1、外科学(烧伤)专业优秀论文 CTLA4Ig 对 NK 细胞功能调节及其在大面积烧伤治疗中作用的实验研究关键词:大面积烧伤 NK 细胞 CTLA41g 天然免疫 细胞毒性摘要:大面积烧伤后,患者免疫应答低下(1,2),容易发生感染,另一方面机体却对皮肤移植物产生强有力的排斥反应,因此在不增加患者感染几率的前提下提高异体皮的存活时间(即所谓免疫耐受的诱导),是大面积烧伤治疗的核心问题。 NK 细胞作为天然免疫系统最重要的细胞在机体杀伤肿瘤细胞和抵抗病原体(病毒、细菌等)感染中发挥着重要作用。NK 细胞的活化与否受控于 NK细胞表面表达的抑制性受体(如 NKG2A)和激活性受体(如 NKG2D)的状
2、态。然而,在大面积烧伤后,患者 NK 细胞毒性功能显著下降(26,27),是机体容易发生感染的重要原因之一。研究发现,院内获得性绿脓杆菌感染是烧伤感染和败血症发生的重要原因(3)。绿脓杆菌分泌的外毒素可抑制 NK 细胞毒性和 IFN-y 的分泌(4),且对现在临床使用的大部分抗生素均耐药(5)。激活性受体 NKG2D 在 NK细胞清除肺绿脓杆菌感染中起了关键作用(6,7),那么 NK 细胞功能的增强是否会降低机体播散性感染发生的几率呢? 在免疫耐受诱导的研究中,20 年前发现的 CTLA4 以及在此基础上制备的重纽融合蛋白 CTLA41g 最令人瞩目。由于CTLA41g 能高亲和力地结合抗原递
3、呈细胞上的 CD80/CD86,阻断了共刺激信号,使 T 细胞不能接受第二信号,从而导致 T 细胞不应答,所以 CTLA41g 是 T 细胞活化中重要的负调节分子(8)。目前,CTLA41g 的衍生物-Abatacept 和Belatacept 分别被用于治疗自身免疫性疾病和控制器官移植免疫排斥反应(9-12)。我们的前期研究结果(13)和文献报道(14)也证实注射 CTLA41g 或创面局部应用 CTLA41g 重组腺病毒均可延长异体皮移植存活期,因此,CTLA41g 如果可以应用于烧伤患者将会抑制移植物排斥反应,延长移植物的存活时间。那么,在烧伤情况下使用 CTLA41g 会加重烧伤后的病
4、情和增加并发症及死亡率吗? Abatacept 是被美国 FDA 批准用于临床治疗类风湿关节炎的药物,由人 CTLA4分子胞外区和突变的 IgGl Fc 段融合而成。奇怪的是,这-T 细胞强有力的抑制剂应用于人体后,其肿瘤形成、病毒及细菌感染等副作用的发生率却比预期大大降低(15-17)。亦有研究证实,小鼠全身应用两倍剂量于人的药物浓度时,并不影响其抵抗肺结核感染的能力,但这一有悖于常理的现象的机制和意义还是未知数(18)。UrsulaGrohmann 发现,CTLA41g 与 DCs 表面 B7 分子结合后,向DCs 胞内传递激活信号(19)。该研究说明,CTLA41g 对表达 CD80/C
5、D86 分子的细胞有调节作用。另有报道,天然免疫系统中最重要的细胞-NK 细胞表面也表达CD86 分子,且在某些条件下可表达 CD80 分子(20,21)。Beissert S 发现,长期暴露于紫外线中的 CTLA41g 转基因小鼠,其皮肤肿瘤结节数量明显少于野生型小鼠(22),事实上,NK 细胞在皮肤癌细胞杀伤中发挥中重要作用(23)。综上所述,CTLA41g 可通过阻断 T 细胞激活的共刺激信号通路抑制皮肤移植免疫排斥反应,其全身应用并不会显著增加机体感染和肿瘤形成的风险.同时,CTLA41g 可能对表面表达 CD80/CD86 分子且在控制感染和肿瘤形成的其重要作用的细胞(如 NK 细胞
6、)有调节作用(23)因此,我们提出如下科学问题:CTLA41g是否因为与 NK 细胞表面 B7 分子结合增强 NK 细胞毒性而造成机体清除皮肤癌细胞(或其他肿瘤细胞)能力的增强?其机制如何?这些怍用可否解释 CTLA41g 在活体内使用后并不显著降低整体抵抗力的现象? 本实验通过体内、体外试验验证 CTLA41g 对 NK 细胞功能是否具有调节功能,通过小鼠感染、烫伤和肿瘤模型验证上述调节作用,并初步探讨其分子机制。从而深化对 CTLA41g 免疫调节作用的认识,并为 CTLA41g 应用于大面积烧伤治疗提供理论基础。我们将本研究获得的主要结果和结论归纳如下: 一、CTLA41g 及其衍生物
7、Abatacept 是NK 细胞强有力的激活剂 1、CTLA41g 在体外可明显增强人 PBMC 和 NK 细胞功能; 2、CTLA41g(Abatacept)在体内可显著增强小鼠 NK 细胞毒性; 3、CTLA41g 增强人 NK 细胞毒性的作用是 CTLA4 分子依赖的; 4、CTLA41g(Abatacept)可增强机体抗肿瘤的能力。 二、我们对CTLA41g(Abatacept)在大面积烧伤治疗中的新认识: 我们的前期研究结果(13)和文献报道(14)都证实注射 CTLA41g 或创面局部应用 CTLA41g 重组腺病毒均可延长异体皮移植存活期,这就意味着 CTLA41g 如果可以应用
8、子烧伤患者将会抑制移植物排斥反应,延长移植物的存活时间。因此,我们利用绿脓杆菌感染模型和烫伤模型评价 CTLA41g 用于烧伤患者治疗皮肤移植排斥反应的安全性,我们的研究首次发现使用 Abatacept 不仅可以显著提高 Balb/c 小鼠清除绿脓杆菌的能力而且还能增强烫伤小鼠脾脏细胞的毒性,与体外的实验结果一致。这一研究发现提示 CTLA41g 未来可用于大面积严重烧伤患者以诱导对皮肤移植物的免疫耐受,增强机体天然免疫力。这将是严重烧伤疾病治疗的重大突破。 三、CTLA41g 通过与 NK 细胞表面 CD80/CD86 分子结合上调激活性受体 NKG2D 和NKp44 表达,增强 NK 细胞
9、毒性功能: 1,CTLA41g 通过与 NK 细胞表面CD80/CD86 分子的结合促进 NK 细胞的毒性功能:本实验研究抗 CD80 抗体和抗CD86 抗体对 NK 细胞有无调节作用。结果发现:抗 CD80 抗体和抗 CD86 抗体在体外可明显增强人 PBMC 对 K562 细胞的毒性,且与 CTLA41g 组 NK 细胞毒性无明显差异。结合上述实验结果我们认为,CTLA41g 通过与 NK 细胞表面 CD80/CD86分子的结合促进 NK 细胞的毒性功能。 2,CTLA41g 可上调 NK 细胞表面激活性受体 NKG2D、NKp44 的表达:我们采用流式细胞技术探讨 CTLA41g 对 N
10、K 细胞表面 NKG2D 和 NKp44 表达的调节作用。结果发现体外加入 CTLA41g 后,人 NK 细胞表面激活性受体 NKG2D、NKp44 袁达明显上调,且程度与 IL-2 相似。FcR 受体与 NK 细胞结合不会导致 NKG2D、NKp44 表达上调。这一结果说明 NK 细胞表面激活性受体 NKG2D、NKp44 的在 CTLA41g 增强 NK 细胞毒性功能的调节作用中可能发挥了重要作用。 总结: 一、CTLA4 在体内、体外均可增强 NK 细胞毒性; 二、CTLA41g 通过与 NK 细胞表面 CD80/CD86 分子结合上调 NK 细胞表面NKG2D 和 NKp44 的表达,
11、增强 NK 细胞功能; 三、CTLA41g 及其衍生物(如Abatacept)在全身应用,可增强小鼠抗肿瘤和抗感染的能力,不增加患者罹患肿瘤及感染的几率,扩大了其临床应用的适应症; 四、CTLA41g 全身应用不仅可治疗皮肤移植物排斥反应,且可增加烫伤小鼠 NK 细胞毒性,减少播散性感染的发生,为 CTLA41g 应用于治疗烧伤患者提供了新思路; 五、我们发现CTLA4 对于获得性免疫系统(T 细胞)和天然免疫系统(NK 细胞)截然不同的作用,这对我们深入了解免疫系统的调节和内环境的稳定具有重大意义,将为临床肿瘤生物治疗和大面积烧伤救治提供全新的理论基础和研究方向。正文内容大面积烧伤后,患者免
12、疫应答低下(1,2),容易发生感染,另一方面机体却对皮肤移植物产生强有力的排斥反应,因此在不增加患者感染几率的前提下提高异体皮的存活时间(即所谓免疫耐受的诱导),是大面积烧伤治疗的核心问题。 NK 细胞作为天然免疫系统最重要的细胞在机体杀伤肿瘤细胞和抵抗病原体(病毒、细菌等)感染中发挥着重要作用。NK 细胞的活化与否受控于 NK 细胞表面表达的抑制性受体(如 NKG2A)和激活性受体(如 NKG2D)的状态。然而,在大面积烧伤后,患者 NK 细胞毒性功能显著下降(26,27),是机体容易发生感染的重要原因之一。研究发现,院内获得性绿脓杆菌感染是烧伤感染和败血症发生的重要原因(3)。绿脓杆菌分泌
13、的外毒素可抑制 NK 细胞毒性和 IFN-y 的分泌(4),且对现在临床使用的大部分抗生素均耐药(5)。激活性受体 NKG2D 在 NK 细胞清除肺绿脓杆菌感染中起了关键作用(6,7),那么 NK 细胞功能的增强是否会降低机体播散性感染发生的几率呢? 在免疫耐受诱导的研究中,20 年前发现的 CTLA4 以及在此基础上制备的重纽融合蛋白 CTLA41g 最令人瞩目。由于CTLA41g 能高亲和力地结合抗原递呈细胞上的 CD80/CD86,阻断了共刺激信号,使 T 细胞不能接受第二信号,从而导致 T 细胞不应答,所以 CTLA41g 是 T 细胞活化中重要的负调节分子(8)。目前,CTLA41g
14、 的衍生物-Abatacept 和Belatacept 分别被用于治疗自身免疫性疾病和控制器官移植免疫排斥反应(9-12)。我们的前期研究结果(13)和文献报道(14)也证实注射 CTLA41g 或创面局部应用 CTLA41g 重组腺病毒均可延长异体皮移植存活期,因此,CTLA41g 如果可以应用于烧伤患者将会抑制移植物排斥反应,延长移植物的存活时间。那么,在烧伤情况下使用 CTLA41g 会加重烧伤后的病情和增加并发症及死亡率吗? Abatacept 是被美国 FDA 批准用于临床治疗类风湿关节炎的药物,由人 CTLA4分子胞外区和突变的 IgGl Fc 段融合而成。奇怪的是,这-T 细胞强
15、有力的抑制剂应用于人体后,其肿瘤形成、病毒及细菌感染等副作用的发生率却比预期大大降低(15-17)。亦有研究证实,小鼠全身应用两倍剂量于人的药物浓度时,并不影响其抵抗肺结核感染的能力,但这一有悖于常理的现象的机制和意义还是未知数(18)。UrsulaGrohmann 发现,CTLA41g 与 DCs 表面 B7 分子结合后,向DCs 胞内传递激活信号(19)。该研究说明,CTLA41g 对表达 CD80/CD86 分子的细胞有调节作用。另有报道,天然免疫系统中最重要的细胞-NK 细胞表面也表达CD86 分子,且在某些条件下可表达 CD80 分子(20,21)。Beissert S 发现,长期暴
16、露于紫外线中的 CTLA41g 转基因小鼠,其皮肤肿瘤结节数量明显少于野生型小鼠(22),事实上,NK 细胞在皮肤癌细胞杀伤中发挥中重要作用(23)。综上所述,CTLA41g 可通过阻断 T 细胞激活的共刺激信号通路抑制皮肤移植免疫排斥反应,其全身应用并不会显著增加机体感染和肿瘤形成的风险.同时,CTLA41g 可能对表面表达 CD80/CD86 分子且在控制感染和肿瘤形成的其重要作用的细胞(如 NK 细胞)有调节作用(23)因此,我们提出如下科学问题:CTLA41g是否因为与 NK 细胞表面 B7 分子结合增强 NK 细胞毒性而造成机体清除皮肤癌细胞(或其他肿瘤细胞)能力的增强?其机制如何?
17、这些怍用可否解释 CTLA41g 在活体内使用后并不显著降低整体抵抗力的现象? 本实验通过体内、体外试验验证 CTLA41g 对 NK 细胞功能是否具有调节功能,通过小鼠感染、烫伤和肿瘤模型验证上述调节作用,并初步探讨其分子机制。从而深化对 CTLA41g 免疫调节作用的认识,并为 CTLA41g 应用于大面积烧伤治疗提供理论基础。我们将本研究获得的主要结果和结论归纳如下: 一、CTLA41g 及其衍生物 Abatacept 是NK 细胞强有力的激活剂 1、CTLA41g 在体外可明显增强人 PBMC 和 NK 细胞功能; 2、CTLA41g(Abatacept)在体内可显著增强小鼠 NK 细
18、胞毒性; 3、CTLA41g 增强人 NK 细胞毒性的作用是 CTLA4 分子依赖的; 4、CTLA41g(Abatacept)可增强机体抗肿瘤的能力。 二、我们对CTLA41g(Abatacept)在大面积烧伤治疗中的新认识: 我们的前期研究结果(13)和文献报道(14)都证实注射 CTLA41g 或创面局部应用 CTLA41g 重组腺病毒均可延长异体皮移植存活期,这就意味着 CTLA41g 如果可以应用子烧伤患者将会抑制移植物排斥反应,延长移植物的存活时间。因此,我们利用绿脓杆菌感染模型和烫伤模型评价 CTLA41g 用于烧伤患者治疗皮肤移植排斥反应的安全性,我们的研究首次发现使用 Aba
19、tacept 不仅可以显著提高 Balb/c 小鼠清除绿脓杆菌的能力而且还能增强烫伤小鼠脾脏细胞的毒性,与体外的实验结果一致。这一研究发现提示 CTLA41g 未来可用于大面积严重烧伤患者以诱导对皮肤移植物的免疫耐受,增强机体天然免疫力。这将是严重烧伤疾病治疗的重大突破。 三、CTLA41g 通过与 NK 细胞表面 CD80/CD86 分子结合上调激活性受体 NKG2D 和NKp44 表达,增强 NK 细胞毒性功能: 1,CTLA41g 通过与 NK 细胞表面CD80/CD86 分子的结合促进 NK 细胞的毒性功能:本实验研究抗 CD80 抗体和抗CD86 抗体对 NK 细胞有无调节作用。结果
20、发现:抗 CD80 抗体和抗 CD86 抗体在体外可明显增强人 PBMC 对 K562 细胞的毒性,且与 CTLA41g 组 NK 细胞毒性无明显差异。结合上述实验结果我们认为,CTLA41g 通过与 NK 细胞表面 CD80/CD86分子的结合促进 NK 细胞的毒性功能。 2,CTLA41g 可上调 NK 细胞表面激活性受体 NKG2D、NKp44 的表达:我们采用流式细胞技术探讨 CTLA41g 对 NK 细胞表面 NKG2D 和 NKp44 表达的调节作用。结果发现体外加入 CTLA41g 后,人 NK 细胞表面激活性受体 NKG2D、NKp44 袁达明显上调,且程度与 IL-2 相似。
21、FcR 受体与 NK 细胞结合不会导致 NKG2D、NKp44 表达上调。这一结果说明 NK 细胞表面激活性受体 NKG2D、NKp44 的在 CTLA41g 增强 NK 细胞毒性功能的调节作用中可能发挥了重要作用。 总结: 一、CTLA4 在体内、体外均可增强 NK 细胞毒性; 二、CTLA41g 通过与 NK 细胞表面 CD80/CD86 分子结合上调 NK 细胞表面NKG2D 和 NKp44 的表达,增强 NK 细胞功能; 三、CTLA41g 及其衍生物(如Abatacept)在全身应用,可增强小鼠抗肿瘤和抗感染的能力,不增加患者罹患肿瘤及感染的几率,扩大了其临床应用的适应症; 四、CT
22、LA41g 全身应用不仅可治疗皮肤移植物排斥反应,且可增加烫伤小鼠 NK 细胞毒性,减少播散性感染的发生,为 CTLA41g 应用于治疗烧伤患者提供了新思路; 五、我们发现CTLA4 对于获得性免疫系统(T 细胞)和天然免疫系统(NK 细胞)截然不同的作用,这对我们深入了解免疫系统的调节和内环境的稳定具有重大意义,将为临床肿瘤生物治疗和大面积烧伤救治提供全新的理论基础和研究方向。大面积烧伤后,患者免疫应答低下(1,2),容易发生感染,另一方面机体却对皮肤移植物产生强有力的排斥反应,因此在不增加患者感染几率的前提下提高异体皮的存活时间(即所谓免疫耐受的诱导),是大面积烧伤治疗的核心问题。 NK
23、细胞作为天然免疫系统最重要的细胞在机体杀伤肿瘤细胞和抵抗病原体(病毒、细菌等)感染中发挥着重要作用。NK 细胞的活化与否受控于 NK 细胞表面表达的抑制性受体(如 NKG2A)和激活性受体(如 NKG2D)的状态。然而,在大面积烧伤后,患者 NK 细胞毒性功能显著下降(26,27),是机体容易发生感染的重要原因之一。研究发现,院内获得性绿脓杆菌感染是烧伤感染和败血症发生的重要原因(3)。绿脓杆菌分泌的外毒素可抑制 NK 细胞毒性和 IFN-y 的分泌(4),且对现在临床使用的大部分抗生素均耐药(5)。激活性受体 NKG2D 在 NK 细胞清除肺绿脓杆菌感染中起了关键作用(6,7),那么 NK
24、细胞功能的增强是否会降低机体播散性感染发生的几率呢? 在免疫耐受诱导的研究中,20 年前发现的 CTLA4以及在此基础上制备的重纽融合蛋白 CTLA41g 最令人瞩目。由于 CTLA41g 能高亲和力地结合抗原递呈细胞上的 CD80/CD86,阻断了共刺激信号,使 T 细胞不能接受第二信号,从而导致 T 细胞不应答,所以 CTLA41g 是 T 细胞活化中重要的负调节分子(8)。目前,CTLA41g 的衍生物-Abatacept 和 Belatacept 分别被用于治疗自身免疫性疾病和控制器官移植免疫排斥反应(9-12)。我们的前期研究结果(13)和文献报道(14)也证实注射 CTLA41g
25、或创面局部应用 CTLA41g 重组腺病毒均可延长异体皮移植存活期,因此,CTLA41g 如果可以应用于烧伤患者将会抑制移植物排斥反应,延长移植物的存活时间。那么,在烧伤情况下使用CTLA41g 会加重烧伤后的病情和增加并发症及死亡率吗? Abatacept 是被美国 FDA 批准用于临床治疗类风湿关节炎的药物,由人 CTLA4 分子胞外区和突变的 IgGl Fc 段融合而成。奇怪的是,这-T 细胞强有力的抑制剂应用于人体后,其肿瘤形成、病毒及细菌感染等副作用的发生率却比预期大大降低(15-17)。亦有研究证实,小鼠全身应用两倍剂量于人的药物浓度时,并不影响其抵抗肺结核感染的能力,但这一有悖于
26、常理的现象的机制和意义还是未知数(18)。UrsulaGrohmann 发现,CTLA41g 与 DCs 表面 B7 分子结合后,向 DCs 胞内传递激活信号(19)。该研究说明,CTLA41g 对表达 CD80/CD86 分子的细胞有调节作用。另有报道,天然免疫系统中最重要的细胞-NK 细胞表面也表达 CD86 分子,且在某些条件下可表达 CD80 分子(20,21)。Beissert S 发现,长期暴露于紫外线中的 CTLA41g 转基因小鼠,其皮肤肿瘤结节数量明显少于野生型小鼠(22),事实上,NK 细胞在皮肤癌细胞杀伤中发挥中重要作用(23)。综上所述,CTLA41g可通过阻断 T 细
27、胞激活的共刺激信号通路抑制皮肤移植免疫排斥反应,其全身应用并不会显著增加机体感染和肿瘤形成的风险.同时,CTLA41g 可能对表面表达 CD80/CD86 分子且在控制感染和肿瘤形成的其重要作用的细胞(如 NK 细胞)有调节作用(23)因此,我们提出如下科学问题:CTLA41g 是否因为与 NK 细胞表面 B7 分子结合增强 NK 细胞毒性而造成机体清除皮肤癌细胞(或其他肿瘤细胞)能力的增强?其机制如何?这些怍用可否解释 CTLA41g 在活体内使用后并不显著降低整体抵抗力的现象? 本实验通过体内、体外试验验证 CTLA41g 对 NK细胞功能是否具有调节功能,通过小鼠感染、烫伤和肿瘤模型验证
28、上述调节作用,并初步探讨其分子机制。从而深化对 CTLA41g 免疫调节作用的认识,并为CTLA41g 应用于大面积烧伤治疗提供理论基础。我们将本研究获得的主要结果和结论归纳如下: 一、CTLA41g 及其衍生物 Abatacept 是 NK 细胞强有力的激活剂 1、CTLA41g 在体外可明显增强人 PBMC 和 NK 细胞功能; 2、CTLA41g(Abatacept)在体内可显著增强小鼠 NK 细胞毒性; 3、CTLA41g增强人 NK 细胞毒性的作用是 CTLA4 分子依赖的; 4、CTLA41g(Abatacept)可增强机体抗肿瘤的能力。 二、我们对 CTLA41g(Abatace
29、pt)在大面积烧伤治疗中的新认识: 我们的前期研究结果(13)和文献报道(14)都证实注射CTLA41g 或创面局部应用 CTLA41g 重组腺病毒均可延长异体皮移植存活期,这就意味着 CTLA41g 如果可以应用子烧伤患者将会抑制移植物排斥反应,延长移植物的存活时间。因此,我们利用绿脓杆菌感染模型和烫伤模型评价 CTLA41g用于烧伤患者治疗皮肤移植排斥反应的安全性,我们的研究首次发现使用Abatacept 不仅可以显著提高 Balb/c 小鼠清除绿脓杆菌的能力而且还能增强烫伤小鼠脾脏细胞的毒性,与体外的实验结果一致。这一研究发现提示 CTLA41g未来可用于大面积严重烧伤患者以诱导对皮肤移
30、植物的免疫耐受,增强机体天然免疫力。这将是严重烧伤疾病治疗的重大突破。 三、CTLA41g 通过与 NK细胞表面 CD80/CD86 分子结合上调激活性受体 NKG2D 和 NKp44 表达,增强 NK 细胞毒性功能: 1,CTLA41g 通过与 NK 细胞表面 CD80/CD86 分子的结合促进 NK细胞的毒性功能:本实验研究抗 CD80 抗体和抗 CD86 抗体对 NK 细胞有无调节作用。结果发现:抗 CD80 抗体和抗 CD86 抗体在体外可明显增强人 PBMC 对 K562细胞的毒性,且与 CTLA41g 组 NK 细胞毒性无明显差异。结合上述实验结果我们认为,CTLA41g 通过与
31、NK 细胞表面 CD80/CD86 分子的结合促进 NK 细胞的毒性功能。 2,CTLA41g 可上调 NK 细胞表面激活性受体 NKG2D、NKp44 的表达:我们采用流式细胞技术探讨 CTLA41g 对 NK 细胞表面 NKG2D 和 NKp44 表达的调节作用。结果发现体外加入 CTLA41g 后,人 NK 细胞表面激活性受体NKG2D、NKp44 袁达明显上调,且程度与 IL-2 相似。FcR 受体与 NK 细胞结合不会导致 NKG2D、NKp44 表达上调。这一结果说明 NK 细胞表面激活性受体NKG2D、NKp44 的在 CTLA41g 增强 NK 细胞毒性功能的调节作用中可能发挥
32、了重要作用。 总结: 一、CTLA4 在体内、体外均可增强 NK 细胞毒性; 二、CTLA41g 通过与 NK 细胞表面 CD80/CD86 分子结合上调 NK 细胞表面 NKG2D 和NKp44 的表达,增强 NK 细胞功能; 三、CTLA41g 及其衍生物(如 Abatacept)在全身应用,可增强小鼠抗肿瘤和抗感染的能力,不增加患者罹患肿瘤及感染的几率,扩大了其临床应用的适应症; 四、CTLA41g 全身应用不仅可治疗皮肤移植物排斥反应,且可增加烫伤小鼠 NK 细胞毒性,减少播散性感染的发生,为 CTLA41g 应用于治疗烧伤患者提供了新思路; 五、我们发现 CTLA4 对于获得性免疫系
33、统(T 细胞)和天然免疫系统(NK 细胞)截然不同的作用,这对我们深入了解免疫系统的调节和内环境的稳定具有重大意义,将为临床肿瘤生物治疗和大面积烧伤救治提供全新的理论基础和研究方向。大面积烧伤后,患者免疫应答低下(1,2),容易发生感染,另一方面机体却对皮肤移植物产生强有力的排斥反应,因此在不增加患者感染几率的前提下提高异体皮的存活时间(即所谓免疫耐受的诱导),是大面积烧伤治疗的核心问题。 NK 细胞作为天然免疫系统最重要的细胞在机体杀伤肿瘤细胞和抵抗病原体(病毒、细菌等)感染中发挥着重要作用。NK 细胞的活化与否受控于 NK 细胞表面表达的抑制性受体(如 NKG2A)和激活性受体(如 NKG
34、2D)的状态。然而,在大面积烧伤后,患者 NK 细胞毒性功能显著下降(26,27),是机体容易发生感染的重要原因之一。研究发现,院内获得性绿脓杆菌感染是烧伤感染和败血症发生的重要原因(3)。绿脓杆菌分泌的外毒素可抑制 NK 细胞毒性和 IFN-y 的分泌(4),且对现在临床使用的大部分抗生素均耐药(5)。激活性受体 NKG2D 在 NK 细胞清除肺绿脓杆菌感染中起了关键作用(6,7),那么 NK 细胞功能的增强是否会降低机体播散性感染发生的几率呢? 在免疫耐受诱导的研究中,20 年前发现的 CTLA4以及在此基础上制备的重纽融合蛋白 CTLA41g 最令人瞩目。由于 CTLA41g 能高亲和力
35、地结合抗原递呈细胞上的 CD80/CD86,阻断了共刺激信号,使 T 细胞不能接受第二信号,从而导致 T 细胞不应答,所以 CTLA41g 是 T 细胞活化中重要的负调节分子(8)。目前,CTLA41g 的衍生物-Abatacept 和 Belatacept 分别被用于治疗自身免疫性疾病和控制器官移植免疫排斥反应(9-12)。我们的前期研究结果(13)和文献报道(14)也证实注射 CTLA41g 或创面局部应用 CTLA41g 重组腺病毒均可延长异体皮移植存活期,因此,CTLA41g 如果可以应用于烧伤患者将会抑制移植物排斥反应,延长移植物的存活时间。那么,在烧伤情况下使用CTLA41g 会加
36、重烧伤后的病情和增加并发症及死亡率吗? Abatacept 是被美国 FDA 批准用于临床治疗类风湿关节炎的药物,由人 CTLA4 分子胞外区和突变的 IgGl Fc 段融合而成。奇怪的是,这-T 细胞强有力的抑制剂应用于人体后,其肿瘤形成、病毒及细菌感染等副作用的发生率却比预期大大降低(15-17)。亦有研究证实,小鼠全身应用两倍剂量于人的药物浓度时,并不影响其抵抗肺结核感染的能力,但这一有悖于常理的现象的机制和意义还是未知数(18)。UrsulaGrohmann 发现,CTLA41g 与 DCs 表面 B7 分子结合后,向 DCs 胞内传递激活信号(19)。该研究说明,CTLA41g 对表
37、达 CD80/CD86 分子的细胞有调节作用。另有报道,天然免疫系统中最重要的细胞-NK 细胞表面也表达 CD86 分子,且在某些条件下可表达 CD80 分子(20,21)。Beissert S 发现,长期暴露于紫外线中的 CTLA41g 转基因小鼠,其皮肤肿瘤结节数量明显少于野生型小鼠(22),事实上,NK 细胞在皮肤癌细胞杀伤中发挥中重要作用(23)。综上所述,CTLA41g可通过阻断 T 细胞激活的共刺激信号通路抑制皮肤移植免疫排斥反应,其全身应用并不会显著增加机体感染和肿瘤形成的风险.同时,CTLA41g 可能对表面表达 CD80/CD86 分子且在控制感染和肿瘤形成的其重要作用的细胞
38、(如 NK 细胞)有调节作用(23)因此,我们提出如下科学问题:CTLA41g 是否因为与 NK 细胞表面 B7 分子结合增强 NK 细胞毒性而造成机体清除皮肤癌细胞(或其他肿瘤细胞)能力的增强?其机制如何?这些怍用可否解释 CTLA41g 在活体内使用后并不显著降低整体抵抗力的现象? 本实验通过体内、体外试验验证 CTLA41g 对 NK细胞功能是否具有调节功能,通过小鼠感染、烫伤和肿瘤模型验证上述调节作用,并初步探讨其分子机制。从而深化对 CTLA41g 免疫调节作用的认识,并为CTLA41g 应用于大面积烧伤治疗提供理论基础。我们将本研究获得的主要结果和结论归纳如下: 一、CTLA41g
39、 及其衍生物 Abatacept 是 NK 细胞强有力的激活剂 1、CTLA41g 在体外可明显增强人 PBMC 和 NK 细胞功能; 2、CTLA41g(Abatacept)在体内可显著增强小鼠 NK 细胞毒性; 3、CTLA41g增强人 NK 细胞毒性的作用是 CTLA4 分子依赖的; 4、CTLA41g(Abatacept)可增强机体抗肿瘤的能力。 二、我们对 CTLA41g(Abatacept)在大面积烧伤治疗中的新认识: 我们的前期研究结果(13)和文献报道(14)都证实注射CTLA41g 或创面局部应用 CTLA41g 重组腺病毒均可延长异体皮移植存活期,这就意味着 CTLA41g
40、 如果可以应用子烧伤患者将会抑制移植物排斥反应,延长移植物的存活时间。因此,我们利用绿脓杆菌感染模型和烫伤模型评价 CTLA41g用于烧伤患者治疗皮肤移植排斥反应的安全性,我们的研究首次发现使用Abatacept 不仅可以显著提高 Balb/c 小鼠清除绿脓杆菌的能力而且还能增强烫伤小鼠脾脏细胞的毒性,与体外的实验结果一致。这一研究发现提示 CTLA41g未来可用于大面积严重烧伤患者以诱导对皮肤移植物的免疫耐受,增强机体天然免疫力。这将是严重烧伤疾病治疗的重大突破。 三、CTLA41g 通过与 NK细胞表面 CD80/CD86 分子结合上调激活性受体 NKG2D 和 NKp44 表达,增强 N
41、K 细胞毒性功能: 1,CTLA41g 通过与 NK 细胞表面 CD80/CD86 分子的结合促进 NK细胞的毒性功能:本实验研究抗 CD80 抗体和抗 CD86 抗体对 NK 细胞有无调节作用。结果发现:抗 CD80 抗体和抗 CD86 抗体在体外可明显增强人 PBMC 对 K562细胞的毒性,且与 CTLA41g 组 NK 细胞毒性无明显差异。结合上述实验结果我们认为,CTLA41g 通过与 NK 细胞表面 CD80/CD86 分子的结合促进 NK 细胞的毒性功能。 2,CTLA41g 可上调 NK 细胞表面激活性受体 NKG2D、NKp44 的表达:我们采用流式细胞技术探讨 CTLA41
42、g 对 NK 细胞表面 NKG2D 和 NKp44 表达的调节作用。结果发现体外加入 CTLA41g 后,人 NK 细胞表面激活性受体NKG2D、NKp44 袁达明显上调,且程度与 IL-2 相似。FcR 受体与 NK 细胞结合不会导致 NKG2D、NKp44 表达上调。这一结果说明 NK 细胞表面激活性受体NKG2D、NKp44 的在 CTLA41g 增强 NK 细胞毒性功能的调节作用中可能发挥了重要作用。 总结: 一、CTLA4 在体内、体外均可增强 NK 细胞毒性; 二、CTLA41g 通过与 NK 细胞表面 CD80/CD86 分子结合上调 NK 细胞表面 NKG2D 和NKp44 的
43、表达,增强 NK 细胞功能; 三、CTLA41g 及其衍生物(如 Abatacept)在全身应用,可增强小鼠抗肿瘤和抗感染的能力,不增加患者罹患肿瘤及感染的几率,扩大了其临床应用的适应症; 四、CTLA41g 全身应用不仅可治疗皮肤移植物排斥反应,且可增加烫伤小鼠 NK 细胞毒性,减少播散性感染的发生,为 CTLA41g 应用于治疗烧伤患者提供了新思路; 五、我们发现 CTLA4 对于获得性免疫系统(T 细胞)和天然免疫系统(NK 细胞)截然不同的作用,这对我们深入了解免疫系统的调节和内环境的稳定具有重大意义,将为临床肿瘤生物治疗和大面积烧伤救治提供全新的理论基础和研究方向。大面积烧伤后,患者
44、免疫应答低下(1,2),容易发生感染,另一方面机体却对皮肤移植物产生强有力的排斥反应,因此在不增加患者感染几率的前提下提高异体皮的存活时间(即所谓免疫耐受的诱导),是大面积烧伤治疗的核心问题。 NK 细胞作为天然免疫系统最重要的细胞在机体杀伤肿瘤细胞和抵抗病原体(病毒、细菌等)感染中发挥着重要作用。NK 细胞的活化与否受控于 NK 细胞表面表达的抑制性受体(如 NKG2A)和激活性受体(如 NKG2D)的状态。然而,在大面积烧伤后,患者 NK 细胞毒性功能显著下降(26,27),是机体容易发生感染的重要原因之一。研究发现,院内获得性绿脓杆菌感染是烧伤感染和败血症发生的重要原因(3)。绿脓杆菌分
45、泌的外毒素可抑制 NK 细胞毒性和 IFN-y 的分泌(4),且对现在临床使用的大部分抗生素均耐药(5)。激活性受体 NKG2D 在 NK 细胞清除肺绿脓杆菌感染中起了关键作用(6,7),那么 NK 细胞功能的增强是否会降低机体播散性感染发生的几率呢? 在免疫耐受诱导的研究中,20 年前发现的 CTLA4以及在此基础上制备的重纽融合蛋白 CTLA41g 最令人瞩目。由于 CTLA41g 能高亲和力地结合抗原递呈细胞上的 CD80/CD86,阻断了共刺激信号,使 T 细胞不能接受第二信号,从而导致 T 细胞不应答,所以 CTLA41g 是 T 细胞活化中重要的负调节分子(8)。目前,CTLA41
46、g 的衍生物-Abatacept 和 Belatacept 分别被用于治疗自身免疫性疾病和控制器官移植免疫排斥反应(9-12)。我们的前期研究结果(13)和文献报道(14)也证实注射 CTLA41g 或创面局部应用 CTLA41g 重组腺病毒均可延长异体皮移植存活期,因此,CTLA41g 如果可以应用于烧伤患者将会抑制移植物排斥反应,延长移植物的存活时间。那么,在烧伤情况下使用CTLA41g 会加重烧伤后的病情和增加并发症及死亡率吗? Abatacept 是被美国 FDA 批准用于临床治疗类风湿关节炎的药物,由人 CTLA4 分子胞外区和突变的 IgGl Fc 段融合而成。奇怪的是,这-T 细
47、胞强有力的抑制剂应用于人体后,其肿瘤形成、病毒及细菌感染等副作用的发生率却比预期大大降低(15-17)。亦有研究证实,小鼠全身应用两倍剂量于人的药物浓度时,并不影响其抵抗肺结核感染的能力,但这一有悖于常理的现象的机制和意义还是未知数(18)。UrsulaGrohmann 发现,CTLA41g 与 DCs 表面 B7 分子结合后,向 DCs 胞内传递激活信号(19)。该研究说明,CTLA41g 对表达 CD80/CD86 分子的细胞有调节作用。另有报道,天然免疫系统中最重要的细胞-NK 细胞表面也表达 CD86 分子,且在某些条件下可表达 CD80 分子(20,21)。Beissert S 发现
48、,长期暴露于紫外线中的 CTLA41g 转基因小鼠,其皮肤肿瘤结节数量明显少于野生型小鼠(22),事实上,NK 细胞在皮肤癌细胞杀伤中发挥中重要作用(23)。综上所述,CTLA41g可通过阻断 T 细胞激活的共刺激信号通路抑制皮肤移植免疫排斥反应,其全身应用并不会显著增加机体感染和肿瘤形成的风险.同时,CTLA41g 可能对表面表达 CD80/CD86 分子且在控制感染和肿瘤形成的其重要作用的细胞(如 NK 细胞)有调节作用(23)因此,我们提出如下科学问题:CTLA41g 是否因为与 NK 细胞表面 B7 分子结合增强 NK 细胞毒性而造成机体清除皮肤癌细胞(或其他肿瘤细胞)能力的增强?其机
49、制如何?这些怍用可否解释 CTLA41g 在活体内使用后并不显著降低整体抵抗力的现象? 本实验通过体内、体外试验验证 CTLA41g 对 NK细胞功能是否具有调节功能,通过小鼠感染、烫伤和肿瘤模型验证上述调节作用,并初步探讨其分子机制。从而深化对 CTLA41g 免疫调节作用的认识,并为CTLA41g 应用于大面积烧伤治疗提供理论基础。我们将本研究获得的主要结果和结论归纳如下: 一、CTLA41g 及其衍生物 Abatacept 是 NK 细胞强有力的激活剂 1、CTLA41g 在体外可明显增强人 PBMC 和 NK 细胞功能; 2、CTLA41g(Abatacept)在体内可显著增强小鼠 NK 细胞毒性; 3、CTLA41g增强人 NK 细胞毒性的作用是 CTLA4 分子依赖的; 4、CTLA41g(Abatacept)可增强机体抗肿瘤的能力。 二、我们对 CTLA41g(Abatacept)在大面积烧伤治疗中的新认识: 我们的前期研究结果(13)和文献报道(14)都证实注射CTLA41g 或创面局部应用 CTLA41g 重组腺病毒均可延长异体皮移植存活期,这就意味着 CTLA41g 如果可以应用子烧