1、 密级：分类号：学校代码：10075学 号：20111840理学博士学位论文高灵敏度检测蛋白激酶活性的荧光分析学位申请人：白洁指导教师：李正平教授学位类别：理学博士学科专业：分析化学授予单位：河北大学答辩日期：二一四年六月Classified Index:U.D.C.:CODE: 10075NO: 20111840A Dissertation for the Degree of D. ScienceHighly Sensitive Detection ofProtein Kinase Activity Based onFluorescent AssayCandidate: Bai JieSup
2、ervisor : Professor Li ZhengpingAcademic Degree Applied for: Doctor of ScienceSpecialty : Analytical ChemistryUniversity : Hebei UniversityDate of Oral Examination : June, 2014摘 要摘要激酶在细胞增殖、分化和代谢等生理过程的调控中担任着重要的角色。众多的人类疾病与激酶的活性异常有着直接或者间接的关系。因此对激酶活性的分析检测对于生化研究、临床诊断及对重大疾病的药物靶向治疗等都具有重要意义。研究快速、简单、灵敏度高和特异性
3、好的检测激酶活性的新方法具有广泛的应用前景。本论文以蛋白激酶和己糖激酶为研究对象，主要应用荧光共轭聚合物、功能性磁性微球、便携式血糖仪等生物传感器为技术平台，结合分子荧光、荧光成像等检测技术，研究建立了一系列检测激酶活性的新方法，主要内容如下：1基于阴离子荧光共轭聚合物的荧光共振能量转移作用，发展了一种均相、通用型的新型生物传感器，用于蛋白激酶活性的检测。水溶性荧光共轭聚合物（ PFPaa）带有氨基二乙酸的侧链，它与金属离子（Zr4+）形成配位化合物。荧光标记的肽底物在蛋白激酶的作用下被磷酸化，其磷酸基团与 Zr4+特异性结合。以 Zr4+为“ 桥梁”，PFPaa与标记在肽上的荧光基团被拉近，
4、产生了强烈的荧光共振能量转移（FRET），并对荧光信号进行放大，由此可实现对蛋白激酶活性的高灵敏度检测。该方法操作简便，可检测0.0005 UL-1 1 UL-1的蛋白激酶，并可用于抑制剂的筛选。2将 TiO2修饰在 Fe3O4/SiO2磁性微球表面。荧光标记的底物肽在蛋白激酶存在时被磷酸化，其磷酸基团与 Ti4+特异性结合，从而被富集在磁性微球表面。通过对富集的磷酸化肽上标记的荧光进行检测或对磁性微球表面荧光成像进行分析，可以实现对蛋白激酶活性的高灵敏度检测。该方法对蛋白激酶活性的测定范围为 0.0005 UL-1 0.5UL-1，检出限为 0.0001 UL -1。该方法成功的应用于细胞裂
5、解液中蛋白激酶活性检测及蛋白激酶活性抑制剂的筛选。此外对不同的蛋白激酶底物肽标记不同的荧光基团，还可以实现对不同蛋白激酶的同时检测。3基于便携式血糖仪，建立了一种简单、快速、均相测定已糖激酶活性的方法。己糖激酶催化葡萄糖的磷酸化，磷酸化的葡萄糖在血糖仪上不产生响应信号，以商品化的便携式血糖仪作为实验信号测定设备，根据体系中剩余葡萄糖的含量，间接测得己糖激酶的活性。本方法的检测范围为 10-6 UL-1 10-2 UL-1，这种新的分析方法也可应用于己糖激酶抑制剂的高通量筛选。I摘 要关键词蛋白激酶己糖激酶荧光分析荧光共轭聚合物TiO2修饰Fe3O4/SiO2磁性微球便携式血糖仪IIAbstra
6、ctAbstractKinases play an important role in regulation of fundamental biological processes,including cell proliferation, differentiation and metabolism. Aberrations in kinase activitiescan result in a number of diseases. Therefore, sensitive and widely applicable assays formonitoring kinase activity
7、 are of great signicance for further understanding the molecularmechanism in biochemical research, clinical diagnosis, and development of targeted therapy.In this study, we focus on the development of sensitive methods for detection of proteinkinase activity and hexokinase activity. This dissertatio
8、n presents a series of new methods fordetection of kinase activity by using conjugated polymers, functionalized magneticmicrospheres and glucose meter technology integrated with molecular fluorescence andfluorescence images detection. The main contents are as follows:1. Anionic fluorescent conjugate
9、d polymer (PFPaa) coupled with the metal ion-mediatedFRET, can be used to design a versatile, homogeneous, and simple platform for detection ofprotein kinase activities. In conclusion, we have demonstrated that PFPaa can complex withZr4+ and the complexed Zr4+ can selectively recognize the phosphate
10、 group on the peptidesubstrates, resulting in ecient FRET from PFPaa to the fluorophores labeled on thephosphorylated peptides. Based on the light-harvesting property and amplification offluorescence signals, PFPaa can be used to design a versatile, homogeneous, robust platform todetect protein kina
11、se activity with high sensitivity. Protein kinase A (PKA) activity can bequantitatively detected over a wide concentration range from 0.0005 UL-1 1 UL-1. Thenew strategy provides a simple detection procedure, easy readout and cost eective manner forprotein kinase assay, which shows great potential f
12、or high-throughput assay in clinicaldiagnostics and drug discovery applications.2. A simple, highly sensitive, and dual-readout uorescent assay is developed for thedetection of protein kinase activity based on the specic recognition utility of TiO2-coatedFe3O4/SiO2 magnetic microspheres (TMSPs) for
13、kinase-induced phosphopeptides. When theuorophore-labeled substrate peptides are phosphorylated by the kinase reaction, they canbind specically to the TiO2 layer of TMSPs by means of phosphate groups, resulting inuorophore enrichment on the TMSP surfaces. The accumulated uorophores on the TMSPsare p
14、roportional to the kinase activity, and the uorescence signal readout could be runIIIAbstractthrough either direct uorescent imaging of the TMSPs or measurement of the uorescenceintensity by simply detaching the uorescent phosphopeptides into the solution. The TMSPsexhibit extremely high selectivity
15、 for capturing phosphorylated peptides over thenonphosphorylated ones, resulting in an ultrahigh uorescence signal-to-background ratio of42, which is the highest uorescence change thus far in uorescent assays for detection ofprotein kinase activities. Therefore, the proposed uorescent assay presents
16、 high sensitivity,low detection limit of 0.0001 UL-1, and wide dynamic range from 0.0005 UL-1 to 0.5UL-1 with protein kinase A (PKA) as a model target. Moreover, the TMSP-based uorescentassay can simultaneously quantify multiple kinase activities with their specic peptideslabeled with dierent dyes.
17、This new strategy is also successfully applied to monitoringdrug-triggered PKA activation in cell lysates. Therefore, the TMSP-based uorescent assay isvery promising in high-throughput screening of kinase inhibitors and in highly sensitivedetection of kinase activity, and thus it is a valuable tool
18、for development of targeted therapy,clinical diagnosis, and studies of fundamental life science.3. We provide a simple, rapid, homogeneous method for measuring hexokinase activiteby quantitating the amount of glucose remaining in solution following a kinase reaction,which is monitored by the persona
19、l glucometer. The glucose level is correlated with theamount of glucose present and is inversely correlated with the amount of kinase activity. Thewide dynamic range was detected from 10-6 UL-1 to 10-2 UL-1 by using HK as a modeltarget. Moreover, this new method is also successfully applied to high-
20、throughput screeningof HK inhibitors. Thus is a valuable tool for development of targeted therapy as well as thestudies of fundamental life science.Keywords Protein kinase Hexokinase Fluorescence assay Fluorescence conjugatedpolymer TiO2 coated magnetic microsphere Glucose meterIV目 录目录第 1章引言 11.1选题的
21、背景与意义. 11.2蛋白激酶（Protein kinase）概述 41.2.1蛋白磷酸化修饰 41.2.2蛋白激酶的重要性 41.2.3蛋白激酶的分类 61.2.4蛋白激酶的活性分析 71.3己糖激酶（Hexokinase）概述 161.3.1己糖激酶的活性分析 171.4生物传感器. 181.4.1基于荧光共轭聚合物的生物传感器研究进展 181.4.2基于功能化磁性微球的生物传感器研究进展 211.4.3基于便携式血糖仪的生物传感器研究进展 231.5论文主要研究内容. 24第 2 章基于荧光共轭聚合物及金属离子介导的荧光共振能量转移高灵敏检测蛋白激酶活性 252.1引言. 252.2实验
22、部分. 262.2.1仪器与试剂 262.2.2 PKA催化底物肽磷酸化. 272.2.3荧光探针 PFPaa-Zr4+的制备. 282.2.4 PKA活性分析. 282.2.5荧光检测步骤 282.2.6 PKA抑制剂筛选. 282.2.7 AKT1活性分析. 282.3结果与讨论. 29V目 录2.3.1实验原理 292.3.2体系中 Zr 4+浓度的优化 312.3.3体系中 PFPaa 浓度的 优化 342.3.4体系中 ATP浓度的优化. 342.3.5体系中 FITC-peptide浓度的优化 352.3.6检测 PKA活性的校准曲线及检出限 362.3.7 PKA抑制剂的筛选.
23、372.3.8检测 AKT1的活性 382.4结论. 39第 3章基于功能化磁性微球的蛋白激酶活性荧光分析 403.1引言. 403.2实验部分. 413.2.1仪器与试剂 413.2.2 TiO2修饰磁性微球（TMSPs）的制备及表征 433.2.3细胞培养及细胞裂解液的制备 433.2.4 PKA催化磷酸化肽. 433.2.5 TMSFs磁球选择性富集磷酸化肽. 443.2.6荧光法检测 PKA活性 443.2.7荧光成像法测定 PKA活性 443.2.8 PKA抑制剂筛选. 443.2.9荧光法检测 AKT1活性 453.2.10同时测定 PKA和 AKT1两种蛋白激酶的活性 453.3
24、结果与讨论. 453.3.1 TiO2修饰磁性微球（TMSPs）的制备及表征 453.3.2实验原理 473.3.3考察 TMSPs 磁性微球分散溶剂乙腈（ACN）对磷酸化肽选择性富集的影响483.3.4优化磷酸化肽从 TMSPs磁球上的洗脱条件 49VI目 录3.3.5体系中 ATP浓度的优化. 513.3.6检测 PKA活性的校准曲线及检出限 513.3.7 PKA抑制剂的筛选. 553.3.8同时测定 PKA和 AKT1两种蛋白激酶的活性 563.3.9 HeLa细 胞中 PKA活性测定 573.4结论. 58第 4章基于便携式血糖仪测定已糖激酶的活性分析 594.1引言. 594.2实
25、验部分. 604.2.1仪器设备 604.2.2主要试剂 604.2.3 HK催化磷酸化葡萄糖 . 614.2.4血糖仪测定 614.2.5 HK抑制剂筛选 . 614.2.6复杂体系中 HK活性的测定 624.3结果与讨论. 624.3.1实验原理 624.3.2 HK活性测定 . 634.3.3 HK抑制剂筛选试验 . 634.3.4复杂基体 HK活性测定 644.4结论. 65结语 66参考文献 67致谢 76攻读学位期间取得的科研成果 77VII第 1章 引言第 1章引言1.1选题的背景与意义生物的遗传、繁殖、生长、发育及信号转导等生命活动，大都是在酶的催化下进行的。因此从分子水平上研
26、究酶的活性，对于探索生命活动的本质及规律无疑具有重要的意义。酶是一种生物催化剂，其化学本质主要就是蛋白质。在对酶的研究中，有一类酶称其为“激酶 ”。所谓激酶 （kinase）是指从一个高能供体分子（如 ATP）转移磷酸基团至特定受体分子（底物）的酶，而这一过程称之为磷酸化。蛋白激酶是最大的激酶族群。它是通过对蛋白底物的丝氨酸 /苏氨酸或酪氨酸残基的磷酸化而完成对蛋白质的翻译后修饰，这一过程在许多细胞生物过程（细胞的生长、发育、分化、膜转运及死亡）中均起着十分重要的作用。蛋白磷酸化是生物体传递信息的基本方式，因此在细胞信号转导过程中占有极其重要的地位。异常的磷酸化与许多疾病相关，这使得蛋白激酶成
27、为重要的药物靶标。因此，简便快速、高灵敏度的蛋白激酶活性分析方法对于疾病诊断、靶向药物筛选都具有重要意义，而且也有利于对细胞信号转导机制的深入研究。传统检测蛋白激酶活性的方法是放射性标记法1，这种方法的缺点是显而易见的，存在放射性污染问题。出于对健康和环境影响的考虑，近年来出现一些非放射性蛋白激酶活性检测方法，如免疫法2，利用对磷酸化氨基酸位点有特异性识别作用的亲和抗体，区分底物肽或蛋白是否被磷酸化，从而实现蛋白激酶的活性检测，但磷酸化亲和抗体制备复杂、操作繁琐、成本较高，使其应用受到限制。因此，人们致力研究一些非放射性、无需抗体标记的蛋白激酶活性测定方法，例如：比色分析法3，电化学分析法4-
28、9、表面等离子体共振法10,11 等，虽然这些方法可以达到测定蛋白激酶的目的，但各自都存在有一定的缺点，有些方法所用试剂合成难度较大价格昂贵，有些方法涉及多步操作过程费时耗力。目前还有很多以荧光法为基础的检测方法12-16 ，与现有的其它方法相比，荧光分析法具有很多突出的优点，如非放射性、操作简单、容易实现均相分析、样品用量少等。因此，本论文研究的目的是基于荧光检测技术，建立一系列简便、快速、高灵敏度的测定蛋白激酶活性的分析方法。还有一类激酶称为己糖激酶（Hexokinase，HK）。 肿瘤细胞获取能量的方式主要是- 1 -河北大学理学博士学位论文糖酵解，而 HK是生物体内糖酵解途径的第一个关
29、键酶，HK特异性的表达，在恶性肿瘤组织中发挥着较高的催化作用17 ，使得肿瘤组织在缺氧的情况下，仍能获取足够能源，并且糖酵解的中间产物可被肿瘤细胞利用，用来合成蛋白质、核酸和脂类等，为肿瘤细胞本身的生长和增殖提供了必要的物质基础18。测定 HK的活性可为明确肿瘤的作用机制提供理论基础，为癌症的治疗提供新的思路。目前已发展了多种 HK活性检测技术，传统测定 HK活性的方法是光度分析法19 ，但是此方法涉及其它辅酶，操作过程较复杂费时。近些年还出现一些检测 HK活性的新方法，例如：高效液相色谱法（HPLC）20、毛细管电泳法（CE）21及利用共轭聚合物22或金纳米粒子23的 HK可视化检测。这些方
30、法原理一般是利用 HK在催化葡萄糖磷酸化前后，通过检测 ATP剩余含量或者生成二磷酸腺苷 ADP的量，或是利用 ATP/ADP 所带电荷不同，间接测定 HK的活性。但是，ATP与 ADP 的结构上是非常相似的，仅差一个磷酸基团，所以此类分析方法的选择性不够理想。因此，建立一种快速、简单、可靠的分析方法测定 HK的活性并对其抑制剂进行筛选，对临床诊断以及抗癌药物的研究都具有重要的意义。生物传感器是在多种学科相互交叉渗透的过程中而成长起来的，它结合了生命科学、化学、物理学、医学、信息科学和电子技术等众多领域的各种新技术。因为具有灵敏度高、选择性好、分析速度快、准确性高、操作简单、易实现自动化分析等
31、特点，使其在近年来获得了巨大的发展。生物传感器作为一种强有力的分析技术已成功用于生命科学研究、环境监测、临床检验与分析、医学生物工程、食品安全检验以及分析化学等众多方面24 。生物传感器的核心部分是用于传导光、热等信号的传感材料，其决定了生物传感器的稳定性、选择性和灵敏度。因此，选择并优化传统材料，研发和应用新型传感材料，是当前生物传感器研究的一项重要课题。荧光共轭聚合物是一类具有特殊光、电性质的高分子化合物。近年来，其作为生物传感元件，应用于生物大分子（如核酸、蛋白质）特异性识别和检测方面的研究受到了科学家们的广泛关注。由于荧光共轭聚合物具有较强的光捕获能力，而且具有倍增光学响应性，可以用来
32、放大荧光传感信号，这些优势为发展高灵敏度的检测方法提供了新的平台，为生物传感器的发展提供了新的传感模式。因此，基于荧光共轭聚合物的新型生物传感器在生命科学、药物分析、医疗诊断及环境科学等方面具有广泛的应用前景。本研究拟建立一种基于荧光共轭聚合物检测蛋白激酶活性的新型生物传感器，通过一种水- 2 -第 1章 引言溶性荧光共轭聚合物与金属离子形成的配合物作为荧光探针，标记了荧光染料的肽底物在蛋白激酶催化下被磷酸化后，在均相溶液中利用金属离子与肽磷酸化点位的特异性识别作用，基于荧光共振能量转移（FRET）机制，构建一种新颖独特的蛋白激酶活性检测体系。由于金属离子/底物磷酸化位点之间的特异性相互作用，
33、可以很好的提高 该传感器的选择性；由于荧光共轭聚合物对荧光信号的放大作用，可取得很高的检测灵敏度；由于操作简便、快速，该方法有望应用于蛋白激酶抑制剂的高通量筛选。磁性微球是一种由磁性材料和非磁性材料复合而成的新型功能化微球。一方面由于其具有磁性，可以在外加磁场作用下很方便的从介质中分离出来，提高分离效率，大大缩短样品的分析时间。另一方面，可以通过表面修饰等手段，在磁球表面修饰各种不同功能基团，使其具备选择性富集目标物质的功能，大幅度提高检测灵敏度及检测效率，从而拓宽了磁球的应用领域。因此，磁性微球作为一种新型功能材料，在分离工程、生物医学、分子生物学等众多领域显示出重要的作用。本研究拟建立一种
34、基于功能化磁性微球检测蛋白激酶活性的新型生物传感器。我们制备了 TiO2修饰的功能化磁性微球（TMSPs），以其 为载体，标记了荧光染料的肽底物在蛋白激酶作用下被磷酸化后，利用 TiO2对底物磷酸化位点之间的特异性识别作用， 设计了一种蛋白激酶活性检测体系。由于 TiO2对磷酸化位点的特异性识别作用，可大大提高分析方法的 选择性和灵敏度。由于磁球具有磁性，可简化操作过程，缩短分析时间，极大的提高工作效率。本论文基于功能化磁性材料结合荧光光谱法等研究手段，不仅对单一蛋白激酶的活性进行分析，还计划同时检测多种蛋白激酶的活性，并对其相应抑制剂进行筛选，最终有望实现实际生物样品细胞裂解液中蛋白激酶活性
35、的检测。通过本论文的研究建立的这种选择性好、灵敏度高、操作简便、检测快、成本低的分析方法，在疾病诊断及药物筛选等领域具备很好的应用前景。血糖仪是目前已实现商品化、应用最为成熟和成功的生物传感器，它在食品分析、临床检验等方面发挥着极为重要的作用。随着实验技术和微电子技术的不断发展，血糖仪也不断向着功能多样化、操作简单、便携、成本低廉的方向发展。目前市售的便携式血糖仪，所需样品量少，仅需几秒钟即可完成检测，这正是临床检验所需要的。本研究拟基于便携式血糖仪这种传统的生物传感器为技术平台，构建一种极为简单的检测己糖激酶（HK）活性的新方法。本研究通过 HK催化葡萄糖磷酸化，之后利用商品化的便- 3 -
36、河北大学理学博士学位论文携式血糖仪作为实验信号测定设备，根据检测体系中剩余葡萄糖的含量，间接检测 HK的活性，这种新的分析方法也可应用于 HK抑制剂的高通量筛选。1.2蛋白激酶（Protein kinase）概述1.2.1蛋白磷酸化修饰蛋白质的可逆磷酸化是生物体内普遍存在的一种重要的调节机制，几乎涉及所有的生命过程，如细胞的增殖及生长发育、细胞信号转导、代谢调控、基因表达、转录调控、神经递质的合成与释放，肿瘤发生等。研究表明，真核细胞中三分之一到二分之一的蛋白质经过磷酸化修饰。如图 1.1所示，蛋白质的可逆磷酸化过程是由两个作用相反的酶系列进行调控的分别为蛋白激酶和蛋白磷酸酶催化的蛋白磷酸化和
37、去磷酸化反应。其中，蛋白质的磷酸化是指在蛋白激酶的催化作用下，将 ATP上的 - 磷酸基团转移到底物蛋白特定的氨基酸残基上的过程；而其逆过程蛋白质的去磷酸化是由蛋白磷酸酶催化完成的25 。图 1.1蛋白质的可逆磷酸化1.2.2蛋白激酶的重要性蛋白激酶对目标蛋白的磷酸化是一种非常重要的蛋白质翻译后修饰方式，其能够调节细胞内大多数蛋白的功能，是一种普遍的调控机制。蛋白的磷酸化修饰与众多生物过程紧密相关，如信号转导26、DNA损伤修复27、基因转录28、细胞凋亡29等。特别是蛋白激酶作为最大的酶家族，在细胞信号转导过程起着无可替代的作用。细胞信号转导是指细胞通过细胞膜或者细胞内受体接受外界信号，经细
38、胞系统级联传递，将细胞外信- 4 -第 1章 引言号转导为细胞内信号，引发细胞内生化反应，继而影响细胞的生物学功能的过程。细胞信号转导几乎涉及所有重要的生命现象。蛋白激酶对信号转导过程的影响主要表现在以下几个方面30-32 ：第一是在细胞信号转导过程中，通过蛋白质的逐级磷酸化，使介导信号逐级转导并放大，最终引起细胞反应。例如细胞外的信号通过胞内的第二信使使蛋白激酶发生变化，从而影响细胞传递途径中蛋白质或者其他酶类的磷酸化水平，每修饰一次，产生一次放大作用，通过一系列级联放大反应，最终使细胞对外界信号作出相应的反应，这种放大作用可高达成千上万倍。第二是通过可逆蛋白磷酸化，在细胞内介导细胞外信号时
39、具有专一应答的特点。与信号传递相关的激酶一般受控于胞内信使，而胞内信使的活性主要来自于细胞外信号的间接调节，较少受到细胞内代谢产物的影响，因而能够比较专一的催化由于外界刺激引起的相关生化反应，使细胞可以对胞外的信号做出正确应答。第三是通过可逆蛋白磷酸化，使其在细胞应答外界信号的持续反应中具有重要作用。例如在细胞分化的过程中，细胞内信号分子的寿命均较短，但是上游蛋白激酶一旦被激活，通过级联反应，其下游的底物蛋白或酶会逐级磷酸化，延长细胞效应。蛋白激酶还可激活作为第三信使的转录因子，改变基因转录，把短暂的信号转化为长时间的反应。第四是通过蛋白可逆磷酸化直接决定目标蛋白是否有活性，引导或阻碍细胞特定
40、的信号通路；还可以调节细胞内激酶的活性量，使细胞应答反应更为有效。比如在糖分解中，被磷酸化的糖原磷酸化酶具有活性，去磷酸化酶没有活性，因此通过可逆磷酸化，实现对酶的激活或去活，调节胞内酶的活性量，使细胞应对外界刺激的反应更为迅速。功能正常的蛋白激酶是细胞信号转导系统日常运作的核心，但是当其发生故障时，比如蛋白激酶活性异常或者过表达就会导致蛋白磷酸化的异常，众多的人类疾病和此反常信号密切相关，如糖尿病33、老年痴呆34及癌症35等。例如点激酶 CHK2的功能缺失与乳腺癌、前列腺癌等密切相关36。蛋白激酶 C（PKC）是促进肿瘤生长的佛波酯的第一个受体，许多肿瘤细胞中 PKC的含量都有所增加，PK
41、C的活性异常在糖尿病血管并发症中也发挥重要作用30 。蛋白激酶“ 指挥” 的整个机体的信号网 络系统操纵 着每个组织、每个器官、甚至每个细胞的生死。蛋白激酶现已成为治疗这些复杂疾病的重要药物靶点，是继 G蛋白偶联受体之后的另一个重要的靶向 药物的靶标37-39 。鉴于蛋白激酶在细胞信号转导通路中的重要作用，以及众多疾病与蛋白激酶的密切- 5 -河北大学理学博士学位论文关系，对蛋白激酶进行深入研究有着重要的意义，这不仅有助于对细胞生物过程的深入了解，也有助于理解相关疾病发生的分子机制及对疾病进行早期诊断，还可以设计和开发以蛋白激酶作为药物靶点的新型靶向药物。1.2.3蛋白激酶的分类蛋白激酶（Pr
42、otein kinase）是一类磷酸转移酶，作用是使底物蛋白磷酸化，机理是将三磷酸腺苷（ATP）上的 -磷酸基团转移到蛋白底物特定的氨基酸残基上。常见的蛋白质磷酸化位点包括丝氨酸（ Ser）、苏氨酸（Thr）和酪氨酸（Tyr ）。蛋白激酶是一个非常大的家族，是酶家族中重要的成员。随着人类基因测序完成，已鉴定有 500多种蛋白激酶，占整个人类基因编码蛋白的 1.7 %40。尽管蛋白激酶的种类繁多，但是几乎所有的蛋白激酶在结构上都有很大的相似性，特别是催化部分，也因此把蛋白激酶称为一个家族。目前，对蛋白激酶家族的分类并没有统一的标准，最为普遍的分类方法是根据底物蛋白质被磷酸化的氨基酸残基的反应位点
43、不同将其分类41 ，即：（1）丝氨酸/苏氨酸（Ser/Thr ）蛋白激酶：蛋白质中丝氨酸、苏氨酸的羟基被磷酸化；体；（2）酪氨酸（Tyr ）蛋白激 酶：蛋白质中酪氨酸酚羟基作为磷酸根受体；（3）组氨酸蛋白激酶：蛋白质中组氨酸、精氨酸或赖氨酸的碱性基团为磷酸根受（4）色氨酸蛋白激酶：蛋白质中色氨酸残基作为磷酸根受体；（5）天冬氨酰基/谷氨酰基蛋白激酶：蛋白质的酰 基为磷酸根受体。在众多的蛋白激酶中，蛋白激酶 A（Protein kinase A ，PKA ）是第一个被解析的激酶晶体，由于对其结构和性质比较清楚，现已成为科研工作者研究蛋白激酶家族的最佳切入点，本论文也主要以 PKA为研究对象。蛋白
44、激 酶 A（PKA）又称 cAMP依赖性蛋白激酶 A（cyclic-AMP dependent protein kinase A），是一种 丝氨酸/苏氨酸蛋白激酶，普遍存在于动物体内。如图 1.2所示，PKA全酶分子是由四个 亚基（R2C2）组成的四聚体，其中两个是对环磷酸腺苷（cAMP）有高亲和力的调节亚基（regulatory subunit ，简称 R亚 基），另两个是具有活性的催化亚基（catalytic subunit，简称 C亚基）。PKA的全酶是没有活性的，但它可被 cAMP激活，cAMP与调节 R亚基结合，导致 R2C2解- 6 -第 1章 引言离出 1个 R 2亚基和 2个具
45、有酶活性的 C亚基。cAMP是一种重要的第二信使（能将细胞膜表面特异性受体接受的胞外信号转换成为胞内信号的分子），负责细胞内的信号转导32。而 PKA是 cAMP发挥作用的主要调节子，几乎所有真核 细胞内的 cAMP的作用都是通过活化 PKA，从而使其底物蛋白发生磷酸化而 实现的。PKA 被 cAMP活化后，在 ATP的存在下，可以通过磷酸化作用激活多种酶 ，调节细胞的基因表达和物质代谢，影响细胞的分化和增殖。25本文主要就是以蛋白激酶 A 为模式蛋白激酶，研究建立了一系列高灵敏度检测蛋白激酶的分析方法，并将其应用于蛋白激酶抑制剂的筛选。图 1.2 PKA 激活机理1.2.4蛋白激酶的活性分析
46、蛋白激酶在细胞信号转导中具有重要作用，其活性异常与众多的人类疾病密切相关，对其抑制剂的筛选也一直都是靶向药物开发的热点方向。因此建立准确、灵敏的检测蛋白激酶活性的方法，并对其相应抑制剂进行高通量筛选，对于了解基础生命过程、阐明细胞信号转导机制均具有重要价值，而且对于激酶相关疾病的临床诊断、药物开发等具有重要意义。目前，用于检测蛋白激酶活性的方法有放射性同位素标记法 42-44、电化学法4-9 、表面等离子共振45、和质谱法46,47 等新的分析方法。虽然这些方法可以对蛋白激酶的活性进行检测，但各自都存在一定的局限性：一些方法的操作过程复杂，涉及标记、孵育、表面封闭、多步清洗、检测信号的生成和放
47、大等多步过程，费时耗力；有些方法则需要昂贵的检测仪器。近年来，通过科研工作者们的不断探索和不懈努力，设计和构建了许- 7 -河北大学理学博士学位论文多蛋白激酶活性的检测方法，这为深入了解蛋白质的生理过程，为激酶相关的临床诊断和药物筛选都奠定了基础。蛋白激酶催化底物磷酸化的过程，涉及 ATP的参与和磷酸基 团的转移，因此为了达到测定蛋白激酶活性的目的，一般会在 ATP、底物 肽或与磷酸化相关的分子上进行标记或者修饰，或者在实验体系中引入与磷酸基团有特异性亲合作用的基团。现有的方法主要分为：基于 ATP分子标记或修饰测定蛋白激 酶活性、基于免疫法测定蛋白激酶活性、基于电荷的变化测定蛋白激酶活性、基
48、于金属离子或金属氧化物与底物磷酸化位点的特异性亲和作用检测蛋白激酶活性。现简单介绍如下：1.2.3.1基于修饰或标记 ATP分子用于检测蛋白激 酶活性蛋白激酶的催化过程就是将 ATP上的 -磷酸基团转移到蛋白/肽底物特定的氨基酸残基上。如果以 ATP作为切入点，对其 位的磷酸基 团进行标记，在磷酸化反应后，标记在 位上的功能基团 随磷酸基团转移到底物上，通 过对其检测确定激酶活性。传统检测蛋白激酶的方法大多为放射性同位素标记法1，这种方法利用 32P标记的ATP（- 32P-ATP），通过 激酶催化磷酸化，将 ATP 位上标记的磷酸基团转移到底物肽/蛋白上，分离产物后，利用放射性探测仪器对放射活性进行监测，从而确定蛋白激酶活性。Brust课题组 基于生物素修饰的三磷酸腺苷（-biotin-ATP）及金纳米粒子（AuNPs），结合比色法，构建了一种检测蛋白激酶活性的新方法48。如图 1.3所示，AuNPs表面通过 Au-S共价键结合末端带有半胱氨酸的肽底物，利用蛋白激酶将 -biotin-ATP上的-biotin-磷酸基团转移到肽底物上，此时 AuNPs 随着表面修 饰肽的磷酸化而带上 biotin基团；在体系中加入另一种用亲和素（avidin）修 饰的 AuN
