1、柴胡多糖硫酸化修饰条件的优化及其修饰前后抗氧化能力比较 宋见喜 任婷 满枋霖 冯丽娟 孙新 佟海滨 北华大学分析测试中心 北华大学生命科学中心吉林省分子老年医学重点实验室 中国中医科学院博士后科研流动站中药资源中心 摘 要： 目的:探讨硫酸化修饰柴胡多糖 (BCP) 的影响因素, 阐明硫酸化柴胡多糖 (S-BCP) 抗氧化能力提升的可能机制。方法:利用氯磺酸-吡啶法对 BCP 进行了硫酸化修饰。通过调节氯磺酸与吡啶的体积比 (12、14 和 18) , 观察 S-BCP的取代度 (DS) ;应用红外 (IR) 光谱初步分析 BCP 和 S-BCP 的结构, 扫描电子显微镜 (SEM) 下观察分
2、析 BCP 和 S-BCP 的表面形态表现。基于 1, 1-二苯基-2-三硝基苯肼 (DPPH) 自由基的清除能力建立抗氧化模型, 实验分为阳性对照组、BCP 组和 S-BCP 组, 检测各组 DPPH 自由基的清除率。结果:当氯磺酸与吡啶的体积比为 14、反应时间为 2h、反应温度为 60时, 制得 S-BCP 的含硫百分率最大值为 18.62%, DS 最大值为 2.32。与 BCP 组比较, 各剂量 S-BCP 组DPPH 自由基的清除率升高 (P0.05) 。结论:氯磺酸与吡啶的体积比影响 S-BCP的 DS 值, BCP 经硫酸化修饰后通过改变多糖的理化性质和空间构象而提升其抗氧化能
3、力。关键词： 柴胡; 多糖; 硫酸化; 抗氧化; 作者简介：宋见喜 (1981-) , 男, 甘肃省天水市人, 讲师, 医学博士, 主要从事天然产物方面的研究。作者简介：佟海滨, 副教授, 硕士研究生导师 (Tel:0432-64608350;E-mail:) ;作者简介：孙新, 教授, 硕士研究生导师 (Tel:0432-64608351, E-mail:) 收稿日期：2017-07-05基金：国家自然科学基金资助课题 (31401203) Optimization of sulfated modification conditions of polysaccharide fromBuple
4、urum Chinense and comparison of their antioxidant abilities between before and after modificationSONG Jianxi REN Ting MAN Fanglin FENG Lijuan SUN Xin TONG Haibin Analtical and Testing Center, Beihua University; Life Science Research Center, Jilin Provincial Key Laboratory of Molecular Geriatric Medi
5、cine, Beihua University; Abstract： Objective:To investigate the influencing factors of sulfated modification of Bupleurum chinense polysaccharides (BCP) , and to elucidate the possible mechanism of improving the antioxidant ability of sulfated BCP (S-BCP) .Methods:BCP was sulfated by chlorosulfonic
6、acid-pyridine method.The degree of substitution (DS) of SBCP was observed by adjusting the volume ratios of chlorosulfonic acid to pyridine (12, 14, and 18) .The structures of BCP and S-BCP were analyzed by infrared (IR) spectroscopy, the morphology of BCP and S-BCP were observed under scanning elec
7、tron microscopy (SEM) .The antioxidant model was established by using 1, 1-diphenyl-2-picrylhydrazyl (DPPH) free radical scavenging.The experiment was divided into positive control group, BCP group and S-BCP group, and the scavenging rates of DPPH free radical in various groups were compared.Results
8、:When the volume ratio of chlorosulfonic acid to pyridine was 14, the reaction time was 2 hand the reaction temperature was 60 , the maximum sulfur content percentage of S-BCP was 18.62% and the DS was the highest (DS= 2.32) .Compared with BCP group, the scavenging rate of DPPH free radical of S-BCP
9、 was significantly increased (P0.05) .Conclusion:The volume ratio of chlorosulfonic acid to pyridine can affect the DS of S-BCP.The sulfated modification can increase the anti-oxidant capacity of BCP by changing its physic-chemical characters and spatial conformation.Keyword： Bupleurum chinense; pol
10、ysaccharide; sulfation; anti-oxidant; Received： 2017-07-05柴胡是我国的传统中药和常用中药, 中华人民共和国药典 (2015 年版) 记载伞形科多年生草本植物北柴胡 (Bupleurum chinense DC.) 和狭叶柴胡 (南柴胡, Bupleurum scorzonerifolium Willd.) 的干燥根为柴胡的药用部位, 北柴胡是商品柴胡的主流品种, 在我国已有 2 000 多年的应用历史1。柴胡味苦, 性微寒, 归肝、胆、肺经, 具有和解表里、疏肝解郁、升阳举陷和退热截疟之功效, 常用于治疗感冒发热、寒热往来、胸满胁痛、肝
11、郁气滞和疟疾等。柴胡含有丰富的活性化学成分, 主要包括柴胡皂苷、甾醇、挥发油 (柴胡醇、丁香酚等) 和多糖等2。近些年来国内外的研究主要集中在柴胡皂苷的药效学功能, 而关于柴胡多糖 (Bupleurum chinense polysaccharides, BCP) 的研究报道较少。天然植物多糖是重要的高分子化合物, 除了作为植物的贮藏养料和骨架成分外, 其在抗氧化、抗肿瘤和抗心血管疾病等方面也具有独特的生理活性3。近年来, 对多糖进行化学修饰是一个研究热点4。随着人们对多糖化学修饰认知度的提高, 多糖的硫酸化修饰越来越受到重视, 这主要是因为硫酸酯化后的多糖具有非常突出的生物学功能, Bere
12、ss 等5和 Hayashi 等6发现:许多原本具有微弱抗病毒、抗肿瘤活性的多糖, 经过硫酸化修饰后, 其抗病毒和抗肿瘤活性得到了明显提高。焦中高等7研究表明:红枣多糖经硫酸化修饰后, 其抗氧化活性明显增强。与其他植物多糖类似, BCP 本身具有独特的药用价值, 对人体系统性红斑狼疮关节炎、类风湿关节炎和肾炎等常见疾病作用明显8。目前, 对 BCP 的硫酸化修饰研究鲜有报道。因此, 本实验主要优化了 BCP 的硫酸化修饰条件, 并考察了 BCP 硫酸化修饰前后其抗氧化能力的变化, 旨在为 BCP 的应用提供参考, 同时也为中药柴胡资源的合理开发与利用提供科学依据。1 材料与方法1.1 主要试剂
13、和仪器BCP 由北华大学生命科学研究中心制备9, N, N 二甲基-甲酰胺、无水乙醇、DMSO、氢氧化钠、氯磺酸、吡啶、硫酸钾、明胶和氯化钡 (均为分析纯, 天津永大化学试剂有限公司) 。水浴超声波 (昆山市超声仪器有限公司) , 高温干燥箱 (上海博迅实业有限公司医疗设备厂) , 紫外光谱 (美国瓦里安公司) , 红外光谱 (德国布鲁克公司) , 扫描电镜 (美国 FEI 公司) 。1.2 硫酸化柴胡多糖 (sulfated BCP, S-BCP) 的制备称取 300mg BCP 溶于 20mL 无水甲酰胺中, 加入装有酯化剂的三颈烧瓶中, 加完后调节温度至 60, 反应 2h。通过加入不同
14、比例氯磺酸与吡啶 (12、14和 18) 制备的酯化试剂 (15 mL) 得到具有不同取代度 (DS) 的 S-BCP (即S-BCP1-2、S-BCP 1-4和 S-BCP1-8组) , 见表 1。反应 2h 后, 恢复至室温, 采用4molL 氢氧化钠溶液调节硫酸化多糖混合溶液的 pH 至 7.0, 离心收集上清溶液, 用 3 倍体积的无水乙醇进行聚沉过夜, 再离心收集沉淀装袋透析、冻干。氯磺酸和吡啶的反应比例见表 1。表 1 氯磺酸和吡啶的反应比例 Tab.1 Ratios of chlorosulfonic acid to pyridine 下载原表 1.3 硫酸基 DS 的测定配制氯
15、化钡-明胶溶液:准确称量 2g 明胶溶于 400mL 蒸馏水中, 充分搅拌使之完全溶解, 溶液完全后置入 4冰箱保存;配制氯化钡明胶溶液:同样, 准确称取4g 氯化钡溶于 400mL 明胶溶液中, 充分搅拌使之完全溶解, 溶解完全后置入4冰箱保存。硫酸基浓度标准曲线的绘制:用移液枪从 0.6gL 标准 K2SO4溶液中称取0.02、0.06、0.10、0.14、0.18 和 0.20 mL 溶液置于小离心管中, 离心管标号, 然后向其中加入蒸馏水补至 1.0mL, 按照顺序加入稀盐酸 1 mL, 氯化钡-明胶溶液 0.5mL, 充分摇匀;在室温下静止放置 20min。采用紫外可见光光谱仪在36
16、0nm 处测定吸光度 (A) 值, 同时做对比实验, 以 0.5 mL 明胶溶液代替氯化钡明胶试剂, 测得 A1 值, 以硫酸基的浓度为横坐标, 以 (A-A1) 为纵坐标绘制标准曲线。硫酸基浓度的测定:采用电子天平准确称取 5mg S-BCP, 放入反应釜, 向反应釜中加入 6mL、1molLHCl, 在烘箱中反应 12h, 烘箱温度设置为 105, 使硫酸根游离。12h 后, 用氮气吹干, 吹干完成后加入 1mL 水, 制成待测样品, 用移液管量取样品待测溶液 0.1 mL。按照上述标准曲线的测定方法测定, 按标准曲线计算样品中硫酸基团的浓度, 按照以下公式转换成硫酸基团 DS, 并用下列
17、公式计算硫酸基浓度。硫酸基浓度=CV/W100%。DS= (1.62S%) / (32-1.02S%) 。C 为样品测定浓度, V 为样品溶液的体积, W 为称量样品质量, S%为硫的百分比。1.4 BCP 和 S-BCP 的结构分析红外光谱 (IR) 分析:分别取 12 mg BCP 和 S-BCP, 用溴化钾压片, 在 4004 000cm 区间内用傅里叶变换红外光谱仪扫描 IR 吸收。扫描电子显微镜 (SEM) 分析:分别采用导电胶将 BCP 和 S-BCP 样品固定在样品座上, 然后用喷金仪对其表面喷金之后, 直接放入电镜中进行测试。1.5 DPPH 自由基清除率的检测在 96 孔板中
18、依次加入 150L 不同浓度 (0.05、0.10、0.20、0.40、0.80 和1.60gL) BCP 溶液或 S-BCP 溶液 (BCP 组和 S-BCP 组) 或维生素 C 溶液 (阳性对照组) , 加入 210molL, 1-二苯基-2-三硝基苯肼 (DPPH) 无水乙醇溶液150L, 室温反应 30 min, 于波长 517nm 处测定 A 值, 按照以下公式计算 DPPH的清除率。清除率=1- (A 1-A2) /A0100%。A0 为水的 A 值;A1 为多糖溶液的A 值;A2 为乙醇的 A 值。1.6 统计学分析采用 SPSS 13.0 统计软件进行统计学分析。BCP 和 S
19、-BCP 对 DPPH 自由基清除率以 xs 表示, 组间比较采用单因素方差分析。以 P0.05 为差异有统计学意义。2 结果2.1 硫酸基浓度的标准曲线硫酸基浓度曲线线性关系良好, 线性回归方程为:y=3.025 2x, R=0.997 3。见图 1。图 1 硫酸钡浊度法测定硫酸基浓度的标准曲线 Fig.1 Standard curve of sulfate concentration detected by barium sulfate turbidity method 下载原图2.2 BCP 硫酸化修饰实验结果以硫酸基 DS 为指标, 可以较为直观地观察 BCP 的酯化情况和分析氯磺酸和
20、吡啶的体积比对酯化反应的影响。当其体积比为 14, 反应时间为 2h, 反应温度为60时, 硫酸基浓度最高值为 18.62%, DS 最大值为 2.32。见表 2。2.3 BCP 和 S-BCP 的理化性质分析结果2.3.1 IR 分析结果BCP 的 IR 图显示:3 416cm 处为缔合 O-H 的伸缩振动吸收峰, 也可能包含 N-H 伸缩振动吸收峰, 2 916cm 处为 C-H 伸缩振动吸收峰, 1 745cm 处为 C=O 伸缩振动吸收峰, 1 609cm 处可能为 N-H 变形振动吸收峰、1 105cm 处为 C-OH 中 C-O 的伸缩振动吸收峰, 845 cm 和 890 cm
21、处无吸收峰, 1 1001 010cm 间只有 2 个吸收峰, 说明 BCP 含有呋喃糖苷键。S-BCP1-4的 IR 图显示:3 416cm 处的吸收峰变小、1 105 cm 处的吸收信号几乎消失, 836cm 和 1 229cm 处新出现了吸收峰, 1 229cm 处是 S=O 的伸缩振动吸收峰, 836cm 是 C-O-S 的拉伸振动吸收峰, 说明 BCP 经硫酸化修饰后形成了硫酸酯。表 2 BCP 硫酸化修饰实验结果 Tab.2 Experiment results of sulfated modification of BCP 下载原表 对比 S-BCP1-2、S-BCP 1-4和
22、S-BCP1-8的 IR 图显示:S-BCP 1-4的 IR 图中在 836cm和 1 229cm 处吸收峰信号最强, 在 3 443cm 吸收峰信号最弱, 即氯磺酸与吡啶的比例为 14 时, BCP 的硫酸化程度最高, 与该条件下通过公式计算得到的 DS最高的结果一致。见图 2。2.3.2 SEM 分析结果BCP 表面粗糙, 含有多种不同规则气孔的大片状结构;经硫酸化修饰后, BCP 中的气孔几乎消失, 多糖呈碎片化, 表面相对平滑, 而且随着所采用的酯化试剂不同, 碎片之间的距离也发生了不同程度的变化。见图 3。图 2 BCP 和 S-BCP 的 IR 图 Fig.2 IR spectru
23、ms of BCP and S-BCP 下载原图图 3 SEM 下 BCP 和 S-BCP 形态表现 (Bar=50m, 1 000) Fig.3 Morphology of BCP and S-BCP under SEM (Bar=50m, 1 000) 下载原图A:BCP;B:S-BCP1-2;C:S-BCP1-4;D:S-BCP1-8.2.4 BCP 和 S-BCP 对 DPPH 自由基的清除率BCP 和 S-BCP 均展现出对 DPPH 自由基清除的能力。在 0.051.60gL 时, 随着浓度的增加, 对 DPPH 自由基清除率也随之增加, 呈明显量效关系。当 BCP 和S-BCP
24、质量浓度0.2gL 时, BCP 和 S-BCP 对 DPPH 自由基的清除率差别不显著;当浓度大于 0.2gL 时, S-BCP 对 DPPH 自由基的清除率大于 BCP, 并且差别逐渐增大。同时, S-BCP 1-8对 DPPH 自由基的清除率大于 S-BCP1-2和 S-BCP1-4。当浓度达到 1.6gL 时, BCP、S-BCP 1-2、S-BCP 1-4和 S-BCP1-8对 DPPH 自由基的清除率分别为 66.3%、74.2%、85.5%和 90.6%。见表 3。3 讨论硫酸化修饰多糖的酯化反应条件有:氯磺酸与吡啶的体积比、反应时间和反应温度。本实验在合理的反应时间和反应温度下
25、, 优化了影响酯化反应的最主要因素 (磺酸与吡啶的体积比) , 当磺酸与吡啶的体积比分别为 12、14 和18 时, 制得的 S-BCP 的含硫百分率分别为 18.57%、18.62%和 12.09%, DS 分别为 2.30、2.32 和 1.00。上述结果与田庚元等10和张丽萍等11制备出的硫酸化多糖的含硫百分率和 DS 基本一致。本实验制备 S-BCP 的 IR 图中 1 105cm 处的 C-OH 中 C-O 的伸缩振动吸收峰几乎消失可证明磺酸基取代了多糖羟基中的大部分的氢。S-BCP 的 IR 图中新出现的 1 229cm 处 S=O 的伸缩振动吸收峰、836cm 处 C-O-S 的
26、拉伸振动吸收峰, 说明了 BCP 经硫酸化修饰后形成了硫酸酯。随着氯磺酸与吡啶体积比的减小, 意味着在相同体积的酯化试剂中, 氯磺酸的绝对浓度一直在降低;而制得的硫酸化多糖的 DS 先升高再降低, 这是因为当氯磺酸的绝对浓度过高时, 会将部分多糖水解12, 当氯磺酸的绝对浓度比较低, 磺酸基的数量又不足以取代多糖羟基中的氢时, DS 又会降低。表 3 BCP 和 S-BCP 对 DPPH 自由基的清除率 Tab.3 Scavenging rates of BCP and S-BCP on DPPH free radical 下载原表 DPPH 抗氧化活性初步研究结果表明:BCP 和 S-BCP
27、 均具有一定的抗氧化活性, 且柴胡经硫酸化修饰后抗氧化能力有所增加。这是因为 BCP 羟基上的氢逐渐被磺酸基取代后, 使多糖分子极性增加, 水溶性进一步增强, 从而增强了 BCP 与DPPH 自由基的结合能力。同时, S-BCP 1-8的清除活性优于 S-BCP1-2和 S-BCP1-4, 说明硫酸化多糖的 DS 与其对 DPPH 自由基清除能力不一定成正比。王峰等13研究显示:随着硫酸化海洋真菌多糖中硫酸基 DS 的增加, 其抗氧化活性随之增强, 但邓成华等14的研究结果显示:DS 较低的硫酸化虎奶多糖的抗氧化活性优于 DS 高的硫酸化虎奶多糖。因此, 硫酸化多糖的生物活性不仅与硫酸基 DS
28、有关, 还与硫酸基的取代位置、硫酸化多糖的空间构象等有关15-18。BCP 经硫酸化修饰后, 利用 SEM 观察其形貌显示:与 BCP 表面比较, S-BCP 表面更加平滑, 而且呈碎片化。这种形貌有利于其与 DPPH 更加充分的接触, 这可能也是S-BCP 增强了其与 DPPH 自由基结合能力的原因之一。参考文献1国家药典委员会.中华人民共和国药典M.北京:中国医药科技出版社, 2015:280. 2薛文峰, 刘长利, 张淑华, 等.柴胡药材中的矿质元素与有效成分的相关性分析J.中国实验方剂学杂志, 2017, 23 (8) :45-49. 3邹胜, 徐溢, 张庆.天然植物多糖分离纯化技术研
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