1、目的基因的分离,分离目的基因的方法及原理 目的基因分离方法的选择原则 目的基因的序列测定,本节内容,目的基因的定义： target gene对基因组中某一基因成分或该基因片段进行研究或应用，首先需要通过克隆、扩增以获得该基因，此基因（或片段）称为目的基因。外源性基因（或DNA）：cloned DNA in vitro插入至载体、并导入宿主细胞内复制的基因。,第一节 分离目的基因的方法及原理,1,DNA重组技术：按照人的意愿在体外对 DNA 分子进行重组，再将重组分子导入受体细胞，使其在细胞中扩增和繁殖，以获得该DNA分子的大量拷贝。,目的基因的来源,从庞大的基因群中获得某一目的基因的DNA 片
2、段要求 纯度高；数量多原核细胞（较易获得目的基因）基因组较小，可直接分离获得 基因组 限制性内切酶 水解成若干片段 探针筛选 提纯 扩增,真核生物：一个单拷贝基因仅占整个基因组的 10-5甚至更少，不易获得。真核细胞目的基因的来源根据不同要求选择1. 构建 cDNA文库2. 构建基因组文库3. 人工合成 Synthesize DNA in vitro4. PCR扩增,DNA文库：,通过重组、克隆保存在宿主细胞中的各种DNA分子的集合体。文库保存了该种生物的全部遗传信息，需要时可从中分离获得。,1. cDNA文库 只包括表达成蛋白质的DNA序列 2. 基因组文库代表该种生物体所有的DNA序列,c
3、DNA (互补DNA,complementary DNA),区域特异性cDNA文库 从特定位点的基因组DNA出发寻找转录序列即以含有某种人染色体或其区段的杂交细胞株分离RNA,反转录合成cDNA,分类:,用人特异性Alu序列扩增，寻找外显子，可以得到染色体段内表达基因的分布图,组织特异性cDNA文库 从cDNA出发寻找转录序列，将其定位于遗传图谱或物理图谱上。即以不同发育阶段的人组织细胞为材料，提取RNA，构成cDNA文库。,可得到特定细胞的外显子图谱,一、构建cDNA文库,cDNA以mRNA为模板经逆转录而成， 故须选择mRNA丰富、较易获得的、目的 基因表达活跃的组织细胞为材料。,1.真核
4、细胞mRNA的分离和纯化,提取细胞内总RNA 分离和纯化mRNAmRNA 3端有polyA尾，用oligo-dT纤维素亲和柱分离纯化mRNA。,2. 逆转录合成cDNA,cDNA第一链合成,cDNA第一链合成的注意事项,合成效率低 cDNA长度应为0.7-8kb 各种反转录酶只能存于-20，不可-70 ,方法：合成cDNA第一链5AAAAAA 3 mRNA TTTTTTT 5 cDNA 1Oligo(dT)，反转录酶d NTP, 合成cDNA第二链 AAAAAA 3 cDNA 2TTTTTTT 5RNase H，DNA聚合酶, dNTP5 AAAAAA 3 双链 cDNA 3 TTTTTTT
5、5,cDNA第二链合成 方法：自身引导法 第一链合成过程中形成cDNA/RNA杂交分子变性，降解RNA 单链cDNA分子的3末端自身环化，形成发夹结构 以此为引物，在DNA聚合酶作用下合成第二链,缺点：S1核酸酶,置换合成法,焦磷酸钠存在下合成cDNA的第一链 RNAaseH酶降解RNA RNA链上出现切口 产生一系列带3-OH的RNA引物 大肠杆菌DNA聚合酶合成cDNA的第二链,PCR法,3.构建cDNA文库,（1）修饰cDNA两端接头：人工合成的双链寡核苷酸， 二端均为平头或含酶切位点。衔接头：一端为平头，一端为粘末端。,（2）cDNA与载体相连各cDNA各自与一个载体在T4连接酶作用下
6、以粘末端互相连接，即为重组DNA 分子。,（3）导入宿主细胞重组体在一定条件下导入宿主细胞培养或保存。宿主细胞必须是来自一个细胞的克隆体，以保证它们的遗传性状相同。,4.筛选目的基因,核酸杂交法： cDNA克隆（菌斑或噬菌斑） 硝酸纤维素膜 杂交（DNA探针） 显影定位 挑选 培养扩增 纯化,2 3,二、构建基因组文库,1. 分离纯化基因组DNA条件应温和，以保证得到较长的DNA链2. DNA片段与载体连接基因组DNA 酶水解 具一定长度的片段（粘性末端）载体（噬菌体等） 酶解 与目的基因连接,3.导入宿主细胞：携带基因组DNA片段的噬菌体或粘粒经包装后转入宿主细胞内培养扩增。插入基因组片段的
7、集合体即基因组文库。,4. 筛选目的基因原核细胞不可用来作为基因的表达系统 （无转录后加工）。原核细胞基因库只能用核酸探针杂交筛选目的基因。,三、人工合成目的基因DNA片段,1. DNA的化学合成 2. DNA的酶促合成（首先需要有目的基因 DNA或与之互补的RNA链作为模板）,四、聚合酶链反应合成DNA片段（见PCR章）,4,五、其他方法,1. 构建差示文库(differential library),差示文库：反映不同组织细胞或同一种细胞在不同功能状态下基因表达差异的 cDNA文库。 研究目的：研究细胞的发育、分化、细胞的分裂周期、细胞对药物和生长因子的诱导反应以及肿瘤等疾病。,差示文库构
8、建流程,F细胞mRNA ,。, ,F细胞中特异表达的cDNA 文库（即差示文库）,（F细胞cDNA第一链） 代表F细胞特异表达的基因,（H细胞mRNA）,。 。 。,2.mRNA差异显示(differential display),(1) PCR扩增(2) 电泳分离（测序胶）,PCR产物在4%的测序胶上进行电泳 cDNA单链被分离，在对应组间可发现cDNA的差异,模板：一组对应的RNA或mRNA 引物： 逆转录合成的cDNA可覆盖所有mRNA，再行PCR扩增。,第二节 目的基因分离方法的选择原则,一、根据获得目的基因的目的选择方法,基因组文库基因组全部测序、结构分析、基因识别，需构建基因组文库
9、，从中获得基因（HGP）。 cDNA文库研究基因表达或大量合成多肽、蛋白质用于生物制药等。 差异显示对比某一种或几种变异的基因（差异）。,二、根据目的基因的特点选择方法,基因组文库：cDNA文库：P C R：,包括某种生物的全部遗传信息，任何信息都可从中筛选，但某一个基因在其中所占比例很小，筛选难度大。,包含所有正在表达的mRNA基因，不包含基因中的内含子和rRNA、tRNA等基因及所有不转录部分。,须知与目的基因特异互补的二端的引物。,三、根据实验室的设备和条件选择方法,已有多种哺乳动物的cDNA文库商品化，只要有与目的基因互补的探针，便可筛选。具备PCR仪、DNA合成仪等，均可采用相应方法
10、获得目的基因。,第三节 目的基因序列测定,目的基因序列测定 精确研究该基因结构和功能的前提 发现异常基因的依据。,一、双脱氧链终止法（Sanger法）,原理DNA链中的戊糖在3位碳原子上有-OH基团，在 DNA合成、链的延长过程中，新掺入的脱氧核苷酸5-p与前一核苷酸的戊糖3-OH以磷酸二酯键相连。,Sanger法是在反应体系中加入 2, 3 -ddNTP，由于其没有 3-OH 而不能与下一个核苷酸相连，于是DNA链的合成便终止。,5GAGTCACACTTGAC 3待测单链DNA,3CTG 5引物、Klenow酶、 dATP、dGTP、dCTP、dTTP 和少量-32P-dATP,加ddATP
11、反应 3ACTG 5 3AACTG 5 3AGTGTGAACTG 5,加ddCTP反应 3CAGTGTGAACTG 5 3CTCAGTGTGAACTG5,加ddTTP反应 3TGAACTG 5 3TGTGAACTG 5 3TCAGTGTGAACTG5,加ddGTP反应 3GAACTG 5 3GTGAACTG 5 3GTGTGAACTG5,GAGTCACACTT,变性凝胶电泳、 放射自显影,A C T G,5,模板,纯化的单链DNA 片段，克隆入噬菌体M13中变性的双链DNA片段，克隆入pUC, pGEM, Bluescript等质粒中纯化的PCR产物，不经亚克隆可直接作为测序模板,引物,与模板
12、链特定序列互补的寡核苷酸通用引物与位于靶DNA侧翼的载体序列相互补的寡核苷酸（1529nt）特异引物与靶DNA链序列互补的寡核苷酸,DNA聚合酶,Klenow片段大肠杆菌DNA聚合酶I大片段，持续合成能力较低、随机从模板解离而终止链的延伸 Sequenase经化学修饰的 T7噬菌体DNA聚合酶，活性稳定，持续合成能力强，聚合速度高,序列识读,自下而上，5 3 所读序列为模板的互补链,二、化学裂解法（Maxam-Gilbert法）,原理 使特定的碱基首先被化学修饰，然后再经化学 处理。如：用硫酸二甲酯使鸟嘌呤甲基化，然 后再加哌啶，使甲基化的鸟嘌呤丢失，DNA链 从鸟嘌呤修饰处后的3，5-磷酸二
13、酯键断裂。,三、自动测序仪测序法 (ABI),自动测序仪基于2，3-双脱氧末端终止法的原理，标记系统由放射性核素改为发特定荧光信号的荧光染料，预先将四种荧光染料与四种双脱氧核苷三磷酸共价相连，使其带有不同的荧光标记。当某一种ddNTP掺入到正在合成的DNA单链分子中时，该链的延伸便终止并带有相应的荧光染料。自动测序系统包括电泳分离系统、荧光检测装置、计算机成像系统及分析软件组合。,6,序 列 图 谱,(ABI PRISM 377),四、测序策略,确证性测序次级克隆DNA的插入方向，定点突变、删切产物的鉴定、待表达基因阅读框架的确认等未知序列的测定确定一个未知DNA序列的准确长度和核甘酸排列顺序,大片段未知序列的测定策略,随机克隆法（先水解再亚克隆） 限制性酶切片段亚克隆法 互套缺失法（定向连续次级克隆）,复习思考题,简述双脱氧末端终止法测序的原理。,
