位，中国（370万公顷）列第六位。,截止2008年底，我国已经批准22 种国外转基因作物进口许可证，分别是转基因大豆GTS-40-3-2
5、，转基因玉米（Mon810，Bt11，Bt176，Mon863，NK603，GA21，T25，MON59122，TC1507，MON88017），转基因油菜（Ms1Rf1、Ms1Rf2、Ms8Rf3、GT73、T45、Oxy235、Tapos19/12）和转基因棉花（Mon531、Mon1445、Mon15985、Mon88913）。,20012008 年，中国进口转基因大豆累计超过2 亿吨。在中国市场上70%的大豆制品中含有转基因成分，像大豆油、色拉油、磷脂、酱油、膨化食品等等，进入中国消费者的生活转基因食品主要是使用转基因大豆加工的食用油和豆制品。另外在市场上发现转基因米粉、饼干、咖啡等，
6、中国正在接受更多的国外转基因食品。,羞羞答答的转基因大豆油,转基因植物的构建策略,作物转入的外源基因的类型及方法 类型：转基因作物涉及的遗传改良性状主要包括：抗除草剂基因占总面积的71%，抗虫基因占28%，抗病毒基因占1%。 方法：农杆菌介导法：农杆菌中有一种致瘤的环型DNA，称为Ti质粒。被农杆菌感染的植物之所以长瘤正是由于TDNA插入了植物染色体。从此，人们便利用这种天然的转化体系向植物转基因。基因枪：把所要转入的基因包被在金粉或钨粉上之后，利用基因枪将其打入培养细胞中来完成转基因过程。,转基因大豆 转基因大豆的研究主要以耐除草剂和改善大豆品质为主： 耐除草剂：在美国有3个转基因大豆品种已
7、应用，最多的是对除草剂草丁膦和草甘膦具有耐性的个品种。2002年种植面积占美国大豆的74%。可见，目前美国的大豆生产已经基本上普及了耐除草剂的转基因品种。 改善大豆成分：Mazur等(1999) 获得了种子油酸相对含量高达85%的大豆新品系，而且农艺性状优良。,转基因玉米 转基因玉米的研究主要集中于提高抗虫性和耐除草剂方面。 在美国，转基因玉米的种植面积占玉米总种植面积的比例在35%左右。 其中抗虫Bt玉米的种植面积发展最快，所占近比例最大，2002年约占玉米种植总面积的24；耐除草剂玉米占7 10之间；兼具抗虫和耐除草剂特性的转基因玉米品种种植规模仍然不大，近年来仅占玉米种植总面积的1 -2
8、。,转基因水稻 转基因水稻的研究主要集中在以下三个方面： 提高光合效率：将C4作物玉米的PEPC基因导入水稻的基因组，从而改良了水稻的光合作用效率。 提高营养品质：Ye等（2000）成功地将来自其他物种的psy、cntl和lcy基因整合到水稻基因组中，解决了水稻胚乳不能合成维生素A的难题。 增加抗逆性：纽约康乃尔大学的加戈等将大肠杆菌中两种负责合成海藻糖的基因导入到籼稻中。转基因水稻在恶劣环境条件下的生存能力比普通水稻更强。,到底我国目前有多少转基因食品？已经超过2000万吨。 目前我国极少生产粮食、油料作物等转基因食品，只有一些转基因抗虫棉，但并不进入人的食物链。我国的转基因食品基本上都是进
9、口的。 排在前三位的是：大豆、玉米、油菜。我国去年进口大豆3500万吨。目前我国进口大豆主要用做加工原料，生产豆油、豆腐、豆奶等制品。,转基因食品的主要功能,1.改善食品品质和加工特性 2.提高农作物的抗病虫害性能 3.提高果蔬产品的耐储存性和保鲜期 4.改善发酵食品品质和风味 5.改良动物性食品品质,转基因作物的利与弊,转基因作物的带来的效益 ISAAA报告认为，转基因作物已经在以下几个重要方面做出了贡献： （1）保证粮食安全，保证粮食价格的稳定，解决发展中国家人民的饥饿问题。世界人口数量，特别在发展中国家，还在持续增长，它带来的粮食短缺问题，也就成为了一个全世界关注的重要问题。因此，通过基
10、因工程技术，特别是转基因技术，以获得高产的优良农作物品种，可能将是解决21世纪不断增加人口对粮食需求的重要途径之一。,（2）创造了明显的可观的经济效益。转基因农作物的发展能够带来明显的经济效益，如加拿大，在1996年种植了1200万hm 耐除草剂油菜后，产量提高9 ，经济效益达600万美元；中国种植转基因抗虫棉花，从19972000年的4年，总的经济效益达337亿美元。在2000年世界转基因作物产品的价值为3O亿美元，预计2010年时价值可达800亿美元。由此可见，经济效益是十分明显的。,转基因食品的安全性,1.未进行较长时间的安全性试验：基因化食品改变了我们所食用食品的自然属性，它所使用的生
11、物物质不是人类食品安全提供的部份，未进行长时间的安全试验，无法确定这类食品是否安全。英国一位科学家在著名医学杂志柳叶刀上发表论文，宣称实验用的大鼠在食用转基因马铃薯以后，肝脏受到损伤，免疫系统受到削弱，由此掀起了国际社会对转基因食品安全性广泛争论的序幕。,对人类健康产生的安全性问题,2 产生毒素：基因化食品能产生不可预见的生物突变，会在食品中产生较高水平和新的毒素。Losey,J.E.等（1999）报道，在一种植物马利筋叶片上撒有转基因Bt玉米花粉后，普累克西普斑蝶食用叶片就少，长得慢，4天的幼虫的死亡率44%。而对照组（饲喂不撒Bt玉米花粉的叶片）无一死亡。转基因作物产生的杀虫毒素可由根部渗
12、入周围，但尚不清楚会产生何种影响，是否会对人类的健康产生影响同样未知。,3 过敏或变态反应：基因技术会在食品中产生不能预见的和未知的变态反应原。据报告，对巴西坚果产生过敏的主体也会对用该坚果基因工程化而得到的大豆产生过敏。科学家把巴西胡桃的特性移植到黄豆上去，结果却使一些对胡桃过敏的人在摄取黄豆时有过敏的可能。植物凝血素（Lectin）对有些害虫来说是有毒的，转基因食品不得含有此类有毒物质。,4 减少食品的营养价值或降解食品中重要的成份：基因化的目的是去除或灭活人们认为不需要的物质，这些物质可能是未知的。美国的研究资料表明，在具有抗除草剂基因的大豆中，异黄酮类激素等防癌的成份减少了。具有芳香、
13、有光泽的红色蕃茄能贮藏几周，但营养价值较低。消费者在购买水果或蔬菜时，仅依靠外观和质地，因此，不能准确判定该产品的真实质量。,5 产生抗菌素耐药性细菌：基因技术采用耐抗菌素（如抗卡那霉素、氨苄青霉素、新霉素、链霉素等）基因来标识转基因化的农作物，这就意味着农作物带有耐抗菌素的基因。荷兰科学家发表在新科学家杂志的试验结果称，设计一人造胃，对人消化转基因食物的过程进行模拟，发现DNA滞留在肠内，同时一些转基因细菌能够把自己的抗生素抗性基因转移给人造胃的细菌。,6. 副作用能对人体产生危害：Mayeno,A.N.等（1994）报告，发生一种新的，不明原因的病症，主要表现为嗜酸性肌痛。临床表现有麻痹、
14、神经问题、痛性肿胀、皮肤发痒、心脏出现问题，记忆缺乏、头痛、光敏、消瘦（Brenneman,D.E.等，1993；Love,L.A.等，1993）。后查明系日本一公司生的基因化工程细菌产生的色氨酸所致。食用者在3个月后发病，导致37人死亡，1500人体部份麻痹，5000多人发生偶尔性无力。据测定，含量为0.1%便可杀死人体。,1 除草剂使用的增加：科学家估计，基因化的农作物对除草剂具有抵抗力，实际应药量高于正常的3倍。农民知道其作物对除草剂有抵抗力，会大量使用除草剂。 2 杀虫剂使用的增加：农作物常使用自己特有的杀虫剂，基因化的农作物对杀虫剂有抵抗力，这就意味着比以前有更多的杀虫剂进入我们的食
15、品和田野。有报导，将优良的特定的基因（如抗杀虫剂）植入作物，可能会使周围野生植物一并获得改良，呈现出抗杀虫剂的特征。,对环境产生的安全性问题,3 基因污染：转基因作物通过基因流可使野生近缘种变为杂草，成为“超级杂草”。有资料证明，把转基因油菜释放后，当大田的油菜附近有近缘杂草时，在萌发的后代种子中有93%被证实是种间杂草。,4 对非目标生物有伤害，对生物多样性形成威胁：Birch,A.等（1996/7）的实验结果表明，用转基因马铃薯饲喂蚜虫，雌虫的产卵量减少1/3，用喂转基因马铃薯长大的雄蚜虫与对照组蚜虫交配，所得的未受精卵数量多4倍，已受精卵在未孵化前比对照组死亡率高近3倍，以转基因马铃薯蚜
16、虫为食物的雌飘虫的存活时间比对照组少一半，如果大规模的种植转基因作物，可能会减少有益昆虫的种群。,转基因食品的检测技术,转基因植物产品的安全性评估极为重要，但可能更为受到人们关注的是转基因产品的检测技术。目前要测试植物产品是否含有基因改造成分，或植物产品是否经过基因改造，主要有两种方法： 1 检测是否有外来基因或DNA； 2 检测是否有外源的蛋白质。,制订了12项转基因产品检测行业标准和7项国家标准；研制并生产了10种转基因产品检测试剂产品；建立了转基因产品检测信息库和一个转基因产品信息网站。 大豆中转基因成份定性PCR检测方法 玉米中转基因成份定性PCR检测方法 油菜籽中转基因成份定性PCR
17、检测方法 烟草中转基因成份定性PCR检测方法 植物性饲料中转基因成份定性PCR检测方法 马铃薯中转基因成份定性PCR检测方法 棉花中转基因成份定性PCR检测方法,食源微生物的安全性,时间 微生物名称 食品源 感染人数 国家 1984 鼠伤寒沙门氏菌 沙拉酱 美国 1985 鼠伤寒沙门氏菌 巴氏消毒奶 170 000 美国 1989 金黄色葡萄球菌 蘑菇罐头 美国 1991 甲肝病毒 毛蚶 300 000 中国 1994 肠炎沙门氏菌 巴氏消毒液态冰激凌 224 000 美国 1996 大肠杆菌 O157:H7 萝卜 8 000 日本 1997 肠炎沙门氏菌 蛋和肉制品 2013 比利时 200
18、0 金黄色葡萄球菌 雪印牛奶 日本 2001 单增李斯特菌 法国,世界上食源微生物感染群发事件,根据WHO估计：,发达国家食源性疾病的漏报率在90%以上,发展中国家食源性疾病的漏报率95%以上,“冰山一角”,沙门氏菌（禽、畜肉） 副溶血性弧菌（水产品） 蜡样芽孢杆菌和金黄色葡萄球菌（剩饭） 肉毒梭菌（发酵制品、肉制品） 单核细胞增生李斯特菌（乳制品、冷藏食品） 大肠杆菌O157:H7（肉制品）等。,微生物性食物中毒常见的致病菌和食物：,方法修订征求意见文本,GB4789.2 菌落总数测定 GB4789.3.1 大肠菌群测定 GB4789.3.2 粪大肠菌群测定 GB4789.3.4 大肠杆菌检
19、验 GB4789.10.1 金黄色葡萄球菌定性检验 GB4789.10.2 金黄色葡萄球菌定量检验,生物毒素的安全性,也称作真菌毒素（Mycotoxins）,Mykes: Greek for fungus/mold 希腊语“霉菌” Toxicum: Latin for poison/toxin 拉丁文 “毒素”,真菌毒素（Mycotoxin），有时也俗称霉菌毒素，是某些真菌产生的代谢产物，目前已发现的真菌毒素有十多种，它们包括黄曲霉毒素、赭曲霉毒素、伏马霉素、脱氧雪腐镰刀菌烯酮（也称为呕吐毒素）、玉米赤霉烯酮、T-2毒素、麦角碱、杂色曲霉素、黄米毒素、岛青霉毒素、展青霉毒素（棒曲霉毒素）、橘青
20、霉素、皱褶青霉素、黄绿青霉素、红矢精、黄绿素、圆弧青霉偶氮酸和F-2毒素等。,能够产生真菌毒素的霉菌,1）曲霉属（Aspergillus Link）：黄曲霉（A. flavus）、寄生曲霉（A. parasiticus）、赭曲霉（A. ochraceus）、杂色曲霉（A. flavus）、烟曲霉（A. flumigatus）、构巢曲霉（A. nidulans）和棒曲霉（A. clavus）等。 2）青霉属（Penicillium Link ex Fr）：岛青霉（P. islandicum）、橘青霉（P. citrinum）、红色青霉（P. rubrum）、展青霉（P. patulum）和黄绿青
21、霉（P. citreo-vinide）等。 3）镰刀菌属（Fusarium Link ex Fr）：禾谷镰刀菌（F. graminearun）、串珠镰刀菌（F. moniliforme）、木贼镰刀菌（F. equiseti）、茄病镰刀菌（F. solani）、三线镰刀菌（F. tritinctum）和镳草镰刀菌（F. sporotrichioides）等。,玉米上的曲霉属（Aspergillus),玉米上的镰刀菌属 （Fusarium),玉米上的赤霉素 （Gibberella),Aflatoxin 黄曲霉毒素,Produced by Aspergillus flavus and A. para
22、siticus 由黄曲霉和寄生曲霉产生 Five key aflatoxins (五种黄曲霉毒素): B1, B2, G1, G2 and M1 Found in corn, grains, cottonseed, peanuts, tree nuts, spices, milk 玉米、谷物、棉籽、花生、坚果、调味品、牛奶中均已发现 Liver damage 对肝有损害 IARC- class 1 human carcinogen 国际肿瘤研究机构定为一级致癌物,黄曲霉毒素的化学性质,黄曲霉毒素的基本结构为二呋喃环和香豆素，在紫外线下，黄曲霉毒素B1、B2发兰色荧光，黄曲霉毒素G1、G2发绿色
23、荧光。黄曲霉毒素M1是黄曲霉毒素B1在体内经过羟化而衍生成的代谢产物。黄曲霉毒素的分子量为312-346。难溶于水，易溶于油、甲醇、丙酮和氯仿等有机溶剂，但不溶于石油醚、己烷和乙醚中。一般在中性及酸性溶液中较稳定，但在强酸性溶液中稍有分解，在pH 9-10的强碱溶液中分解迅速。其纯品为无色结晶，耐高温，黄曲霉毒素B1的分解温度为268 oC，紫外线对低浓度黄曲霉毒素有一定的破坏性。,黄曲霉毒素在各国商品中的存在情况 (1),黄曲霉毒素在各国商品中的存在情况 (2),Aspergillus flavus黄曲霉,五颗表面消毒的花生置于营养培养基中，其中两颗有长出黄曲霉（黄绿色霉菌）,黄曲霉毒素的毒
24、害作用,黄曲霉毒素对天竺鼠肝脏的影响，从上排的最左边到下排的最右边，同一时间内摄入的黄曲霉毒素量逐步增加。请注意：摄入的黄曲霉毒素量越大，天竺鼠肝脏越苍白。,黄曲霉毒素的毒性,1.一级致癌物质。 2.是氰化钾的10-20倍。 3.是砒霜的68倍 。 4.是农药1605、1059的28-33倍。 5. 是3，4-苯并芘的4000倍。 6.是二甲基亚硝胺的75倍。,黄曲霉毒素引起的家禽和家畜中毒症（一）,黄曲霉毒素引起的家禽和家畜中毒症（二）,Ochratoxin赭曲霉毒素,Produced by Aspergillus ochraceus and Penicillium viridicatum
25、由赭色曲霉菌和青霉菌产生 Found in cereal grains, coffee, pig products, dried vine fruit, wine可在谷物、咖啡、猪肉产品、葡萄干和酒中发现 Nephrotoxin (kidney toxin)肾毒素 Linked to Balkan endemic nephropathy与巴尔干肾病有关 IARCpossible human carcinogen 国际肿瘤研究机构认定为2B类致癌物,赭曲霉毒素的化学性质,包括7种结构类似的化合物。其中赭曲霉毒素A(R1=C1，R2=H)毒性最大，在霉变谷物、饲料等最常见。 赭曲霉毒素A是一种无色
26、结晶化合物。可溶于极性有机溶剂和稀碳酸氢钠溶液。微溶于水。其苯溶剂化物熔点9496，二甲苯中结晶熔点169。有很高的化学稳定性和热稳定性。赭曲霉毒素A是由多种生长在粮食（小麦、玉米、大麦、燕麦、黑麦、大米和黍类等）、花生、蔬菜（豆类）等农作物上的曲霉和青霉产生的。动物摄入了霉变的饲料后，这种毒素也可能出现在猪和母鸡等的肉中。赭曲霉毒素主要侵害动物肝脏与肾脏。这种毒素主要是引起肾脏损伤，大量的毒素也可能引起动物的肠黏膜炎症和坏死。还在动物试验中观察到它的致畸作用。,赭曲毒素A在各种商品中的存在情况（1）,赭曲毒素A在各种商品中的存在情况（2）,二.食品质量安全问题中检测技术,分子生物学检测技术基
27、因检测免疫学检测 化学检测技术,基因检测技术： 1. PCR法 2. 分子杂交法 3. 基因芯片法,PCR法,PCR的概念 PCR技术的创建 PCR的原理 PCR的反应体系和方法 PCR的类型和应用,多聚酶链式反应 （PCR：Polymerase Chain Reaction),Polymerase: DNA聚合酶,PCR技术的创建,Kary B. Mullis（穆利斯（美）,Khorana(1971)等提出在体外经DNA变性,与适当引物杂交,再用DNA聚合酶延伸,克隆DNA的设想。 1983年,Mullis发明了PCR技术,使Khorana的设想得到实现。1988年Saiki等将耐热DNA聚
28、合酶（Taq）引入了PCR技术 1989年美国Science杂志列PCR 为十余项重大科学发明之首,比喻1989年为PCR爆炸年,Mullis荣获1993年度诺贝尔化学奖。,生物样品,DNA片段,基因诊断,基因治疗,基因工程产品,法医学检测,人类学研究,PCR技术诞生所依赖的社会需求和研究需要,引物,引物,Mullis的构思,DNA聚合酶,DNA聚合酶,1983年,94变性,50-65退火,XX延伸,Taq DNA聚合酶（thermus aquaticus),酶活性(%),温度(),40 50 60 70 80 90 100,10080604020,1988年Saiki等将耐热DNA聚合酶（T
29、aq）引入了PCR技术,72,94,55,PCR循环,PCR技术的原理,1 PCR技术的基本原理,无细胞分子克隆法：在微量离心管中,加入适量的缓冲液, 微量的模板DNA,四种脱氧单核苷酸,耐热性多聚酶, 一对合成DNA的引物,通过高温变性、低温退火和中温延伸三个阶段为一个循环,每一次循环使特异区段的基因拷贝数放大一倍,一般样品是经过30次循环,最终使基因放大了数百万倍; 扩增了特异区段的DNA带。,DNA的变性和复性,加热或强酸、碱性作用可以使 DNA双螺旋的氢键断裂,双链解离,形成单链DNA,这称为 DNA的变性。 解除变性的条件后, 变性的单链可以重新结合起来,形成双链,其原有的特性和活性
30、可以恢复,这称DNA复性, 也叫退火。,PCR扩增原理,引物,延伸,延伸,5,5,3,3,变性、退火,变性、退火,2 PCR技术的特点,1 ）高度的灵敏性,30轮循环,扩增量达230个拷贝,PCR产物每轮循环增加一倍,2 ）特异性,引物,引物,引物的序列及其与模板结合的特异性是决定PCR反应结果的关键。引物设计的最大原则是最大限度地提高扩增效率和特异性；同时尽可能减少非特异性扩增。,引物设计： （1)序列应位于高度保守区,与非扩增区无同源序列。 （2）引物长度以18-30 bp为宜。 （3）碱基尽可能随机分布,G+C占50-60%。 （4）引物内部避免形成二级结构。 （5）两引物间避免有互补序
31、列。 （6）引物3端为关键碱基；5端无严格限制。,3）操作简便易行,PCR扩增法,只需要数小时,就可以用电泳法检出1g基因组DNA中仅含数个拷贝的模板序列。通常的DNA 扩增法是分子克隆法, 首先要构建含有目的的基因的载体, 然后将它导入细胞后进行扩增,还要用同位索探针进行筛选;这种方法,要经过DNA内切、连接、转化和培养等相关的过程,操作复杂,一般需要数周时间。,4 ）用途广泛,生命学科 医学工程 遗传工程 疾病诊断 法医学 考古学,PCR的反应体系和方法,PCR管加热使模板变性, 退火使引物与模板DNA互补,延伸需将反应温度升至中温( 72),在Tap多聚酶的作用下,以dNTP为原料,以引
32、物为复制的起点,合成新链。如此重复改变反应温度,即高温变性、低温退火和中温延伸三个阶段为一个循环,每一次循环使特异区段的基因拷贝数放大一倍,一般样品是经过30次循环,最终使基因放大了数百万倍; 将扩增产物进行电泳,经溴化乙锭染色,在紫外灯照射下肉眼能见到扩增特异区段的DNA带。,总体积 50-100 lBuffer 缓冲液dNTP 原料Primer 引物DNA分子 模板 Taq酶 DNA聚合酶,1 反应体系,PCR技术的基本过程(1),模板DNA dNTP 引物 Buffer,预变性,模板DNA dNTP 引物 Buffer,TaqDNA聚合酶,94oC5,2 基本过程,PCR技术的基本过程(
33、2),Taq 酶 模板DNA dNTP 引物 Buffer,循环仪,94 55 72 ,Taq 酶 模板DNA dNTP 引物 Buffer,72 57 min,循环2535次,PCR技术的基本过程(3),1）PCR反应成分,（1）模板单、双链DNA均可。不能混有蛋白酶、核酸酶、DNA聚合酶抑制剂、DNA结合蛋白类。一般100ng DNA模板/100L。模板浓度过高会导致反应的非特异性增加。,3 PCR反应条件,（2）引物浓度0.1-0.5 mol/L浓度过高易导致模板与引物错配,反应特异性下降。 （3）Taq DNA聚合酶（thermus aquaticus)0.5-2.5 U/50 l酶量
34、增加使反应特异性下降;酶量过少影响反应产量。,（4）dNTPdNTP浓度取决于扩增片段的长度四种dNTP浓度应相等浓度过高易产生错误碱基的掺入,浓度过低则降低反应产量dNTP可与Mg2+结合,使游离的Mg2+浓度下降,影响DNA聚合酶的活性。,（5） Mg2+,Mg2+是DNA聚合酶的激活剂。 0.5mmol/L-2.5mmol/L反应体系。 Mg2+浓度过低会使Taq酶活性丧失、PCR产量下降； Mg2+过高影响反应特异性。 Mg2+可与负离子结合,所以反应体系中dNTP、EDTA等的浓度影响反应中游离的Mg2+浓度。,2）循环参数 变性 使双链DNA解链为单链94oC 20-30秒 (2)
35、 退火 温度由引物长度和GC含量决定。增加温度能减少引物与模板的非特异性结合;降低温度可增加反应的灵敏性。,（3）延伸70-75,一般为72延伸时间由扩增片段长度决定 （4）循环次数主要取决于模版DNA的浓度一般为25-35次次数过多：扩增效率降低错误掺入率增加,经典循环参数（500bp以内）,94 30s 55 45s 72 1min,94 5min,30次,72 7min,42 forever,1）不对称PCR目的：扩增产生特异长度的单链DNA。方法：采用两种不同浓度的引物。分别称为限制性引物和非限制性引物,其最佳比例一般是0.010.5M,关键是限制性引物的绝对量。 用途：制备核酸序列测
36、定的模板制备杂交探针基因组DNA结构功能的研究,PCR的类型,高浓度引物,低浓度引物,2)反向PCR (reverse PCR),是用反向的互补引物来扩增两引物以外的DNA片段对某个已知DNA片段两侧的未知序列进行扩增。可对未知序列扩增后进行分析,如探索邻接已知DNA片段的序列；用于仅知部分序列的全长cDNA的克隆,扩增基因文库的插入DNA；建立基因组步移文库。,已知序列,未知序列,未知序列,已知序列,未知序列,未知序列,限制酶,限制酶,连接酶,3）多重PCR（复合PCR）,用于检测特定基因序列的存在或缺失。,电泳,引物,1,2,3,4,1,2,3,4,4）LP-PCR（Labelled pr
37、imers),利用同位素、荧光素等对引物进行标记,用以直观地检测目的基因。特别适合大量临床标本的基因诊断可同时检测多种基因成分,病毒1 病毒2 病毒 3 病毒4,标记引物,观察,PCR产物,5）,逆转录酶,聚合酶,mRNA,cDNA,杂化双链,PCR扩增,基因,mRNA,蛋白质多肽链,6) 荧光定量 PCR（real-time PCR)通过荧光染料或荧光标记的特异性的探针,对PCR产物进行标 记跟踪,实时在线监控反应过程,结合相应的软件可以对结果进行分析,计算待测样品的初始模板量。荧光定量 PCR仪光定量PCR仪是一种带有激发光源和荧光信号检测系统的PCR仪,通常配有电脑系统及相应的分析软件。
38、,荧光定量实时PCR与普通PCR的比较 实时在线监控对样品扩增的整个过程进行实时监控,能够实时地观察到产物的增加,直观地看到反应的对数期 降低反应的非特异性使用引物和荧光探针同时与模板特异性结合,提高了PCR反应的特异性 增加定量的精确性全程监控,准确的算法进行定量 结果分析更加快捷方便,无需跑胶,全新4通道实时荧光定量PCR仪,普通梯度PCR仪,PCR技术的应用,1) 基因克隆,基因工程产品,5,5,Bam H I,Bam H I,Bam H I,Bam H I,限制性核酸内切酶,2)基因检测,A,内源性病变基因,正常人,A,病 人,A,正常人,病 人,正常,病人,3）基因鉴定,女性,男性,
39、Y引物,PCR,男性 女性,PCR技术在食品安全检测中的应用,方法步骤： 1、运用化学手段对DNA提取； 2、设计并合成引物； 3、进行PCR扩增； 4、克隆并筛选鉴定PCR产物； 5、DNA序列分析。,转基因食品的检测大豆中转基因成份定性PCR检测方法 玉米中转基因成份定性PCR检测方法 油菜籽中转基因成份定性PCR检测方法 烟草中转基因成份定性PCR检测方法 植物性饲料中转基因成份定性PCR检测方法 马铃薯中转基因成份定性PCR检测方法 棉花中转基因成份定性PCR检测方法,原理： 标记基因的PCR检测 1.报告基因 GUS 基因 荧光素酶(LUC)基因 胭脂碱合成酶(NOS)基因 GFP基
40、因 2. 抗性基因,PCR技术在微生物学中的应用一. 微生物检测 1.常规PCR检测在1992年Rahn 等利用沙门氏菌的invA基因设计了一对引物,第一次用PCR的方法对沙门氏菌进行了检测试验。共检测了630株沙门氏菌,约100多种血清型和21个菌属的142株非沙门氏菌。结果显示,有两株没有检测出,检出率为99.14%。,2.多重PCRCortez等（2006）用多重PCR检测了家鸡屠宰场不同来源样品中的鼠伤寒沙门氏菌、肠炎沙门氏菌和其他血清型的沙门氏菌。其使用了3对引物,分别来自沙门氏菌的invA, pefA和sefA 基因。在检测的288 份样品中,鼠伤寒沙门氏菌和肠炎沙门氏菌的检出率为
41、62%,其他血清型的沙门氏菌为10%。,3.巢式PCR巢式PCR ( nesting PCR)是指先后用两套引物进行扩增的PCR 技术,用内外两对引物先后扩增靶基因片段。通常是先用第一套引物扩增15 - 30个循环,再用已扩增的DNA片段内设定的第二套引物扩增15 - 30个循环。由于第二套引物设计片段位于第一套引物扩增的片段内,所以将第一套引物称为外引物,而把第二套引物叫做内引物。巢式PCR既可增加反应的物异性,又可得到丰产的特异性靶序列,增加敏感性。巢式PCR技术对微生物的检测和单拷贝基因靶DNA的扩增都是非常有效。,Hashimoto等（1995）基于编码Vi抗体的基因序列改进了巢式PC
42、R,所有的伤寒菌(包括丙型副伤寒)都能检出, 灵敏度可以达到单个细胞水平。Prakash（2005）的研究设计了肠沙门氏菌Typhi血清型菌株的H12d特异引物对进行巢式PCR,结果显示,该巢式PCR能够代替Widal测试方法诊断伤寒症。,4.荧光定量PCRNam等 10 建立和评价了SYBR Green 1 实时PCR特异检测沙门氏菌的方法。用大小为119 bp的invA 基因作为检测靶点,对124 株沙门氏菌和116株非沙门氏菌进行了检测。检测结果显示,所有的沙门氏菌有invA基因阳性条带,而非沙门氏菌均没有扩增条带。,5. 热起动PCR热起动PCR (Hot start PCR)指的是使
43、Taq DNA聚合酶只在样品温度超过至少70时才发挥作用的PCR。它是为提高反应的特异性设计的。如所周知道, Taq DNA聚合酶通常在比适宜温度低得多的条件下仍有较强的活性,会导致非靶序列的扩增,影响PCR反应的特异性。热起动可减少非靶序列的扩增,从而提高反应的特异性。Yang等（2006）设计了12对引物进行多重PCR,并使用了热启动酶,检测腊样芽孢杆菌毒素基因。该体系成功的检测出了与食物中毒及与食品相关的162株菌中潜在的毒素。,二.微生物分类鉴定在酿造工业中，对于保持发酵持久度的一致性和全体产品质量的一致性来说，从非酿酒酵母菌株中纯化酿酒酵母菌株是必要的。传统的基于形态、生理生化的检测
44、和分类鉴定方法常常比较耗时且结论也不确定和完全，特别是难于从表现型上区分Saccharomyces 属的S.cerevisiae，S.bayanus 和S.diastaticus，因为这些酿酒酵母它们属于同一个属。Yamagishi等应用标定FLO1 的开放阅读框架的PCR 法来区分酿酒酵母和非酿酒酵母，PCR 分子水平的显示结果表明了二者的不同,展望PCR 技术和以PCR 技术为基础的分子生物学技术给现代生物学的研究带来了革命性的变化，微生物学自然也不例外，它们给微生物学的研究开辟了一个新的天地，微生物由于个体微小和本身研究的特殊性，相对与其他学科来说更需要PCR 技术和以PCR 技术为基础
45、的分子生物学技术。相信随着科学技术的进一步发展及其在微生物学应用领域的扩大，它们必将发挥出更大的作用。,核酸分子杂交技术,SOUTHERNNORTHERN,第 一 节,核酸分子杂交的基本原理,原理：碱基互补配对原则,一、核酸分子杂交 (nucleic acid hybridization ) 来源不同的两条单链核酸分子通过碱基互补形成异源双螺旋分子，称为核酸分子杂交。杂交可分成：DNA/DNA、RNA/RNA、DNA/RNA之间的杂交。,复性,RNA,DNA,待测核酸序列 探针(probe)：已知核酸序列,二、DNA的变性(denaturation),定义：在某些理化因素作用下，DNA双链解开
46、成两条单链的过程。 方法：过量酸、碱、加热、变性试剂如尿素、甲酰胺以及某些有机溶剂如乙醇、丙酮等。变性后其它理化性质变化：OD260增高 粘度下降比旋度下降 浮力密度升高酸碱滴定曲线改变 生物活性丧失,DNA变性的本质是双链间氢键的断裂,Tm：变性是在一个相当窄的温度范围内完成，在这一范围内，双链DNA变性一半所需要的温度称为DNA的解链温度，又称熔解温度(melting temperature, Tm)。其大小与G+C含量成正比。,计算公式,Tm=（G+C）%0.41+69.3,三、DNA的复性,DNA复性(renaturation)的定义在适当条件下，变性DNA的两条互补链可 恢复天然的双
47、螺旋构象，这一现象称为复性。热变性的DNA经缓慢冷却后即可复性， 这一过程称为退火(annealing) 。减色效应DNA复性时，其溶液OD260降低。,DNA-DNA 杂交双链分子,不同来源的DNA分子,第 二 节 核酸分子杂交的基本方法,核酸分子杂交的类别,（一）DNA印迹技术 (Southern blotting) 用于基因组DNA的定性定量分析、酶切图谱分析、基因突变分析及限制性片段长度多态性分析（RFLP）等。 （二）RNA印迹技术 (Northern blotting) 用于RNA的定性定量分析。,蛋白质的印迹分析 (Western blotting) 用于蛋白质定性定量及相互作用
48、研究。,其他 斑点印迹 (dot blotting) 原位杂交 (in situ hybridization),（一）Southern 印迹杂交,DNA 印迹 E. Southern 1975 年,Southern blot步骤,（1）待测核酸样品的制备：提取基因组DNA，并用适当的限制性内切酶消化水解基因组DNA，成大小不一的DNA片段。 （2）待测DNA样品的电泳分离。 （3）凝胶中核酸的变性：DNA在制备与电泳过程中DNA片段始终保持双链结构。电泳结束后DNA变性并转移到适当的固定支持物上才能进行Southern blot。 变性通常用碱变性法。,（4） Southern 转膜：将凝胶中的DNA进行碱变性并将PH恢复中性后，即可将凝胶中DNA转移到固定支持物上。 固定支持物：硝酸纤维素（NC）膜、尼龙膜、化学活化膜和滤纸等。 转移方法：毛吸管虹吸印迹法、电转印迹法、真空转移法。 （5）已知序列的DNA探针的制备,
