1、ICS 11.220B 41DB 37山 东 省 地 方 标 准DB37/ XXXXXXXXX副猪嗜血杆菌荧光定量 PCR检测技术Technology of Real-time PCR Assay In Haemophilus parasuisXXXX-XX-XX发布 XXXX-XX-XX实施山 东 省 质 量 技 术 监 督 局 发 布DB37/ XXXXXXXXXI前 言本标准按照GB/T 1.12009给出的规则起草。本标准由山东省畜牧兽医局提出。本标准由山东省畜牧业专业标准化技术委员会归口。本标准主要起草单位：山东省农业科学院畜牧兽医研究所。本标准主要起草人：吴家强、于江、郭立辉、张玉
2、玉、杜以军、李俊、陈蕾、陈智、孙文博、丛晓燕、时建立、王金宝。本标准为首次发布。DB37/ XXXXXXXXX1副猪嗜血杆菌荧光定量 PCR检测技术1 范围本标准规定了副猪嗜血杆菌荧光定量PCR检测技术的要求。本标准适用于猪血液、组织及细菌培养物中副猪嗜血杆菌的检测。2 规范性引用文件下列文件对于本文件的应用是必不可少的。凡是注日期的引用文件，仅所注日期的版本适用于本文件。凡是不注日期的引用文件，其最新版本（包括所有的修改单）适用于本文件。GB/T 6682 分析实验室用水规格和试验方法3 术语和定义下列术语和定义适用于本文件。3.1 Ct值 Cycle threshold每个反应管内的荧光信
3、号量达到设定的阈值时所经历的循环数。4 缩略语下列缩略语适用于本文件。HPS：副猪嗜血杆菌（Haemophilus parasuis）5 仪器与试剂除非另有说明，在检测中使用的化学试剂均为分析纯，实验室用水应符合GB/T 6682的要求。5.1 微量可调移液器（最大量程为 10 L、20 L、100 L、1000 L）。5.2 高速冷冻离心机。5.3 荧光定量 PCR 仪。5.4 水浴锅。5.5 恒温培养箱。5.6 -20 冰箱。5.7 二级生物安全柜。5.8 超低温冰箱：可控温至-70 。5.9 10 mL 抗凝采血管。5.10 一次性无菌 5 mL 注射器。DB37/ XXXXXXXXX2
4、5.11 1.5 mL 无 RNA 酶离心管。5.12 0.2 mL PCR 薄壁管或八联管。5.13 PBS 缓冲液。5.14 SYBR Green 核酸染料（含酶）。5.15 蛋白酶 K（见附录 A.1）。5.16 10%SDS 液（见附录 A.2）。5.17 70%乙醇（见附录 A.3）。5.18 引物：P1：5-ACCAGAAGCAAACCCAGAGC-3，P2：5-ACACCGCTTGCCATACCCTC-3。5.19 标准阳性对照：HPS infB 基因阳性质粒。5.20 标准阴性对照：无菌超纯水。6 方法6.1 样品采集6.1.1 活体采样：无菌采集抗凝血。6.1.2 病死猪采样
5、：无菌采集心包积液或胸腔积液或肺脏组织。6.1.3 细菌培养物：37 培养 24 h48 h 的细菌培养物。6.2 样品处理6.2.1 组织样品处理：取肺脏组织 3 g5 g 于研钵中，用灭菌剪刀剪碎，加入 2 mL PBS 缓冲液，研磨。6.2.2 细菌培养物处理：挑取 34 个细菌单菌落加入 100 L 灭菌水中，煮沸 10 min 后，再放置-20 冻结。冻融后，10000 r/min 离心 5 min，取上清作为 DNA 模板，-20 保存备用。6.3 核酸提取6.3.1 取样品 500 L 于 1.5 mL 离心管中，加入 50 g/mL 的蛋白酶 K 5 L，加入 10 %的 SD
6、S 溶液25 L， 55 水浴 2 h3 h。6.3.2 加入 200 L Tris 饱和酚，充分混匀，10000 r/min 离心 15 min。6.3.3 取上清于一新的离心管中，加入 200 L Tris 饱和酚和 200 L 氯仿，10000 r/min 离心 15 min。6.3.4 取上清于一新离心管中，加入 200 L 氯仿，10000 r/min 离心 15 min。6.3.5 取上清于一新离心管中，加入 2 倍体积的无水乙醇，-20 静止 20 min，10000 r/min 离心15 min，弃上清。6.3.6 加入 70 %的乙醇冲洗沉淀表面及管壁，弃乙醇，晾干。6.3.
7、7 加入 100 L 灭菌超纯水溶解沉淀，-20 保存备用。6.4 荧光定量 PCR反应体系荧光定量PCR反应体系，详见附录B.1。6.5 荧光定量 PCR程序设定每次PCR均应设阳性对照与阴性对照，具体参数见附录B.2。DB37/ XXXXXXXXX37 结果判定7.1 试验成立条件7.1.1 阴性对照无 Ct 值并且无扩增曲线。7.1.2 阳性对照 Ct 值30，并出现特定扩增曲线，否则，此试验视为无效。7.2 判定7.2.1 阴性Ct值35，表明样品为阴性。7.2.2 阳性Ct值30，且出现特定扩增曲线，表明样品中存在 HPS。7.2.3 疑似30 Ct值35的样品须重检，结果仍然在该区
8、间，判定为阳性。DB37/ XXXXXXXXX4A A附 录 A（资料性附录）试剂的配制A.1 蛋白酶K溶液(20 mg/mL) 蛋白酶K 100 mg灭菌双蒸水 5 mLA.2 10 %十二烷基硫酸钠（SDS溶液，pH7.2）十二烷基硫酸钠 10 g灭菌双蒸水 80 mL浓盐酸 调pH至7.2灭菌双蒸水 加至100 mLA.3 70 %乙醇无水乙醇 70 mL灭菌双蒸水 30 mLDB37/ XXXXXXXXX5B B附 录 B（规范性附录）荧光定量 PCR反应体系和程序B.1 荧光定量PCR反应体系表 B.1 荧光定量 PCR反应体系组分 反应体系SYBR Green 核酸染料 12.5 L引物 P1 1.0 L引物 P2 1.0 LDNA 模板 2.0 L灭菌水 8.5 L总量 25.0 LB.2 荧光定量PCR反应程序表 B.2 荧光定量 PCR反应程序设定温度 时间步骤 1 95 10 min步骤 2（40 个循环） 95 10 s58 收集信号 10 s步骤 3 95 2 min60 20 s95 Continue_
