1、 目的基因概念 目的基因概念 获得目的基因方法 获得目的基因方法 构建 构建cDNA cDNA文库 文库 构建基因组文库 构建基因组文库 人工合成目的基因 人工合成目的基因 PCR PCR合成 合成 其他方法：差异显示，基因陷阱 其他方法：差异显示，基因陷阱 生物秀 生物秀- -专心做生物！ 专心做生物！ 目的基因的概念 目的基因的概念 基因是 基因是 DNA DNA 分子上含特定遗传信息的核酸 分子上含特定遗传信息的核酸 序列的总称，是遗传物质的最小功能单 序列的总称，是遗传物质的最小功能单 位。 位。 目的基因：对基因组中某个基因通过克隆 目的基因：对基因组中某个基因通过克隆 扩增，获得
2、该基因进行研究或应用称这种 扩增，获得该基因进行研究或应用称这种 基因为目的基因。 基因为目的基因。目的基因的用途 目的基因的用途 研究该基因的全貌与内涵：结构、功能、 研究该基因的全貌与内涵：结构、功能、 调控 调控 寻找异常基因异常点，探索疾病的机理与 寻找异常基因异常点，探索疾病的机理与 治疗 治疗 研究生物种系进化与相关同源性 研究生物种系进化与相关同源性 基因工程重组表达 基因工程重组表达 改造某些基因 改造某些基因 基因治疗 基因治疗原 原 理 理 原核目的基因获得：直接分离 原核目的基因获得：直接分离 真核目的基因获得： 真核目的基因获得： ( 一 ) 载体 ：宿主细胞内可独立复
3、制的完整 DNA 分子 。 质粒 ( plasmid ) 噬菌体 M13 噬菌体 逆转录病毒 DNA 昆虫病毒 DNA（插入动物细胞 ） ( 二 ) 目的基因的来源 从cDNA 中分离 人工合成 反转录 基因文库 PCR PCR 其他方法：差异显示，基因陷阱等 其他方法：差异显示，基因陷阱等构建 构建 cDNA cDNA 文库筛选目的基因 文库筛选目的基因 选材： 选材： mRNA mRNA 丰富，目的基因表达活跃 丰富，目的基因表达活跃 注意点：防止 注意点：防止 RNA RNA 酶污染 酶污染构建流程 构建流程 组织细胞 组织细胞 破碎细胞，除去 破碎细胞，除去DNA DNA与蛋白质 与蛋
4、白质 提取总 提取总RNA RNA oligo oligo（ （dT dT） ）纤维素亲合柱层析 纤维素亲合柱层析 合成 合成cDNA cDNA第一链 第一链 反转录 反转录 合成 合成cDNA cDNA第二链 第二链 插入载体 插入载体 重组 重组DNA DNA 导入大肠杆菌扩增 导入大肠杆菌扩增 构建 构建cDNA cDNA文库 文库mRNA mRNA 的分离 的分离 10 10 5 5 g/ g/ 细胞， 细胞， 8085% 8085% 为 为 rRNA rRNA ， ， 15% 15% 小分 小分 子量 子量 RNA RNA （ （ tRNA tRNA 等） 等） 1 1 5%mRNA
5、 5%mRNA ， ， 28S 28S ： ： 18S=2 18S=2 ： ： 1 1 提取总 提取总 RNA RNA ： ： 常规方法； 常规方法； Trizon Trizon 提取纯化 提取纯化 mRNA mRNA ： ： oligo oligo dT dT 柱 柱反转录合成 反转录合成 cDNA cDNA 合成 合成 cDNA cDNA 第一链：反转录酶 第一链：反转录酶 合成 合成 cDNA cDNA 第二链： 第二链： 置换合成法： 置换合成法：RNA RNA酶 酶H H； ；DNA DNA聚合酶 聚合酶 ； ； T4 DNA T4 DNA连接酶 连接酶 外加引物合成法：全长双链 外
6、加引物合成法：全长双链 PCR PCR构建 构建 cDNA cDNA 文库 文库 cDNA cDNA 两端加接头或衔接头 两端加接头或衔接头 cDNA cDNA 与载体相连 与载体相连 导入宿主细胞进行克隆 导入宿主细胞进行克隆筛选目的基因 筛选目的基因 核酸杂交法：探针 核酸杂交法：探针 免疫结合法：抗体 免疫结合法：抗体 其他方法：双杂交；基因芯片 其他方法：双杂交；基因芯片构建基因组文库筛选目的基因 构建基因组文库筛选目的基因 要求：全 要求：全 流程： 流程：组织细胞 组织细胞 温和 温和破碎细胞 破碎细胞 DNA DNA片段与载体的连接包装 片段与载体的连接包装 限制性内切酶消化，
7、限制性内切酶消化，噬菌体或粘粒 噬菌体或粘粒 导入细胞 导入细胞 核酸杂交 核酸杂交 筛选目的基因 筛选目的基因人工合成目的基因片段 人工合成目的基因片段 原理： 原理： DNA DNA 是由 是由 3 3 ， ， 5 5 磷酸二酯键连接 磷酸二酯键连接 技术： 技术： DNA DNA 自动合成仪 自动合成仪 方法 方法 化学合成法：固相 化学合成法：固相 酶促合成法：需模板 酶促合成法：需模板 PCR PCR其他方法 其他方法构建差示文库（扣除文库）筛选 构建差示文库（扣除文库）筛选 特殊基因 特殊基因 差示文库：反映不同组织细胞或同一种细 差示文库：反映不同组织细胞或同一种细 胞在不同功能
8、状态下，基因表达差异的 胞在不同功能状态下，基因表达差异的 cDNA cDNA 文库。用于研究细胞的发育、分化、 文库。用于研究细胞的发育、分化、 细胞的分裂周期、细胞对药物和生长因子 细胞的分裂周期、细胞对药物和生长因子 的诱导反应以及肿瘤等疾病的分子基础。 的诱导反应以及肿瘤等疾病的分子基础。 方法：构建两个 方法：构建两个 cDNA cDNA 文库 文库 杂交 杂交 羟基磷 羟基磷 灰石柱分离 灰石柱分离 构建 构建 cDNA cDNA 文库 文库mRNA mRNA 差示显示法获得目的基因 差示显示法获得目的基因 原理：一般 原理：一般 15% 15% 基因表达，而且在不同状 基因表达，
9、而且在不同状 态表达的基因是不同的 态表达的基因是不同的 方法： 方法： PCR PCR 扩增（标记） 扩增（标记） 测序电泳 测序电泳 筛 筛 选差异 选差异 优点：简便；灵敏度高；重复性好；多能 优点：简便；灵敏度高；重复性好；多能 性；快速 性；快速选择原则 选择原则 根据获得目的基因的目的选择方法 根据获得目的基因的目的选择方法 根据目的基因本身特点选择方法 根据目的基因本身特点选择方法 根据实验室条件选择方法 根据实验室条件选择方法双杂交技术原理与应用基本原理 转录激活因子在结构上是组件式的(modular),即 这些因子由两个或两个以上相互独立的结构域构 成,其中有DNA结合结构域
10、(DB)和转录激活结构 域(AD),它们是转录激活因子发挥功能所必需的。 单独的DB虽然能和启动子结合,但是不能激活转 录。而不同转录激活因子的DB和AD形成的杂合 蛋白仍然具有正常的激活转录的功能。 例子：酵母细胞的Gal4蛋白的DB与大肠杆菌的一 个酸性激活结构域B42融合得到的杂合蛋白仍然 可结合到Gal4结合位点并激活转录。双杂交系统工作原理示意图 a a 天然 天然Gal4 Gal4蛋白具有 蛋白具有DNA DNA结合域和转录激活域，诱导 结合域和转录激活域，诱导Gal1 Gal1 LacZ LacZ转录； 转录； b b 只有 只有DNA DNA结合域（上）或转录激活域（下）的杂合
11、蛋白不能激活报告基因的转录； 结合域（上）或转录激活域（下）的杂合蛋白不能激活报告基因的转录； c c 蛋白 蛋白X X和 和Y Y之间的相互作用使 之间的相互作用使Gal4 Gal4的两个结构域接近导致报告基因的转录 的两个结构域接近导致报告基因的转录基本技术 诱饵融合表达质粒构建 融合表达cDNA文库构建 文库扩增，重组DNA收集 共转染 筛选 假阳性剔除 测序 生物学功能验证双杂交系统的发展 报告基因的多样化 多报告基因系统：LacZ，酵母营养缺陷型Leu2和His3 诱饵表达载体 ：两种 Gal4和LexA，后者结合于E.coli的LexA操纵子且不具 有核定位序列 猎物表达载体 ：三
12、种 VP16来自于单纯疱疹病毒，它的转录激活活性高于下 述两个 酵母Gal4的转录激活域 B42来自E.coli，转录激活活性弱，可以缓和有毒性的 基因表达对细胞的影响，其后插入流感病毒HA抗原， 易于将蛋白分离纯化基于双杂交原理的其他方法 三杂交系统：两个蛋白之间通过第三者发生相互作用，第 三物可以是蛋白质、小分子或RNA 负选择系统：BDX/ADY转录激活的报告基因在特定的条 件下有毒性。如表达URA3基因的酵母在缺乏5氟乳清酸的 培养基上能够正常生长。在含5氟乳清酸的培养基上该酶将 5氟乳清酸转变成毒性复合物，使细胞停止生长或死亡 双诱饵系统：使用两种不同的诱饵激活选择性和负选择两 种报
13、告基因的转录 哺乳动物的双杂交系统：高等生物中发现蛋白相互作用 单杂交系统：确定识别特异DNA结合蛋白的方法 SOS恢复系统：研究膜受体、细胞外分泌蛋白等非核蛋白相 互作用 泛素专一性蛋白酶系统：检测蛋白相互作用中的动力学 大规模双杂交筛选：蛋白组学中的应用蛋白质三杂交系统 a ：蛋白Z稳定了 蛋白A和B之间 的作用； B： 蛋白质A和B 通过蛋白Z相互 作用； C： 蛋白Z改变了 A的结构，使得 B能与之作用通过小分子的三杂交系统 利用 利用FK506 FK506与地塞 与地塞 米松杂合分子，将 米松杂合分子，将 与 与LexA LexA BD BD融合 融合 的糖皮质激素受体 的糖皮质激素
14、受体 及杂合分子作为诱 及杂合分子作为诱 饵，用于筛选与 饵，用于筛选与 AD AD融合的 融合的Jurkat Jurkat cDNA cDNA文库，分离 文库，分离 了与 了与FK506 FK506结合的 结合的 蛋白 蛋白FKBP12 FKBP12RNA介导的三杂交系统 与 与AD AD融合的蛋白是具有 融合的蛋白是具有RNA RNA结合域的蛋白（如细菌 结合域的蛋白（如细菌MS2 MS2）， ），能够与 能够与RNA RNA 分子的臂 分子的臂 环结构结合； 环结构结合；RNA RNA除具有臂 除具有臂 环结构外，还有诱饵序列（ 环结构外，还有诱饵序列（test test）。 ）。 这样
15、 这样RNA RNA分子与 分子与DB DB 蛋白复合物构成了双杂交系统中的诱饵，它结合于报 蛋白复合物构成了双杂交系统中的诱饵，它结合于报 告基因的上游；第 告基因的上游；第3 3个分子是 个分子是AD AD 蛋白，如果该蛋白识别诱饵序列 蛋白，如果该蛋白识别诱饵序列test test并结 并结 合，则报告基因转录。 合，则报告基因转录。三杂交系统应用 分析确定RNA蛋白作用的精确结构域，甚 至单个核苷酸或氨基酸残基 鉴定和克隆识别结合有重要生理功能 RNA(如转录、定位、RNA病毒包装和感染 等)的蛋白质，可用于调控的机理研究、疾 病的防治以及抗病毒药物的研制开发 通过构建杂交RNA库，可
16、筛选与特定蛋白 结合的RNA 有可能在此基础上发展四杂交系统研究 RNARNA间的相互作用负选择系统 a报告基因不转 录，细胞生长； b报告基因转 录，细胞不生长 或死亡（在含5 氟乳清酸的培养 基上，URA3基 因表达产物降解 5氟乳清酸为有 毒物质）反向双杂交系统应用 可更有效地蛋白间作用的关键位点或起决 定作用的个别氨基酸， 进而分析蛋白结构 和功能的关系 可筛选能阻止某些蛋白间相互作用的肽或 小分子物质用作临床治疗制剂 研究相互作用的蛋白间的结构特征 筛选蛋白突变体 确定能够打破特异的蛋白相互作用的试剂双诱饵系统 使用两种不同的诱饵激活选择性和负选择两种报 告基因的转录 用于区分桥蛋白
17、与识别蛋白 还可以区分野生型蛋白和病理条件下的蛋白变种哺乳动物的双杂交系统 酵母毕竟是一种较低等的生物，蛋白的翻译后修 饰（糖基化、二硫键的形成等）程度很低 要进一步研究蛋白产物的生物学功能，还必须建 立高等生物体系的双杂交系统 系统采用单纯疱疹病毒VP16的AD区段 用氯霉素乙酰转移酶为报告基因，其活性可以在 细胞提取物中检测 采用磷酸钙共沉淀转化入Hela细胞培养 该方法主要用于检验已知蛋白的相互作用单杂交系统 用于确定识别特异DNA结合蛋白的方法 在系统中诱饵是报告基因一段特定的上游 序列 将DNA复制起始序列ACS与报告基因LacZ 连接，用来筛选杂交表达文库（即与AD融 合的蛋白文库
18、） 应用：发现并分离了酵母ORC6DNA复 制复合物蛋白之一SOS恢复系统 上述反应都是在核中进行的，对于研究膜蛋白， 分泌蛋白，膜受体及胞质蛋白有很大的局限性 SOS恢复系统是针对于膜受体、细胞外分泌蛋白 的一种方法 原理：酵母温度敏感株是由于在ras信号途径中存 在突变体，不能将外来信号传递给膜上的RAS蛋 白，在36不能存活 将野生性SOS与X融合，豆蔻酰化信号与Y融合， 使Y定位于膜上。若X与Y结合，则SOS蛋白定位 于膜上，与RAS接近，激活ras途径，完成SOS过 程，36下生长SOS SOS恢复系统 恢复系统泛素专一性蛋白酶系统 泛素与蛋白质形成的融合蛋白可以被泛素专一性 蛋白酶
19、（UBPS）分解，并且需要泛素正确折叠 泛素的两个结构域分别表达时就能够正确折叠， 当N端发生错义突变时不能正确折叠 当两个蛋白（A、B）分别与泛素的N端、C端融 合，若A、B相互作用，则N端错义突变引起的不 正确折叠能够得到纠正，C端和N端能够正确折 叠，UBPS水解使得二氢叶酸还原酶释放 该系统可检测蛋白相互作用中的动力学性质大规模双杂交筛选1 a 矩阵法：以横向方式 生长的是含有诱饵的单 倍体酵母，竖线方式生 长的是猎物库的单倍体 酵母 复印膜,单倍体接合 后，在交叉处的酵母则 融合成二倍体 将二倍体分别在含X Gal和Leu培养基上进 行筛选大规模双杂交筛选2 B 一一对应方法：诱 饵
20、与猎物相对应， 接合于丰富培养基 上，拷贝膜在选择 培养基上进行筛选大规模双杂交筛选3 C 文库对文库的接合：即单倍体诱饵文库与 单倍体猎物文库接合，直接筛选二倍体细菌双杂交系统 1 利用百日咳博代杆菌中cya基因编码的钙调蛋白(CaM)依 赖性腺苷酸环化酶，其激活区可以分成T18和T25两个相 对独立的功能片段 将这两种片段引入大肠杆菌DHP1(cya)中独立表达，它们 不能彼此识别与作用，因此不能互补大肠杆菌DHP1的 cya缺陷型性状，表现为 半乳糖苷酶活性很低，生长在 MacConkey/麦芽糖平板上的菌落呈白色 若这两个功能区分别与一对可相互作用的蛋白质融合表 达，它们可形成有功能的
21、腺苷酸环化酶，互补大肠杆菌 DHP1的cya缺陷型，使菌株 半乳糖苷酶活性上升，生 长在MacConkey/麦芽糖平板上菌落显红色 因此应用这个双杂交系统研究蛋白质间的相互作用即可根 据 半乳糖苷酶和麦芽糖酶的活力来检测细菌双杂交系统 2 假阳性：只产生T18 NifL或T25 NifL的对照组大肠杆菌 DHP1(cya)菌株，也可导致菌株 半乳糖苷酶活性的上 升或生长在MacConkey/麦芽糖平板上菌落呈浅红色的假 阳性结果 改用阴沟肠杆菌，由于腺苷酸环化酶性质不同：其不依赖 于CaM，在加入CaM后cAMP的量并不增加，通过薄层层 析法直接检测cAMP形成的量，可以将二者区别 检测生成的
22、cAMP，反应中必须加入适量的NaF和咖啡 因：NaF可抑制ATPase的活性，防止ATP被ATPase降 解，确保反应过程中底物ATP的浓度始终维持在较高的水 平；咖啡因能抑制35cAMP磷酸二酯酶对cAMP的降 解，保证生成的cAMP的积累细菌双杂交优点 细菌的生长速度快，大大缩短了实验周期 两种蛋白质是否相互作用是通过形成有活性腺苷 酸环化酶来判断的，如将与T18或T25片段融合的 蛋白纯化出来，检测其混合液的腺苷酸环化酶活 性，即从体外研究蛋白质间相互作用，并可直接 研究环境因子或其他分子等的影响 如研究的两种蛋白质具有腺苷酸环化酶活性(非 CaM依赖型特性)，在应用时就会产生假阳性，
23、可 利用上述方法排除假阳性的干扰 应用细菌双杂交系统研究原核生物蛋白质间相互 作用时，会得到一些用酵母双杂交系统研究时无 法得到的结果STRATAGENE的细菌双杂交系统 诱饵蛋白与全长cI融合表达（ cI N端是DNA结合区， 可使融合蛋白定位于报告基因的上游；cI C端是二聚化 区） 靶蛋白与RNA聚合酶亚单位的N端融合表达 诱饵蛋白与靶蛋白结合后，RNA聚合酶亚单位与启动子 结合与启动第一个报告基因抗Amp基因转录；第二个 报告基因半乳糖苷酶基因受同一启动子调控表达 由于抑制蛋白和RNA聚合酶都可形成二具体，对测试蛋 白自我聚合是不合适的诱饵质粒的构建与鉴定 设计引物，PCR得到诱饵蛋白
24、编码序列 酶切，连接，MCF：Not, EcoR, Sma, BamH, Xho, Bgl 转化：选择宿主菌 降低诱饵蛋白表达，含lacI q 基因 对氯霉素敏感的细菌 筛选 氯霉素抗性菌落 以诱饵蛋白插入位点两端序列为引物PCR扩增 IPTG诱导表达诱饵蛋白 注意点：pBT是低拷贝质粒；抗性与我们通常所用的不同靶 靶 cDNA cDNA 文库构建流程 文库构建流程 组织细胞 组织细胞 破碎细胞，除去 破碎细胞，除去DNA DNA与蛋白质 与蛋白质 提取总 提取总RNA RNA oligo oligo（ （dT dT） ）纤维素亲合柱层析 纤维素亲合柱层析 制备 制备mRNA mRNA 反转录
25、 反转录 合成 合成cDNA cDNA第一链 第一链 两头外加接头： 两头外加接头：EcoR EcoR 和 和Xho Xho 合成 合成cDNA cDNA第二链 第二链 插入载体 插入载体( (pTRG pTRG XR) XR) 重组 重组DNA DNA 导入大肠杆菌扩增 导入大肠杆菌扩增(XL1 (XL1 Blue) Blue) 构建 构建cDNA cDNA文库 文库1.7kb 1.7kb 3.32 3.32 PMA PMA 刺激的 刺激的Jurkat Jurkat细胞 细胞 T T 细胞 细胞 1.8kb 1.8kb 3.97 3.97 2 2 池了样品，女性， 池了样品，女性， 49 4
26、9 和 和 64 64岁 岁 胃 胃 1.6kb 1.6kb 2.63 2.63 大量混合样品，女性， 大量混合样品，女性， 28 28 59 59岁 岁 卵巢 卵巢 1.15 kb 1.15 kb 2.54 2.54 2 2 个正常，高加索人，男人 个正常，高加索人，男人/ /女性 女性, , 30 30 40 40 岁 岁 肺 肺 1.17 kb 1.17 kb 4.69 4.69 2 2 个，女性， 个，女性， 66 66 67 67岁 岁 肝脏 肝脏 1.34 kb 1.34 kb 4.52 4.52 Hela Hela S S 3 3 细胞 细胞 HeLa HeLa 细胞 细胞 1.
27、2 kb 1.2 kb 2.17 2.17 6 6 个正常肾组织， 个正常肾组织，18 18 20 20周 周 胎儿的肾 胎儿的肾 1.3 kb 1.3 kb 2.24 2.24 3 3 个正常心脏组织， 个正常心脏组织，19 19周 周 胎儿的心 胎儿的心 1.48 kb 1.48 kb 3.25 3.25 正常脑，男性， 正常脑，男性，21 21周 周 胎儿的脑 胎儿的脑 1.24kb 1.24kb 2.39 2.39 2 2个正常女性组织， 个正常女性组织，49 49 和 和 63 63岁 岁 结肠 结肠 1.3 kb 1.3 kb 2.37 2.37 鳞状细胞癌， 鳞状细胞癌， 42
28、42 81 81岁 岁 子宫颈 子宫颈 1.0 kb 1.0 kb 2.46 2.46 10 10个正常组织， 个正常组织，33 33 80 80岁 岁 乳腺 乳腺 1.41 kb 1.41 kb 3.24 3.24 24 24个正常小脑组织，男人 个正常小脑组织，男人/ /女性 女性 , , 16 16 70 70岁 岁 脑 脑 1.16kb 1.16kb 2.1 2.1 单身的捐赠人，男人 单身的捐赠人，男人,55 ,55岁 岁 脑 脑 插入物大 插入物大 小 小 主要的文库大小 主要的文库大小 (x10 (x10 6 6 ) ) 描述 描述 来源 来源商品化cDNA文库的扩增 查询文库滴
29、度和细菌浓度：决定扩增的规 模与工作量 铺板：LB四环素琼脂平板：15cm或25cm 培养1730小时：长插入序列菌落充分生长 从平板收集所有菌落，抽提质粒 注意点 低拷贝 抗性 含文库菌种的保存相互作用蛋白的筛选 筛选条件：LBCTCK琼脂平板 C：氯霉素pBT质粒的筛选抗性 T：四环素pTRG质粒的筛选抗性 C：羧苄青霉素报告基因的抗性 K：卡那霉素宿主菌的抗性 共转化：各10ng质粒；卡那霉素抗性宿主菌XL1 Blue MRF 生长条件：30 注意点 转化效率（-巯基乙醇提高转化效率） 转化密度（510 4 /15cm平板） 转化总量（所筛选文库滴度决定，20快平板） 羧苄青霉素浓度（由
30、诱饵蛋白和靶蛋白作用亲和力决定） 对照（试剂盒提供阳性对照）靶蛋白的确定 假阳性消除 抽提阳性克隆的pTRG靶蛋白，与pBT共转染，LB CTCK平板再次筛选 利用第二个报告基因筛选 靶蛋白的确定 测序 与GenBank库序列比对 核酸杂交确定基因全序列 注意点 所有阳性菌落扩增时应在LBTCK平板或试管中进行 Xgal筛选时使用PETG而不是IPTG应 用 研究蛋白蛋白间的相互作用 蛋白与其它分子相互作用 筛选未知蛋白 研究蛋白的功能 蛋白质组学目的基因插入载体 目的基因插入载体 作用酶： 作用酶： T4DNA T4DNA 连接酶 连接酶 连接方式 连接方式 粘性末端连接 粘性末端连接 平末
31、端连接 平末端连接 人工接头连接 人工接头连接粘端连接 粘端连接 全同源粘端：高背景；双向插入 全同源粘端：高背景；双向插入 定向克隆：外源 定向克隆：外源 DNA DNA 定向插入载体 定向插入载体 不同粘端：连接效率高 不同粘端：连接效率高 粘 粘 平端 平端平端连接 平端连接 是连接反应的基础 是连接反应的基础 缺点 缺点 连接效率效低 连接效率效低 需大量 需大量T4DNA T4DNA连接酶（ 连接酶（5 5 10u /20ul 10u /20ul反应） 反应） 易串联 易串联人工接头连接 人工接头连接 人工接头：人工合成的短 人工接头：人工合成的短 DNA DNA 连接子：带有一个或
32、几个酶切位点 连接子：带有一个或几个酶切位点 平端连接（与目的 平端连接（与目的DNA DNA） ） 酶切 酶切 粘端连接 粘端连接 （与载体） （与载体） 普适子：直接带有粘端 普适子：直接带有粘端T T A A 克隆 克隆 原理： 原理： TaqDNA TaqDNA 聚合酶能在平端双链 聚合酶能在平端双链 DNA DNA 的 的 3 3 末端加一个碱 末端加一个碱 基，所加碱基几乎全是 基，所加碱基几乎全是 腺苷。据此，在质粒 腺苷。据此，在质粒 DNA 3 DNA 3 端突出一个胸 端突出一个胸 苷来克隆 苷来克隆 PCR PCR 产物，其克隆效率比平端的 产物，其克隆效率比平端的 连接
33、至少高出 连接至少高出 100 100 倍。 倍。 应用： 应用： PCR PCR 产物克隆 产物克隆 代表商品化载体： 代表商品化载体： pCR pCR TM TM ； ； pGEM pGEM - - T T无连接酶亚克隆法 无连接酶亚克隆法 (LFS) (LFS) 无连接酶克隆法（ 无连接酶克隆法（ligase ligase free free subcloning subcloning， ，LFS LFS） ）是利 是利 用引物 用引物5 5 附加修饰的碱基与某一质粒两 附加修饰的碱基与某一质粒两 端分别互补的碱 端分别互补的碱 基。两引物的 基。两引物的3 3 约 约20 20 25b
34、p 25bp分别与待扩增 分别与待扩增 DNA DNA两翼互补， 两翼互补， 5 5 各有约 各有约24bp 24bp分别与线性化质粒的 分别与线性化质粒的3 3 相同的附加序列。由 相同的附加序列。由 于线性化质粒的 于线性化质粒的3 3 序列各不相同， 序列各不相同，PCR PCR片段通过选择各引 片段通过选择各引 物的合适 物的合适5 5 附加序列与引物 附加序列与引物3 3 端定向杂交。 端定向杂交。 注意点 注意点 第一 第一 次 次PCR PCR时两引物的 时两引物的5 5 附加序列不应太短（ 附加序列不应太短（ 24bp 24bp） ）以免影响 以免影响 第二次 第二次PCR P
35、CR时异源双 时异源双 链的形成 链的形成 扩增时若形成引物二聚体， 扩增时若形成引物二聚体， 一定要去除，否则会严重影响转化率 一定要去除，否则会严重影响转化率 优点 优点 可用于常规方法无法进行亚克隆的片段 可用于常规方法无法进行亚克隆的片段 适于任何 适于任何PCR PCR产物和任何质粒 产物和任何质粒 可亚克隆特殊目 可亚克隆特殊目 的（如含点突变、缺失或插入等）片段 的（如含点突变、缺失或插入等）片段 在某些情况下，对已构 在某些情况下，对已构 建了启动子或增强子等序列的载体，可 建了启动子或增强子等序列的载体，可 使待表达片段插入定向合适 使待表达片段插入定向合适 位置 位置 较快
36、，可在 较快，可在1d 1d内完成，较常规方法可靠，不需 内完成，较常规方法可靠，不需DNA DNA连接酶 连接酶连接反应条件 连接反应条件 成分：目的 成分：目的 DNA DNA 片段；载体；连接缓冲 片段；载体；连接缓冲 液； 液； T4DNA T4DNA 连接酶；水 连接酶；水 反应时间： 反应时间： 1 1 16h 16h 温度：粘端： 温度：粘端： 12 12 15 15 ；平端： ；平端： 30 30 DNA DNA 量：载体：目的 量：载体：目的 DNA=1 DNA=1 ： ： 1 1 3 3 酶量：定义单位不同（ 酶量：定义单位不同（ Weiss Weiss 单位；粘端单 单位
37、；粘端单 位；外切核酸酶耐受实验定义单位等）； 位；外切核酸酶耐受实验定义单位等）； 粘端连接：平端连接 粘端连接：平端连接 =1 =1 ： ： 10 10 100 100重组子导入受体菌 重组子导入受体菌 转化：特指将质粒 转化：特指将质粒 DNA DNA 或以它为载体构建 或以它为载体构建 的重组子导入细菌的过程 的重组子导入细菌的过程 转染：病毒及其重组子导入受体细胞 转染：病毒及其重组子导入受体细胞 转导：噬菌体及其重组子导入受体细胞 转导：噬菌体及其重组子导入受体细胞氯化钙法 氯化钙法 感受态菌的制备：细菌处于容易吸收外源 感受态菌的制备：细菌处于容易吸收外源 DNA DNA 的状态
38、称感受态 的状态称感受态 试剂：冰浴低渗 试剂：冰浴低渗 0.1mol/L CaCl 0.1mol/L CaCl 2 2 转化反应：热休克（ 转化反应：热休克（ 42 42 ） ） 转化效率： 转化效率： 10 10 5 5 - - 10 10 6 6 /ug DNA; /ug DNA; 环状 环状 DNA DNA 高与线 高与线 状 状 DNA 1000 DNA 1000 倍 倍电穿孔法 电穿孔法 仪器：电穿孔仪 仪器：电穿孔仪 参数：电场强度；电脉冲长度； 参数：电场强度；电脉冲长度； DNA DNA 浓度 浓度 细菌浓度： 细菌浓度： 3 3 10 10 10 10 50 50 70%
39、70% 细菌死亡时转化效率最高 细菌死亡时转化效率最高 工作温度： 工作温度： 0 0 4 4 重组子的筛选与鉴定 重组子的筛选与鉴定 插入抗性失活 插入抗性失活 插入蓝白斑失活 插入蓝白斑失活 核酸杂交 核酸杂交 酶切（目的片段长度） 酶切（目的片段长度） PCR PCR 测序 测序 插入方向 插入方向 免疫学 免疫学 生物学学活性 生物学学活性蓝白斑筛选重组质粒 蓝白斑筛选重组质粒 与 与 PCR PCR 鉴定重组质粒 鉴定重组质粒目的基因序列测定 目的基因序列测定 意义：前提；依据 意义：前提；依据 方法：酶促反应法（酶法）；化学裂解法 方法：酶促反应法（酶法）；化学裂解法 （化学法）
40、（化学法） 技术基础：聚丙烯酰胺凝胶电泳；标记技 技术基础：聚丙烯酰胺凝胶电泳；标记技 术 术酶法 酶法 S S anger anger 双脱氧链终止法 双脱氧链终止法 原理： 原理：2 2 ， ，3 3 ddNTP ddNTP与 与dNTP dNTP不同之处在于脱氧核糖 不同之处在于脱氧核糖 的 的3 3 位置缺少一个羟基。它们可以在 位置缺少一个羟基。它们可以在DNA DNA聚合酶 聚合酶 作用下通过其 作用下通过其5 5 三磷酸基团掺入到 三磷酸基团掺入到DNA DNA链中，但 链中，但 不能同后续的 不能同后续的dNTP dNTP形成磷酸二酯链， 形成磷酸二酯链，DNA DNA链就不
41、链就不 可能继续延伸。这样，合成时在 可能继续延伸。这样，合成时在4 4种 种dNTP dNTP中加入 中加入 少量的一种 少量的一种ddNTP ddNTP后， 后， 链延伸将与偶然发生但十 链延伸将与偶然发生但十 分特异的链终止展开竞争，反应产物是一系列的核 分特异的链终止展开竞争，反应产物是一系列的核 苷酸链，长度取决于从用以起始 苷酸链，长度取决于从用以起始DNA DNA合成的引物 合成的引物 末端到出现链终止位置之间的距离。在 末端到出现链终止位置之间的距离。在4 4组独立的 组独立的 酶反应中分别采用 酶反应中分别采用4 4种不同 种不同ddNTP ddNTP， ，结果将产生 结果将
42、产生4 4 组寡核苷酸，它们将分别终止于模板链的每一个 组寡核苷酸，它们将分别终止于模板链的每一个 A A、 、T T、 、C C、 、G G位置上。 位置上。方法： 方法： M 13 M 13 ， ， ddNTP ddNTP 法 法 步骤 步骤 ： ： 1. 1.待测定 待测定 DNA DNA 插入双链 插入双链 M 13 M 13 复制型 复制型 DNA DNA 中 中 2. 2.菌体中扩增，提取单链 菌体中扩增，提取单链 M 13 DNA M 13 DNA 3. 3.按待测 按待测 DNA 3 DNA 3 端前方的互补序列人工合成 端前方的互补序列人工合成 自动测序仪：荧光标记 自动测序
43、仪：荧光标记化学法 化学法 M M axam axam Gilbert DNA Gilbert DNA 化学降解法 化学降解法 原理：一个末端标记的 原理：一个末端标记的DNA DNA片段在 片段在5 5组互相独立 组互相独立 的的化学反应分别得到部分降解，其中每一组反 的的化学反应分别得到部分降解，其中每一组反 应特异地针对于某种或某一类碱基。因此生成 应特异地针对于某种或某一类碱基。因此生成5 5组 组 放射性标记的分子，从共同起点（放射性标记末 放射性标记的分子，从共同起点（放射性标记末 端）延续到发生化学降解的位点。每组混合物中 端）延续到发生化学降解的位点。每组混合物中 均含有长短不
44、一的 均含有长短不一的DNA DNA分子，其长度取决于该组 分子，其长度取决于该组 反应所针对的碱基在原 反应所针对的碱基在原DNA DNA全片段上的位置。此 全片段上的位置。此 后，各组均通过聚丙烯酰胺凝胶电泳进行分离， 后，各组均通过聚丙烯酰胺凝胶电泳进行分离， 再通过放射自显影来检测末端标记的分子。 再通过放射自显影来检测末端标记的分子。 优点：高保真 优点：高保真测序策略 测序策略 确证性测序：突变体验证 确证性测序：突变体验证 从头测序：长链 从头测序：长链 DNA DNA 方法： 方法： 随机法（或鸟枪测序法） 随机法（或鸟枪测序法） 定向法 定向法 嵌套缺失法：酶解均匀变短（核酸
45、外切酶 嵌套缺失法：酶解均匀变短（核酸外切酶 ） ） 引物延伸法：测序 引物延伸法：测序 合成引物 合成引物随机法（或鸟枪测序法） 随机法（或鸟枪测序法） 原理：序列资料从含有靶 原理：序列资料从含有靶 DNA DNA 随机片段的 随机片段的 亚克隆中收集而来的。 亚克隆中收集而来的。 流程：随机断裂（超声、核酸酶 流程：随机断裂（超声、核酸酶 切割、 切割、 限制性内切酶切割） 限制性内切酶切割） 亚克隆 亚克隆 重叠 重叠 排列 排列 分析 分析 缺点：重复序列无法处理 缺点：重复序列无法处理小 小 结 结 重组 重组DNA DNA技术步骤 技术步骤 目的 目的DNA DNA获得 获得 目的 目的DNA DNA与载体连接 与载体连接 重组子导入宿主细胞 重组子导入宿主细胞 筛选与鉴定 筛选与鉴定 生物秀论坛 生物秀论坛- -专注于生命科学！ 专注于生命科学！ /
