1、1/46,目的基因,需要克隆的DNA片段。,编码某种蛋白质,研究某基因结构和功能的关系,研究某基因与疾病的关系,2/46,目的基因的获取/制备,人工合成,cDNA文库 基因组文库,聚合酶链式反应,1. 基因文库,2. cDNA文库,3.人工合成,4. PCR,3/46,基因组文库(genomic library),4/46,分离基因组DNA,DNA片段与载体连接,导入细胞,筛选,限制性内切酶,基因组DNA,基因重组,转化细菌,体外包装,5/46,以 l 噬菌体制作基因 组文库 , 在一个基因组文库面 ， 所有可能的 基因皆被大量复制 。 利用探针筛选特定基因 。,6/46,组织或细胞染色体DN
2、A,基因片断,克隆载体,重组DNA分子,含重组分子的转化菌,限制性内切酶,受体菌,基因组文库存在于转化细胞内由克隆载体所携带的所有基因组DNA片段的集合.,从基因组文库获取目的基因,每个细胞含有一个基因组DNA片段与载体的重组DNA分子，许多细胞组成一个含有基因组各DNA片段克隆的集合体.,genomic library,7/46,基因库是通过重组技术转化筛选而建立，利用低等生物如细菌、病毒、噬菌体等生长快、繁殖能力强的特点作为一种核酸扩增的载体，把人类等高等生物的基因或其片段重组其中，成为便于保存、取用方便的基因库。建立基因库的目的是为了便于目的基因的保存、扩增和纯化。,8/46,基因组文库
3、的质量评价和完备性,基因组文库必须包括一定数量的重组子才可能克隆基因组中的任何序列。基因组文库完备性是指从基因组文库中筛选出含有某一目的基因的重组克隆的概率。如果满足两个条件：生物体染色体DNA片段被全部克隆，用于构建基因文库的DNA片段含有完整的基因，则此基因文库的完备性就是1。用基因组文库的克隆数表示基因组文库的大小即库容量。,9/46,1.理论值,基因组文库的克隆数目（N）,基因组DNA总长,DNA插入片段的平均长度,某种生物基因组DNA总长度为3106 kb，酶切后的DNA片段平均长度为15 kb，则基因组文库的克隆数应为 3106 kb/15 kb= 2105个克隆。在实际工作中，由
4、于在基因组文库的构建过程中存在多步操作，一个具备完好代表性的基因组文库的库容量大大超过这个理论值。,10/46,2.经验值,ln(1f/g),N =,ln(1P),P为从文库中选出任一基因或DNA序列的概率即完备性，一般 设为99（0.99）； f为载体容量（kb）； g为基因组大小（kb）； N为基因组文库的克隆总数，表示文库中以P概率出现某段DNA,理论上应具有的最少克隆数；,11/46,人单倍体DNA总长为3109bp 若载体装载量为15kb 则构建完备性为 0.9 的基因组文库 大约需要 个重组克隆.,完备性 0.99 0.999 0.9999,46万,库容量 92万 138万 184
5、万,?,12/46,表 几种典型生物基因组文库大小与载体容量的关系,13/46,选择载体的主要参数是基因组大小,构建大肠杆菌（4.6106bp）等基因组较小生物的基因组文库时，按每个DNA片段平均长5kb计算，一个包括5000个DNA片段克隆的基因文库就能够代表一个完整的大肠杆菌基因组序列，采用质粒作为载体便可得到满意的结果。 构建较大基因组的文库时，噬菌体、粘粒及YAC常选作克隆载体。 基因组文库分为：质粒文库、噬菌体文库、粘粒文库、人工染色体文库（细菌人工染色体文库、酵母人工染色体文库等）。,14/46,可获得的基因,HGP,对比分析内含子、外显子及调控区域,基因原始结构功能的研究,应用范
6、围,该种生物所有基因,15/46,cDNA文库(cDNA library),16/46,逆转录,以单链RNA为模板合成双链DNA的反应。,17/46,逆转录病毒细胞内的逆转录现象：,逆转录现象说明：至少在某些生物，RNA同样具有遗传物质的传代与表达功能。,18/46,逆转录酶的应用:,应用于基因工程,基因,mRNA,蛋白质多肽链,19/46,尿素-氯化锂法 硫氰酸胍法 polyT亲和层析法 密度梯度离心分级法 探针筛选法,mRNA的提取与纯化,20/46,polyT亲和层析法,polyT,polyT,polyT,21/46,基因重组,反转录酶,mRNA,cDNA,cDNA文库的组建,1.mRN
7、A提取 2.cDNA合成 cDNA第一链的合成cDNA第二链的合成 3.双链cDNA的分子克隆 4.双链cDNA克隆进质粒或噬菌体载体并导入宿主中繁殖.,22/46,mRNA分离纯化,反转录合成cDNA,构建cDNA文库,筛选目的基因,23/46,反转录合成单链cDNA,24/46,置换合成法合成cDNA第二链,25/46,引物-衔接头法合成cDNA第二链,26/46,包含着细胞全部mRNA信息的cDNA克隆集合称该组织细胞的cDNA文库.,基因组基因在特定的组织细胞中只有一部分表达，且在不同条件、不同分化时期的细胞其基因表达的种类和强度也不尽相同，cDNA文库具有组织细胞特异性。,27/46
8、,cDNA文库的质量评价,高丰度mRNA的cDNA 克隆所占的比例高，分离容易， 低丰度mRNA的cDNA克隆所占的比例低，分离困难。,mRNA根据其在细胞中的拷贝数即丰度,低丰度：拷贝数在1至15间,中等丰度：拷贝数在100至1000间,高丰度：拷贝数在1,000至10,000间,28/46,1.文库的代表性,cDNA文库代表性指文库中包含的重组cDNA分子反映来源细胞中表达信息(即mRNA种类)的完整性，可用库容量来衡量，指构建的原始cDNA文库中所包含的重组子克隆数，库容量取决于细胞中表达出的mRNA种类和每种mRNA序列的拷贝数。cDNA文库库容量理论估算： 细胞总mRNA分子数/细胞
9、中某种mRNA的拷贝数。,某细胞的mRNA分子数为500 000，某个丰度为3500拷贝/细胞的mRNA基因，最小值为500 000/3500=143，丰度为14拷贝/细胞的mRNA基因，最小值为500 000/14=35 714,29/46,经验值计算,构建一个完整的cDNA文库，不论mRNA丰度高低，都要包含任一种mRNA的cDNA克隆，最低要求的cDNA文库的库容量公式：N=ln（1-P）/ln（1-n/T）,n为细胞中某种（常指最稀少）mRNA的拷贝数； T为细胞中表达出的所有mRNA的总拷贝数。 P为文库中任何一种mRNA序列信息的概率，通常设为99； N为文库中以P概率出现在细胞中
10、任何一种mRNA序列理论上应具有的最少克隆数；,30/46,2.序列的完整性,除代表性外，文库中基因或cDNA片段的序列完整性（所含基因是否完整、是否是全长）也是反映文库质量的一个重要因素。在细胞中表达出的各种mRNA尽管具体序列不同，但基本上都是由3部分组成，即5端非翻译区，中间的编码区和3端非翻译区。非翻译区的序列特征对基因的表达具有重要的调控作用，编码序列则是合成基因产物蛋白质模板。要求文库中的重组cDNA片段足够长以便尽可能地反应出天然基因的结构。,31/46,cDNA文库的改良,32/46,1.均一化cDNA文库,cDNA文库的均一化，是指某一特定组织或细胞的所有表达基因均包含其中，
11、且在cDNA文库中表达基因对应的cDNA的拷贝数相等或接近。均一化cDNA文库是克服基因转录水平上巨大差异给文库筛选和分析带来障碍的有效措施，有利于研究基因的表达和序列分析。,33/46,基因组DNA饱和杂交法,mRNA水平上，基因之间丰度差异极大；基因组水平上，基因之间拷贝数差异不大，即基因在基因组上具有拷贝数相对一致的性质。 通过cDNA与基因组DNA饱和杂交降低高丰度mRNA在文库中高拷贝存在的cDNA的丰度。将随机打断的基因组总DNA片段标记为探针，与总cDNA单链饱和杂交，弃除未杂交的总cDNA，从cDNA-DNA杂交体上变性释放已均一化后的总cDNA，转化宿主。,34/46,2.二
12、级复性动力学处理,二级复性动力学是指高丰度的cDNA在退火条件下复性速度快，而低丰度的cDNA复性要很长时间，可以通过控制复性时间来降低丰度。用羟基磷灰石柱将单链和双链cDNA分开，保留单链cDNA后转化宿主。,35/46,全长cDNA文库,mRNA发生降解，第二链合成中DNA聚合酶的外切核酶活性、反转录酶特性的RNase H活性变化，反转录酶与mRNA模板的脱离(主要受mRNA复杂结构影响)等都可能会导致cDNA不完整。保持mRNA的完整性是构建全长cDNA文库的核心。mRNA完整性的确定可通过直接检测mRNA分子的大小，或测定mRNA的转译能力。,36/46,目的cDNA克隆的筛选和鉴定,
13、从cDNA文库中筛选和鉴定目的cDNA的方法主要有核酸分子杂交和免疫学检测分析等方法。 差别杂交（differential hybridization）又叫差别筛选（differential screening），适用于分离在特定组织细胞或发育阶段表达的、受生长因子调节的或药物诱导表达的基因。,37/46,38/46,cDNA文库与基因组文库的比较,（1）基因组文库克隆的是所有基因，包括未知功能的DNA序列和调控基因等，cDNA文库克隆的是所有表达的基因，即具有蛋白质产物的结构基因，包括调节基因。 （2）基因组文库克隆的是全部遗传信息，不受时空影响；cDNA文库克隆的是不完全的编码DNA序列，
14、受发育和调控因子的影响。 （3）基因组文库中编码的基因是真实的基因，是带有内含子和外显子的基因组基因；从cDNA文库中获得的是经过剪切去除内含子的基因。,39/46,可获得的基因,对比研究异常基因,生物进化与同源性分析,基因表达,基因的结构功能调节研究,所有正在表达的基因,应用范围,40/46,41/46,扣除文库 （subtracted library）,反应不同组织细胞或同一组织细胞不同功能状态下，基因表达差异的cDNA文库。,42/46,差示文库 （differential library）,差异显示反转录聚合酶链式反应（differential display of reverse t
15、ranscriptional PCR， DDRT-PCR）,（1）PCR扩增：所有的mRNA,（2）测序凝胶电泳：对比发现 cDNA的差异,mRNA差异显示法,43/46,可获得的基因：不同组织细胞或同一织细胞不 同功能状态下表达差异的基因 。,肿瘤等病因的分子机理,细胞对外因的反应,研究细胞增殖分化机理,应用,44/46,Intron and Exon in Eukaryotic Cells,mRNA,DNA,cap,poly A tail,mature mRNA,Processing,Transcription,Splicing,promotor,Take place in nucleus
16、,start codon,stop codon,To cytoplasm,Intron deleted,45/46,cDNA Is Reverse Transcribed from mRNA,mature mRNA,poly A tail,TTTT,Reverse transcription,CCC,3,5,3,5,3,GGG,DNA polymerase,RNA hydrolysis,46/46,Two Libraries： cDNA Library vs Genomic Library,mRNA,cDNA,Reverse transcription,Chromosomal DNA,Restriction digestion,Genes in expression,Total Gene,Complete gene,Gene fragments,Smaller Library,Larger Library,Vector: Plasmid or phage,Vector: Plasmid,
