1、 过氧化氢酶米氏常数的测定一、 实验目的 了解并掌握米氏常数的意义和测定方法 二、 实验原理H2O2被过氧化氢酶分解出H 2O和O 2，未分解的H 2O2用KMnO 4在酸性环境中滴定，根据反应前后H 2O2的浓度差可求出反应速度。2H2O2 = 2H2O + O2 2KMnO4 + 5H2O2 + 3H2SO4 = 2MnSO4 + K2SO4 + 5O2 + 8H 2O 本实验由马铃薯提供过氧化氢酶。在保持恒定的条件下，用相同浓度的过氧化氢酶催化不同浓度的H 2O2分解。在一定限度内，酶促反应速度与H 2O2浓度成正比。用双倒数作图法(即以1/ v对1/S作图)可求得过氧化氢酶的Km值。三
2、、 实验器材锥形瓶(6个) 吸管、酸式滴定管四、 实验试剂1、0.02mol/L 磷酸缓冲液(pH=7) 2、0.004 mol/L KMnO4(需标定)3、0.05 mol/L H 2O2(需标定) 4、25% H 2SO4五、实验操作1、酶液的提取：称取马铃薯（去皮）5克，加0.02mol/L 磷酸缓冲液10mL，再加少量海砂，研磨成匀浆，离心(3000r/ min，10min)，上清液即为酶液。2、滴定：取干燥锥形瓶6只，按下表顺序加入试剂：瓶号 试剂/mL 0 1 2 3 4 50.05mol/L H2O2 0 1.00 1.25 1.67 2.50 5.00蒸馏水 9.50 8.50
3、 8.25 7.83 7.00 4.50酶液 0.5 0.5 0.5 0.5 0.5 0.5先加好0.05mol/L H2O2及蒸馏水，加酶液后立即混合，依次记录各瓶的起始反应时间。各瓶时间达5min时立即加2.0mL 25% H 2SO4终止反应，充分混匀。用0.004 mol/L KMnO4滴定各瓶中剩余的H 2O2至微红色，记录消耗的KMnO 4体积。六、实验计算分别求出15瓶的底物浓度S和相应的反应速度 v 。C1V110S =5 2 C2V2C1V1v = 式中 S：为底物物质的量浓度(mol/L) C1：为H 2O2物质的的量浓度(mol/L)V1：为H 2O2的体积(mL)10：反应的总体积v ：反应速度(mmol/min)C2: KMnO4物质的量浓度(mol/L)V2：KMnO 4的体积(mL)以1/ v对1/S作图求出Km。七、实验注意事项( 1 ) 按表先加H 2O2及蒸馏水。( 2 ) 准确控制各瓶中酶促反应时间尽量一致。( 3 ) 各种试剂的加量应准确。
