1、第三章 目的基因的获得,basic process of DNA recombination in vitro体外DNA重组的基本步骤,2.重组体的制备：将目的基因的DNA片断连接到能自我复制并带有选择性标记（如：抗菌素抗性标记）的载体分子上 （DNA重组过程，需要各种工具酶的参与）,3.重组体的转化：将重组体（载体）转入适当的受体细胞中。4.克隆鉴定：筛选转化成功的细胞克隆（含有目的基因）5.目的基因表达：使导入寄主细胞的目的基因表达出我们所需要的基因产物,*,1.目的基因的获得：从复杂的生物基因组中，经过PCR扩增或基因组文库筛选、cDNA文库筛选等步骤，分离出带有目的基因的DNA片断。,
2、2,contents,3.1 从基因组DNA获得目的基因,碱抽提法提取总DNA层析法获得细胞总RNA核酸的定量和纯度测定,核酸电泳装置电泳仪,核酸电泳装置电泳槽、倒胶板,耗材,大肠杆菌总DNA的提取,1. Pellet 0.1 g or 2mL菌液，+ TE buffer (10 mM Tris-HCl, 1 mM EDTA, pH 8.0) 450L + 10 % SDS 45L + 10 mg/mL PK 6L 2. 37温浴 1 h (至清澈透明)3. 酚/仿 抽提 3 次 (至无蛋白层)4. 上清 + 1/10的3 M NaAc, + 等体积异丙醇5. 75 %酒精洗涤沉淀2-3次6.
3、干燥，TAE溶解,3.2 从基因文库中筛选目的基因,基因组文库的构建cDNA文库的构建,构建基因组文库筛选目的基因,Genomic libraries ：a collection of clones, representative of the entire starting population某种生物的基因组的全部遗传信息切割成一定长度的DNA片段，再通过克隆载体贮存在一个受体菌的群体之中，这个集合即为该生物的基因组文库,构建时遗传信息供体是基因组DNA，因而无发育时期及组织器官特异性；一个完全的基因组文库中包含着基因组DNA上的所有编码区及非编码区序列的克隆。生物有机体的每一个基因在文库
4、中都有其克隆，该克隆的基因片段里包括着间隔序列，所以基因组文库可真实地显示基因组的全部结构信息。,基因组文库的大小,一个理想的基因组文库，包含完整基因组的所有DNA序列理论上的克隆子数目基因组DNA总长度/DNA插入片段的平均长度实际的克隆子数目：大于理论,12,12,12,载体能够容载的DNA片段大小直接影响到构建完整的基因文库所需要的重组子的数目。载体容量越大，构建文库所要求的DNA片段数目越少，所需的重组子越少。,13,13,13,Process constructing a genemic library（基因组文库的构建流程）, 物理切割法：超声波（300bp）或机械搅拌（8kb）。
5、 酶切法：内切酶Sau3A进行局部消化。可得到10-30kb的随机片段。,14,14,14,（1）染色体DNA大片段的制备,直接连接、人工接头（adapter）或同聚物加尾。如：Sau3A与BamHI的酶切末端相同（二者是同尾酶）。,（2）载体分别与得到的基因组DNA大片段进行连接,（3）重组载体各自转导受体细胞，扩大培养，得到基因组文库,*,（4）筛选重组子,形成一个含有所有片段的菌群，这个菌群就是一个基因组文库,靶DNA未测序或未定位时，可通过基因组文库筛选靶DNA。,Q：什么是adapter？Linker？同尾酶？（第2、5章）,自学,引物 primer连杆 linker衔接头 adap
6、tor,连杆 Linker,一种按预先设计，化学合成的寡核苷酸片断。一般由812个核苷酸组成，以中线为轴两侧互补对称。其上有一种或几种限制性内切酶识别序列。 将连杆先连接到待连接的一种或两种DNA片段的末端，然后用合适的限制酶切割连杆，使待连接的两种DNA片段产生互补粘性末端，最后DNA连接酶催化，产生重组DNA分子。,衔接头 adaptor,一种化学合成的寡核苷酸，含有一种以上的限制酶识别序列。其与连杆的重要差别是衔接头的一端或两端已具有一种或两种限制性内切酶切割产生的粘性末端。,19,19,19,20,20,20,基因组DNA的处理：用两种酶对基因组进行部分酶切；EcoRI甲基化酶封闭Ec
7、oRI位点；EcoRI连杆(linker)与平末端连接；EcoRI酶切产生粘性末端；,噬菌体置换型载体的处理：Cos位点退火，载体成环；用EcoRI酶切产生1个大片段，2个小片段；去掉小片段，保留大片段；,连接反应：大片段与基因组片段连接形成噬菌体基因组的串联体；在cos位点酶切成噬菌体大小后包装进噬菌体头部；感染宿主并在宿主中增殖。,Producing representative genomic libraries in cloning vectors (1978年，最早用两种不常见的酶酶切基因组，进行克隆。 ),21,21,21,Creation of a genomic DNA lib
8、rary using the phage- vector EMBL3A. (1983年，采用一种酶对基因组进行切割。该克隆策略方便高效。),A convenient simplication can be achieved by using a single restriction endonuclease that cuts frequently, such as Sau3AI. Sau3AI and BamHI create the same cohesive ends.,除了噬菌体衍生载体之外，还有其他许多的高容量克隆载体（如BAC、PAC、YAC等）都可以用于基因组文库的构建。这些载体
9、的优点是平均插入片段的大小远大于置换载体，但文库较难制备，插入片段较大，不容易直接操作。,22,22,22,3 构建cDNA文库筛选目的基因,mRNA,cDNA,反/逆转录,DNA,转录,A cDNA library is prepared by reverse-transcribing a population of mRNAs and then screened for particular clones. cDNA library：某种生物基因组转录的的全部mRNA经反转录产生的各种cDNA分别与克隆载体重组，贮存在一个受体菌的群体中，这个群体就称为cDNA文库。,*,Character
10、 of cDNA library（cDNA文库的特点）,分离的目的基因可直接用于表达比DNA文库小的多，容易构建，文库的筛选比较简单易行；以mRNA为材料，反映的是该生物特定发育时期、特定组织(或器官)在某种环境条件下的基因表达情况，有一定的时效性；只与编码序列有关，因此 不能反映内含子、启动子、终止子以及与核糖体识别等的序列的结构和功能特征,24,24,24,*,Process constructing a cDNA library（cDNA文库的构建流程）,25,25,25,*,(i) isolate mRNA（提取总RNA并分离mRNA）;(ii)rst-strand DNA synth
11、esis on the mRNA template, carried out with a reverse transcriptase（用Oligo( dT)（或随机引物）作引物，以RNA为模板，逆转录酶合成cDNA的第一链）;(iii) removal of the RNA template（去除RNA/DNA杂合链中的RNA，碱处理或RNaseH处理）; (iV) second-strand DNA synthesis using the first DNA strand as a template, carried out with a DNA-dependent DNA polymer
12、ase, such as E. coli DNA polymerase I（以cDNA第一链为模板，用DNA依赖性的DNA聚合酶合成cDNA第二链）.,1：分离mRNA，通过反转录的方式合成cDNA,26,26,26,*,2：cDNA与载体连接，形成重组载体,在双链cDNA末端接上人工接头，即可与载体连接，转入受体菌。 （通过接头形成粘性末端而连接）或借助末端转移酶给载体和双链cDNA的3端分别加上几个C或G，成为粘性末端。（通过寡聚化形成粘性末端而连接）,3：噬菌体颗粒的包装及转染或质粒的转化（导入宿主中繁殖），得到cDNA文库,注：刚合成的cDNA双链的末端几乎不可能正好是内切酶的酶切位点
13、，因此这里肯定不存在由粘性末端直接相连的例子。这一点与基因组DNA与载体的相连有所区别。,4：从cDNA文库中筛选目的重组子,27,27,27,28,28,28,How to isolate mRNA？,利用mRNA都含有一段polyA尾巴的特点，采用亲和层析柱将mRNA从总RNA（rRNA、tRNA等）中分离纯化。 mRNA只占总RNA的1%-2%。合成1220个 dT 组成 oligo（dT）作为引物与 mRNA poly（A）尾巴杂交，用反转录酶引导可合成cDNA第一链。,29,29,cDNA克隆中使用的反转录酶,AMV：来源于禽类的成髓细胞瘤病毒,MMLV：大肠杆菌中克隆的莫罗尼氏鼠白
14、血病病毒,天然来源的酶缺乏持续合成能力，但具有内在的RNA酶活力，容易使RNA模板降解，不利于生产全长的cDNA天然来源的酶，发挥功能的最适温度是37，且通常会在富含二级结构的序列出转录终止这些结构往往出现在5端或3端的非翻译区（这样就不容易形成全长cDNA）,30,30,现在常用的酶：天然的酶改造过以利于生产全长cDNA,现在常用突变了的反转录酶（老鼠病毒来源的），它们缺乏RNaseH活性，因此更有利于生产全长cDNA如： Life Technologies公司生产的改造后的Super-ScriptII可以在50 下进行反转录。,Development of cDNA cloning str
15、ategies,An early cDNA cloning strategy, involving hairpin-primed second-strand DNA synthesis and homopolymer tailing to insert the cDNA into the vector.(早期的策略：发卡方法：引导cDNA第二链的合成),31,31,31,Improved method for cDNA cloning. The first strand is tailed with oligo(dC) allowing the second strand to be init
16、iated using an oligo(dG) primer. (改进的策略：寡聚加帽法：对cDNA第一链同聚物加尾后，设计相对应的引物合成cDNA第二链),*,早期cDNA策略,32,32,32,mRNA的分离,Oligo(dT)引物与mRNA 退火，cDNA第一链合成,降解mRNA模板，cDNA3末端形成双链发夹结构,以发夹结构为引物，合成cDNA第二链,用S1核酸酶去掉发卡结构,缺点：,S1核酸酶的作用，会使cDNA5端的序列部分丢失,33,33,33,合成的cDNA双链通过同聚物加尾的方式与载体相连后导入宿主细胞中,1976年，发卡方法的严重缺陷：S1核酸酶的切割会使克隆的5端某些序
17、列丢失。因此后来有了另一种方法。,34,34,34,改进的cDNA克隆策略,寡聚T引物在mRNA多腺苷酸尾部退火,首条cDNA链的合成,在cDNA第一条链的末端(3端)加上oligo(dC),末端转移酶,合成相应的寡oligo(dG)引物,引导第二条cDNA的合成,35,35,35,Improved method for cDNA cloning. The first strand is tailed with oligo(dC) allowing the second strand to be initiated using an oligo(dG) primer.,改进的cDNA克隆策略。第一条cDNA链用寡聚C加尾，使第二条链可以有寡聚G初始化。,举例,3 化学合成法,多用于合成短的DNA片段，如引物、DNA探针等。,磷酸二酯法,亚磷酸三酯法,寡核苷酸的连接,化学合成的产物,引物：合成目的基因的引物和测序引物,4 PCR法,目的序列已知，且仅对较短产物的扩增有效：根据目的基因序列设计特异性引物PCR扩增,PCR扩增仪,summary,基因组文库和cDNA文库的概念？特点？各自的构建流程？cDNA如何合成？,
