1、生物技术专业核心课程,基 因 工 程,6 目的基因的克隆与分离鉴定,基因克隆与基因分离,1、克隆,个体水平上的克隆,细胞水平上的克隆,分子水平上的克隆,2、基因克隆,分子水平上的克隆，将某一段DNA或一个基因插入到一个载体分子上，并导入特定的宿主细胞中，形成寄主/载体单元，称为一个克隆。,3、基因分离,从复杂的基因组中分离出单个具特定功能或特性的基因或DNA片段。,该基因的功能或序列并不一定要了解。,基因工程或DNA重组技术的前提条件是从生物 体基因组中分离克隆目的基因。,确定其表达调控机制和生物学功能；,建立高效表达系统，构建具有经济价值的基因工程菌 （细胞）；,将目的基因在体外进行必要的结
2、构功能修饰；,然后转入受体细胞内改良生物体的遗传性状，包括人 体基因治疗。,一般来说，目的基因的克隆战略分为两大类：,另一类是利用PCR扩增技术甚至化学合成法体外直接合成目的基因，然后将之克隆表达。,一类是构建感兴趣的生物个体的基因文库，即将某生物体的全基因组分段克隆，然后建立合适的筛选模型从基因组文库中挑出含有目的基因的重组克隆；,第一节 目的基因的克隆,C PCR法,B cDNA法,A 鸟枪法,D 化学合成法,E 基因文库的构建,一、 鸟枪法,鸟枪法克隆目的基因的基本战略,(一)鸟枪法克隆目的基因的基本战略,鸟枪法（shot-gun approach)：随机克隆供体细胞的全基因组DNA片段
3、，然后通过快速有效的筛选程序从众多克隆中分离出含有目的基因的目的重组子，进而获得目的基因。,鸟枪法适用于原核细菌目的基因的克隆分离。,1.染色体DNA的切断,超声波处理：片段长度均一，大小可控，平头末端；,全酶切：片段长度不均一，粘性末端便于连接，但有可能使目的基因断开，大小不可控；,部分酶切：片段长度可控，含有粘性末端，目的基 因完整。,2.与载体连接,如果转化子采用菌落原位杂交法或限制性酶切图谱法 筛选，则选择多拷贝克隆载体；,如果转化子采用基因产物功能检测法筛选，则选择表 达型载体；,3.转化受体细胞,如果转化子采用基因产物功能检测法筛选，则选择能使目的基因表达的受体细胞；,4.筛选含有
4、目的基因的目的重组子,菌落原位杂交法、基因产物功能检测法（筛选模型的建立）,如果转化子采用菌落原位杂交法或限制性酶切图谱法筛选，则选择大肠杆菌作为的受体细胞。,问题,鸟枪法获得的克隆群体庞大,以人的基因组为例，如果载体承受外源DNA片段 的能力为1-3kb；那么,人类基因组DNA需被切割成 几十万个大小不等的片段；,每个片段都分别插入到一个载体分子上，这样就 会形成由几十万个不同的重组分子组成的克隆群体；,要想从如此巨大的克隆群体中筛选带有目的基因 的克隆，显然是非常费事的。,(二) 鸟枪法操作的改进,如果已知目的基因两端的酶切位点，可用该酶处理染色体DNA，然后与载体拼接，这样可以保证目的基
5、因的完整性，从而提高重组子中目的重组子的出现频率。,使用特征性限制性内切酶切开染色体DNA,使用这一改进方法的前提条件是：目的基因的酶切图谱已知。,例如，已知某目的基因位于1.8 kb 的SalI片段中，将染色体DNA用SalI 切开，琼脂糖凝胶电泳分离；,在连接前将DNA片段进行分级分离,2.0 kb,1.6 kb,1.8 kb,用刀片切下相当于1.6 - 2.0 kb大小 区域内的凝胶块，从此凝胶块中回收 DNA片段，然后与载体进行拼接。,凝胶DNA片段回收技术,凝胶DNA片段回收程序,1.切胶回收于离心管中；,2.加入等体积的溶液I；,3.50-60水浴加热约10分钟至胶融解；,4.加入
6、到DNA纯化柱内，室温放置1分钟；,5.离心1分钟，倒弃收集管内的液体；,6.加入700微升溶液II，室温放置1分钟；,7.离心1分钟，洗去杂质；,8.加入500微升溶液II，最高速离心1分钟；,9.将DNA纯化柱置于1.5ml离心管上，加入30ul溶液III至管内柱面上，放置1分钟；,10.高速离心1分钟，所得液体即为高纯度DNA。,(三)鸟枪法克隆目的基因的局限性,二、cDNA法,(一) cDNA法克隆目的基因的基本战略,mRNA,1.cDNA第一链的合成,TTTTTTTTTTTTTTp5,cDNA第一链,引物,退火,逆转录酶,dNTPs,2.cDNA第二链的合成,煮沸,NaOH,自身引导
7、法：获得的双链cDNA 5端会有几对碱基缺失,AAAAAAAAAAAAAAOH 3,OH 3,Klenow,dNTPs,S1,DNApol dNTPs,RNaesH,置换合成法：获得的双链cDNA 5端也会有几对碱基缺失,TTTTTTTTTTTTTT p5,S1,3,T4-DNA ligase,dCTP,TdT,引导合成法：获得的双链cDNA 能保留完整的5端序列,TTTTTp5,5 pGGGGGGG,NaOH,退火,Klenow,dNTPs,3.双链cDNA的克隆,双链平头的cDNA与载体的连接：,(二) cDNA法克隆目的基因的局限性,三 PCR法,使用PCR法克隆目的基因的前提条件是：已
8、知待扩增目的基因或DNA片段两侧的序列，根据该序列化学合成聚合反应必需的双引物。,(一)PCR法定向扩增目的基因的基本原理,PCR（Polymerase Chain Reaction）法，又称为聚合酶链反应或PCR扩增技术，是一种高效快速的体外DNA聚合程序。,目的基因,变性,加热,引物,退火,底物,聚合,加热,变性,退火 引物,底物,聚合,加热,变性,引物,退火,底物,聚合,由Taq DNA聚合酶扩增的PCR产物中，其3末端总是会带有一个非模板依赖型的突出碱基，而且这个碱基几乎总是A，因为Taq DNA聚合酶对dATP具有优先聚合活性。由于该突出碱基的存在，克隆时即可以采取TdT末端加同聚尾
9、的方法与载体拼接，也可以使用专门的T载体克隆。,(二) PCR克隆目的基因的基本程序,5,5,A,A,T,T,5,5,PCR扩增产物,T 载体,T7,lacZ,MCS,ori,Apr,四 化学合成法,一、化学合成DNA的发展,二、化学合成寡核苷酸片段的主要方法 磷酸二酯法 磷酸三酯法 亚磷酸三酯法 固相合成法 自动化法,(Chemical Synthesis of the Gene ),三、化学合成DNA（寡核苷酸）的应用,作为合成基因的元件 作为测序的引物 作为核酸分析杂交的探针 用于基因定点诱变研究 作为PCR反应的引物 作为重组DNA连接等的构件,(一)化学合成法的基本战略,全基因合成,
10、化学合成目的基因的前提条件是基因的DNA序列已知，有三种战略：,1.小片段粘接法：,混合退火,根据目的基因全序列，分别合成12-15碱基长的单链DNA小片段,T4-DNA连接酶连接,连接入合适的载体,2.补钉延长法：,混合退火,根据目的基因两条互补链全序列，分别合成12-15碱基长的单链DNA小片段以及20-30碱基长的单链DNA中片段,T4-DNA连接酶连接,克隆入合适的载体,Klenow酶聚合,3.大片段酶促法：,混合退火,根据目的基因的全序列，分别合成40-50碱基长的单链DNA片段,T4-DNA连接酶连接,克隆入合适的载体,Klenow酶聚合,(二)化学合成的单元操作,化学合成DNA的
11、实质是按照序列要求将脱氧核苷酸单体一个 个接上去，每接一个单体就是一个循环反应，包括：基团保护、 缩合、氧化、去保护等步骤；,从反应机理上来讲，DNA化学合成有磷酸二酯法、磷酸三酯法、 亚磷酸液三酯法；具体操作过程又有液相合成和固相合成两种形 式；,前者操作繁琐，基本上已淘汰；后者反应中间物的分离程序简便，DNA合成仪就是根据固相亚磷酸液三酯法原理设计的。,化学合成的单元操作,O,H,G,H,H,H,H,O,CH,2,O,DMT,P,O,Me,N,CH,Me,Me,CH,Me,Me,H,DMT： 二甲氧基三苯甲基,激活,缩合,氧化,脱取代基,玻璃珠,连接臂,O,(三) DNA化学合成的用途,合
12、成天然基因,修饰改造基因,设计新型基因,制备探针、引物、接头,如生长激素释放抑制素基因、脑啡肽基因、胰岛素基因、 干扰素基因等。,如组织型纤溶酶原激活剂基因、尿激酶原基因等。,全基因合成的问题,上述三种方法各有利弊：化学合成DNA的单片段愈 短，收率就愈高，但由于化学合成的份额较大，成本 较高；,在大片段酶促法合成目的基因时，虽然化学合成的 份额相对较小，成本较低，但大片段化学合成的收率 极低，例如，每聚合一个单体的产物收率为95%，则 合成50个碱基长的DNA单链大片段的总收率只有7.7%,第一节 目的基因的克隆,三、PCR法,二、cDNA法,一、鸟枪法,四、化学合成法,五、基因文库的构建,
13、五、基因（组）文库的构建,(一) 基因文库的基本概念,基因库与基因文库,基因库（gene pool）,特定生物体全基因组的集合（天然存在）,基因文库（gene library or gene bank）,将特定生物个体的全部DNA片段连接入载体DNA分子上，并 导入受体细菌或细胞中，经扩增产生的包含该生物全部基因 组序列的克隆群体。（人工构建）,根据构建方法的不同，基因文库分为：,基因文库构建的基本战略,用鸟枪法构建基因组文库，材料来自染色体DNA。,用cDNA法构建cDNA文库，材料来自mRNA。,在高度分化的生物体中，不同组织和细胞在不同时段的mRNA种类不同（即基因的表达谱不同），因此同
14、种生物体的cDNA文库一般还有组织细胞的界定，如肝组织cDNA文库或胚胎组织cDNA文库等。很显然， cDNA文库的信息量远小于基因组文库。,1.重组克隆的总数不宜过大，以减轻筛选工作的压力；,2.载体的装载量最好大于基因的长度，避免基因被分隔克隆；,3.克隆与克隆之间必须存在足够长度的重叠区域，以利克隆排序；,4.克隆片段易于从载体分子上完整卸下；,5.重组克隆能稳定保存、扩增、筛选；,6.具有较高的完备性。,基因文库的质量标准,基因文库的完备性是指：在构建的基因文库中任一基因存在的概率，它与基因文库最低所含克隆数N之间的关系可用下式表示：,N = ln ( 1 P ) / ln ( 1 f
15、 ),其中： P = 任一基因被克隆（或存在于基因文库中）的概率,f = 克隆片段的平均大小/生物基因组的大小,基因文库的完备性,例如，人的单倍体DNA总长为2.9x109bp，基因文库中 克隆片段的平均大小为15kb,则构建一个完备性为0.9 的基因文库至少需要45万个克隆；,而当完备性提高到0.9999时,基因文库至少需要180万 个克隆。,（二）基因文库的构建程序,1.基因组DNA的制备,为了最大限度地保证基因在克隆过程中的完整性， 用于基因 组文库构建的DNA在分离纯化操作中应尽量避免过度的断裂；,制备的DNA分子量越大，经切割处理后样品中含有不规则末 端的DNA片段的比率就越低，重组
16、率和完备性也就越高。,2. 基因组DNA的切割,用于基因组文库构建的DNA片段的切割一般采用超声波处理和限制性内切酶部分酶切两种方法，其目的是：,第一，保证DNA片段之间存在部分重叠区,第二，保证DNA片段大小均一,超声波处理后的DNA片段呈平头末端，需加装人工接头；,部分酶切法一般选用四对碱基识别序列的限制性内切酶，如： Sau3A I或Mbo I等，这样DNA酶解片段的大小可控；,连接前，上述处理的DNA片段必须根据载体的装载量进行分级 分离，以杜绝不相干的DNA片段随机连为一体！,3. 载体和受体的选择,出于压缩重组克隆的数量，用于基因组文库构建的载体通常选装载量较大的-DNA或考斯质粒
17、；,对于大型基因组（如动、植物和人类）需使用YAC或BAC载体；,由于绝大多数真核生物的mRNA小于10 kb，因此用于cDNA文库构建的载体通常选质粒。,-DNA,上述几种载体的最大装载量如下：,质粒,考斯质粒,15 kb,25 kb,45 kb,BAC,300 kb,YAC,400 kb,用于基因文库构建的受体则根据载体使用大肠杆菌或酵母菌,4. 基因文库构建的技术性问题,在基因组文库的构建过程中，最应引起重视的问题是：,避免外源DNA片段之间的连接！,为了避免上述情况的发生，可采取下列措施的组合：,第二节 基因的分离,一、基于基因功能的基因分离技术 二、基于DNA插入作用的基因分离技术
18、三、基于基因图谱的基因分离技术,一、基于基因功能的基因分离技术,1、已知目的基因的氨基酸序列 2、根据基因的同源性分离目的基因 3、根据mRNA的特异性分离目的基因,1、已知目的基因的氨基酸序列（功能克隆）,将纯化的蛋白质进行氨基酸测序，根据某些蛋白 质的氨基酸保守性合成寡核苷酸探针从cDNA库或基 因组文库中筛选编码基因；,将相应的编码蛋白制成相应抗体探针,从cDNA载 体表达库中筛选相应克隆。,根据某些蛋白质的氨基酸保守性设计特异引物， PCR扩增出目的基因；,某段连续氨基酸序列的简并探针的序列设计,Cys Met Asp Glu Met Lys Arg Asn Ile,TGT ATG G
19、AC GAA ATG AAA AGA AAC ATA,C T G G G T T,C,TGTATGGACGAAATGAA,此外还可以参考各种生物体的EST数据库进行倾向性简并序列设计,总探针类型：2222=16,密集铺板（1-10万）,杂交,挖取,铺板,铺板,目的重组克隆,文库筛选,评价 优点 - 在单基因性状的基因分离方面仍为常用策略 缺点 - 特异蛋白质确定、鉴定及其纯化困难*- 难以分离微量表达基因- 无法研究无蛋白质产物的基因- 难以进行多基因控制性状的基因分离,根据近缘物种间或进化关系较近的物种间功 能相关的基因间核苷酸序列的保守性，设计 探针，从基因文库中筛选并鉴定目的基因。,2、
20、根据基因的同源性分离目的基因,文库筛选法,保守序列,保守序列,5个MYB转录因子基因的比对结果,A. cDNA的合成,cDNA末端快速扩增(rapid amplification of cDNA ends, RACE),以mRNA为模板，用依赖于RNA的DNA聚合 酶(反转录酶)来催化合成cDNA。目前商品化反 转录酶有禽类成髓细胞病毒(AMV)逆转录酶和 鼠白血病病毒(MLV)反转录酶。,B. 同源片段的克隆,简并引物的设计,利用DNAman、DNAstar等软件对GENbank中已公 布的欲克隆的同源基因的氨基酸和核苷酸序列进行同 源分析，然后，根据基因的保守区设计合成一对简并 引物。,简
21、并引物:是指编码单个氨基酸的所有不同碱基可能 性的不同序列的混合物。,为了增加特异性,可以参考密码子使用表,根据不同生 物的碱基使用偏好,减少简并性。,Gene1:,TTC TAT CAC GAG TGC TGG,Phe Tyr His Glu Cys Trp,TTT TAT CAT GAA TGT TGG,Gene2:,Degenerate Primer: 5-TT(T/C) TAT CA(T/C) GA(A/G) TG(T/C) TGG-3,氨基酸序列:,为了增加特异性，可以参考密码子使用表，根据不 同生物的碱基使用偏好，减少简并性。,简并PCR扩增同源片段,琼脂糖凝胶电泳对PCR产物进行
22、鉴定；用洁净的刀 片在长紫外灯下切下含有目的DNA片段的琼脂糖凝胶， 放入1.5ml的微量离心管中；PCR产物回收试剂盒回收 目的片段。,将回收的PCR产物连接至pMD18-T载体上，转化大 肠杆菌感受态，克隆目的片段，并测序鉴定。,C. cDNA 3末端序列的克隆,3RACE引物的设计,根据已获得的基因的同源片段，设计基因特异的 巢式引物(nested PCR primer)。GSP1和GSP2，巢式 PCR扩增cDNA 3末端序列。,RNA的提取及cDNA的合成,方法同前，但反转录引物不同(带有接头序列)：,QT: 5-GCTGTCAACGATACGCTACGTAACGGCATGACAGT
23、G(T)18-3,可利用此接头序列设计两条接头引物Q1和Q2。,Q1,Q2,巢式PCR扩增3-端cDNA,以QT引物反转录获得cDNA为模板，分别用基因 特异引物GSP1与通用引物Q1进行第一轮PCR；,将第一轮PCR产物稀释100倍作为模板，分别用基 因特异引物GSP2与通用引物Q2进行第二轮巢式PCR；,0.8%的琼脂糖凝胶电泳，回收PCR产物并连接至 T载体，转化大肠杆菌DH-5，利用-互补及菌落 PCR筛选阳性克隆，并送测序公司测序。,图 ZmABC1-10 基因全长cDNA克隆,D. cDNA 5末端序列的克隆,5RACE引物的设计,根据已获得的基因的同源片段，设计基因特异的巢式 引
24、物（nested PCR primer）。GSP1和GSP2，巢式PCR 扩增cDNA 5末端序列。,1）TaKaRa公司RACE原理,添加接头序列,以RNaseH分解掉cDNA-RNA杂交体中RNA；,利用一5端磷酸化的特异性引物对mRNA进行反 转录形成5端磷酸化的cDNA第一链；,在T4RNA连接酶的作用下将单链cDNA环化或首 尾相连；,用两对基因特异性引物：A1、S1及A2、S2分别 进行二次PCR扩增得到所需目的片段,2） Clontech公司的SMART 5 -RACE的原理,以Oligo(dT)30MN作为锁定引物在反转录酶M-MLV作用下，反转录合成标准第一链cDNA；,利用
25、该反转录酶具有的末端转移酶活性，在反转录达到第一链的3末端时自动加上3-5个(dC)残基，退火后(dC)残基与含有SMART寡核苷酸序列Oliogo(dG)通用接头引物配对后，转换为以SMART序列为模板继续延伸而连上通用接头；,然后用一个含有部分接头序列的通用引物UPM（Universal Primer）作为上游引物，用一个基因特异引物（Gene Specific Primer，GSP）作为下游引物，PCR扩增目的基因5末端的cDNA片段,3）Invitrogen的 GeneRACER 5 -RACE的原理,5 mRNA CAP,3 Poly A tail,Full-length mRNA,
26、Truncated mRNA,Non-mRNA,CIP,去磷酸化反应: 利用碱性磷酸酶(如牛小肠碱性磷酸酶，CIP)处理，水解掉RNA 5末端的磷酸。但CIP不能破坏mRNA5末端的帽子结构；,去帽反应： 利用烟草焦磷酸酶Tobacco Acid Pyrophosphatase （TAP）消化掉mRNA5末端的帽子结构；,m7 G-P-P-P,AAAAAAAAAAAA,TAP, 接头连接： 将经去磷酸化和去帽处理的RNA转入另一PCR管中，加入RNA接头片段，在RNA Ligase 作用下，将RNA Oligo接头连接于去帽的mRNA5末端；,RNA Ligase,RNA Oligo, 反转录
27、：在反转录酶的作用下，利用Oligo(dT)反转录获得cDNA;,RT,TTTTTTTTTTTTT, 巢式PCR：利用接头的通用引物UP（Universal Primer）和基因特异引物，巢式PCR获得基因5片段。,UP,GSP,5cDNA, 巢式PCR扩增全长cDNA： 根据已获得目的基因的3序列和5序列，设计基因特异的巢式引物5GSP和3GSP，巢式PCR扩增cDNA全长序列。,5GSP,3GSP,PCR,差别杂交 Differential hybridization 扣除杂交 Substractive hybridization 抑制性消减杂交Suppression substracti
28、ve hybrid 差别显示 Differential display 基因芯片技术 Gene chips,3、根据mRNA的特异性分离目的基因,差别杂交(Differential hybridization)又叫差别筛选 (Differential screening)，适用于分离经特殊处理而被 诱发表达的mRNA之cDNA克隆。,差别杂交的技术基础十分简单，它不需要任何有关 目的基因的核苷酸序列信息，但重要的是要拥有两种 不同的细胞群体。,3.1 差别杂交,1）差别杂交的操作程序,mRMA,mRMA,cDNA探针,cDNA探针,cDNA,cDNA文库,表达目的基因mRNA的细胞,不表达目的
29、基因 mRNA的细胞,原初平板,影印,影印,2）差别杂交的局限性,差别杂交的灵敏度比较低，特别是对于那些低丰 度的mRNA而言，这个缺点就显得更为突出。,差别杂交需要筛选大量的杂交滤膜，鉴定大量的 噬菌斑或克隆片段，因此成本较高、工作量较大。,由于两套平行转移的滤膜之间，DNA的保有量往 往会有差别，导致杂交信号的强度不一致，从而降 低了此法的可重复性。,不表达目的基因 的总mRNA,表达目的基因 的总mRNA,cDNA,杂交,DNA-RNA 杂交分子,游离的单链 mRNA分子,3.2 扣除(消减)杂交(Subtractive hybridization),差异分离程序,利用两组细胞mRNA种
30、类的差异，分离克隆差异mRNA所对应的cDNA，因而这种程序较适用于分离克隆新基因例如：正常的大鼠FR3T3成纤维细胞中，有些新基因是不能自发表达的，需在多瘤病毒感染之后方可转录。 任务是：分离克隆这些新基因，进而研究其生物学功能。,多瘤病毒感染的FR3T3细胞,正常的FR3T3细胞,总mRNA,总mRNA,cDNA,双链cDNA,单链cDNA,提取mRNA,合成cDNA,合成第二链,克隆,提取mRNA,共价交联,上柱,原位杂交,病毒诱导表达的基因 cDNA克隆,3.3 抑制性消减杂交(Suppression Subtractive Hybridization, SSH),SSH的核心技术是抑
31、制性PCR，它是一种将检测子cDNA单链标准化步骤和消减杂交步骤融为一体的技术；,抑制性PCR是利用链内复性优先于链间复性的原理，是非目标序列片段两端的长反向重复序列在复性时产生“锅柄样”结构或“发夹结构”而无法与引物配对，从而选择性地抑制了非目标序列的扩增。,(In excess),总mRNA （B）,总mRNA （A）,cDNA,cDNA,电泳，显影,比较差异条带,RT-PCR （加入已标记的dCTP),3.4 差别显示(Differential display),基因芯片(gene chip),基因芯片又称为DNA微阵列(DNA microarray)，它是 指通过微电子技术和微加工技术
32、将大量特定序列的探针 有序地固定于支持物上，然后与标记的样品进行杂交， 通过杂交信号的强弱检测靶分子的一种检测工具。,基因芯片技术上的特点是具有高度可行性、多样性、 微型化和自动化四大特点。,激光共聚焦荧光扫描显微镜检测杂交信号,二、基于DNA插入作用的基因分离技术,1、原理：,由于插入的DNA序列相当于人为地给目的基因加上一个序 列标签，因此用此DNA插入突变分离基因的技术又称为DNA 标签法(DNA tagging).,当一段特定的DNA序列插入到基因组中某一个基因的内 部或其邻近位点时，便会诱发该基因发生突变，并最终导 致表型变化，形成突变体。如果此段DNA插入序列是已知 的，则可作为D
33、NA杂交的分子探针，从突变体基因组DNA 文库中筛选到突变基因。再以突变基因为探针，从其原始 个体的基因组DNA文库中筛选目的基因。,利用转座子的转座作用使被插入的目的基因突变失去活性，而转座子的删除作用又可使目的基因复活。,2、转座子标签法（Transposon tagging),根癌农杆菌中的Ti质粒上的T-DNA区可转移入特 定的宿主细胞中，并整合到基因组DNA上，从而可 作为特定的标签序列。,3、T-DNA标签法（T-DNA tagging),三、基于基因图谱的基因分离技术,图位克隆(map-based cloning)又称定位克隆(positional Cloning)，1986年首
34、先由剑桥大学的Alan Coulson提出。,用该方法分离基因是根据目的基因在染色体上的位置 进行的，无需预先知道基因的DNA序列，也无需预先知 道其表达产物的有关信息。,1、原理：,在利用分子标记技术对目的基因进行精确定位的基础上，使用与目的基因紧密连锁的分子标记筛选DNA文库，从而构建目的基因区域的物理图谱，再利用此物理图谱通过染色体步行逼近目的基因或通过染色体登陆的方法最终找到包含该目的基因的克隆，最后通过遗传转化和功能互补验证最终确定目的基因的碱基序列。,构建遗传分离群体：F2、BC、DH、RIL 找到与目标基因紧密连锁的分子标记； 用遗传作图和物理作图将目标基因定位在染色体的特定位置
35、； 构建含有大插入片段的基因组文库(BAC或YAC库)； 以与目标基因连锁的分子标记为探针筛选基因组文库； 用获得阳性克隆构建目的基因区域的跨叠群； 通过染色体步行、登陆获得含有目标基因的大片段克隆； 通过亚克隆获得带有目的基因的小片段克隆； 通过遗传转化和功能互补验证最终确定目标基因的碱基序列。,2、图位克隆基本程序,高密度的分子标记图谱,3、要求：,与目的基因紧密连锁的分子标记,高质量的基因组DNA文库,连锁分析需要依赖特定的序列作为连锁标记，即 标记序列与待研基因之间存在连锁关系，而满足与 待研基因相连锁的标记实在太少，所以连锁分析对 克隆大多数基因存在着一定的困难。,RFLP的出现使多
36、态性基因标记存在于整个基因组内， 解决了连锁分析中难以克服的困难。,1980年Wyman等科学家首次建立了限制酶切片段长度 多态性RFLP(restriction fragment length polymorphism)， 使对任何一种表型相关的基因的定位成为可能。,其它常用是分子标记,随机扩增多态性DNA (Random Amplified Ploymorphic DNA, RAPD ),由Williams等于1990年创立。此技术建立于PCR基础之上， 使用一系列具有10个左右碱基的随机引物，对基因组的DNA 进行PCR扩增，以检测其多态性；,由于整个基因组中存在众多反向重复序列，因此，
37、单一引物可与反向重复序列结合，使重复序列之间的区域得以扩增其多态性；,引物结合位点DNA序列的改变，以及两扩增点之间DNA碱基的缺失、插入或置换均可导致扩增片段数目和长度的差异，从而表现出多态性；,简单重复序列（Simple sequence repeats，简称SSR）,在生物基因组中，均存在着许多由2-5个碱基对组成的 简单重复序列，或称微卫星DNA(Microsatellite Repeat)、 如(GA)n,(AC)n,(GAA)n（其中n为重复次数）等；,微卫星DNA其两端的序列高度保守，可设计双引物进行 PCR扩增，揭示其多态性。,SSR标记,扩增片段长度多态性 （Amplifie
38、d Fragment Length Polymorphism，AFLP）,由Zabeau和Vos于1993年发明。扩增片段长度多态性， 又称选择性限制片段扩增先将DNA用内切酶酶解，然后 接上接头，根据接头的序列和酶切位点设计引物,进行 特异性PCR扩增；,该技术结合了RFLP的稳定性和PCR技术的简便高效性，同时又能克服RFLP带型少、信息量小以及RAPD技术不稳定的缺点，是一种十分理想和高效的遗传标记。,AFLP 标记,High percentage of polymorphic bands No prior sequence knowledge required Highly repro
39、ducible AFLP fingerprints Genome survey Saturation of target gene,STS由Olson于1989年开发成功。STS是指基因组中长度为200-500bp,且核苷酸顺序已知的单拷贝序列,通过PCR 可将其专一扩增出来，电泳显示扩增产物多态性；,序列标志位点 (Sequence Tagged Sites，STS),STS通过设计特定的引物，使其与基因组DNA序列中特定 结合位点结合，从而可用来扩增基因组中特定区域，分析 其多态性；,其最大优点是：产生信息非常可靠。,SNP标记是美国学者Lander E.于1996年提出的第三代 DNA遗
40、传标记。SNP是指同一位点的不同等位基因之间仅 有个别核苷酸的差异或只有小的插入、缺失等。从分子 水平上对单个核苷酸的差异进行检测，SNP标记可帮助 区分两个个体遗传物质的差异；,单核苷酸多态性(Single Nucleotide Polymorphism，SNP),SNP的分布密集，在人类基因组中被认为有300万个以 上的SNP遗传标记,这可能达到了人类基因组多态位点数 目的极限，因此被认为是应用前景最好的遗传标记物。,以含有最靠近目的基因的分子标记的基因组DNA 克隆作为起始克隆，选末端序列作为探针,从基因 组DNA文库中筛选出与起始克隆具有重叠序列的新 克隆，依此向目的基因方向移动,最终将含目的基 因的克隆筛选出来。,4、染色体步移 (Chromosome walking)：,本章要点,1. 概念,基因文库,鸟枪法,4) 使用PCR法克隆目的基因的前提条件,2. 简答,1)鸟枪法克隆目的基因的局限性,基因库,2) cDNA第二链的合成方法,3) cDNA法克隆目的基因的局限性,基因文库的完备性,简并引物,基因芯片,7) 基因文库的质量标准,8) 在基因组文库的构建过程中，避免外源DNA 片段之间的连接的措施,5) 化学合成法的三种基本战略,6) DNA化学合成的用途,
