1、第二章 基因工程制药,2,第一节 概述 第二节 基因药物生产的基本过程 第三节 目的基因的获得 第四节 基因表达 第五节 基因工程菌的稳定性 第六节 基因工程菌生长代谢的特点 第七节 基因工程菌发酵 第八节 基因工程药物的分离纯化 第九节 基因工程药物的质量控制 第十节 基因工程药物制造实例,3,一、基因的概念: DNA分子中含有特定遗传信息的一段核苷酸序列，是遗传物质的最小功能单位。,基因工程的基础知识,4,基因可自我复制 基因决定蛋白质结构 基因可突变 基因按功能分为结构基因；调控基因,二、基因的一般特性,5,1-DNA的结构 四种核苷酸（A T C G）连接。DNA二级结构为双螺旋结构。
2、 2-DNA的性质与功能 吸收光谱260 电场中泳动 变性 复性 杂交,三、DNA的结构与性能,6,（一）DNA的复制半保留复制,四、 DNA的复制与表达,7,（二）基因表达, 转录：在RNA聚合酶的催化下以DNA为模板合成mRNA的过程。转录后加工：剪切：除去内含子加帽：5加m7Gppp加尾：3加poly（A）,8,2、翻译：以mRNA为模板，tRNA作为运载工具,将活化的氨基酸在核糖体上合成蛋白质的过程。（1）分为三个阶段：起始 延长终止,9, 基因工程: 通过对Nucleic acid 分子的Insert，Assemble and Recombinant而实现遗传物质的重新组合，再借助V
3、irus ，Bacterium ，Plasmid or other Vectors，将Target gene转移到新的 Host Cell System，并使Target Gene在新的Host cell system 进行Replication and Expression的技术。 基因工程主要研究任务: Gene isolation ，synthesis ， Incision(切割)，recombinant ，transformation and expression. Gene Manipulation/Gene cloning/DNA recombination. 基因工程技术最成功的
4、成就: 用于新型生物技术药物的研制,五、基因工程,10,基因工程基本过程,11, 传统制药存在的问题：A、材料来源困难或制造技术问题而无法付诸应用；B、从动物脏器中提取出来，也因造价太高，或因来源困难而供不应求；C、由于免疫原性等缘故，使它们在使用上受到限制。 基因工程技术的特点： 能够十分方便有效地生产许多以往难以大量获取的生物活性物质，甚至可以创造出自然界中不存在的全新物质。,第一节 概述,12,基因工程技术的应用特点：A、为癌种、病毒性疾病、心血管疾病和内分泌疾病的预防、治疗和诊断提供新型疫苗、新型药物和新型诊断试剂。B、基因工程技术的最大好处在于它能从极端复杂的机体细胞内取出所需要的基
5、因，将其在体外进行剪切拼接、重新组合，然后转入适当的细胞进行表达，从而生产出比原来多数百、数千倍的相应的蛋白质。,13,利用基因工程技术生产药品的优点：,（1）可以大量生产过去难以获得的生理活性蛋白和多肽（如胰岛素、干扰素、细胞因子等），为临床使用提供有效的保障； （2）可以提供足够数量的生理活性物质，以便对其生理、生化和结构进行深入的研究，从而扩大这些物质的应用范围； （3）利用基因工程技术可以发现、挖掘更多的内源性生理活性物质；,14,（4）内源性生理活性物质在作为药物使用时存在的不足之处，可通过基因工程和蛋白质工程进行改造和去除。如白细胞介素-2的第125位半胱氨酸是游离的，有可能引起-
6、S-S-键的错配而导致活性下降，如将此半胱氨酸改为丝氨酸或丙氨酸，白细胞介素-2的活性以及热稳定性均有提高； （5）利用基因工程技术可获得新型化合物，扩大药物筛选来源。,15,“863”高技术计划在生物技术领域研究的三个主题之一是： 新型药物、疫苗和基因治疗，重点是利用现代生物技术手段，开发化学合成法难以生产的药品。,16,第二节 基因工程药物生产的基本过程,17,目的基因的克隆 构建DNA重组体 将DNA重组体转入宿主菌构建工程菌 工程菌的发酵 外源基因表达产物的分离纯化 产品检验等。,基因工程药物制造的主要程序：,18,获得目的基因,组建重组质粒,培养工程菌,构建基因工程 菌或细胞,产物分
7、离纯化,除菌过滤,半成品检定,包装,成品检定,基因工程药物制备的一般过程,19,上游阶段： 主要是分离目的基因、构建工程菌(细胞)。 目的基因获得后，最主要的就是目的基因的表达。 选择基因表达系统主要考虑的是保证表达的蛋白质的功能，其次是表达的量和分离纯化的难易。 此阶段的工作主要在实验室内完成。,基因工程药物生产的上游和下游,20,下游阶段： 从工程菌的大量培养一直到产品的分离纯化和质量控制。 此阶段是将实验室的成果产业化、商品化，主要包括工程菌大规模发酵最佳参数的确立，新型生物反应器的研制，高效分离介质及装置的开发，分离纯化的优化控制，高纯度产品的制备技术，生物传感器等一系列仪器仪表的设计
8、和制造，电子计算机的优化控制等。,21,第三节 目的基因的获得,问题：来源于真核细胞的产生基因工程药物的目的基因，为什么不能进行直接分离？ 对于真核细胞来源的目的基因，不能直接进行分离。真核细胞中单拷贝基因仅是染色体DNA中的很小一部分，多拷贝基因也极少，因此从染色体中分离纯化目的基因是很困难的。 另外，原核表达系统有局限性，缺乏mRNA的转录后加工。,22,为了克隆编码某种特异蛋白质多肽的DNA序列，可从产生该蛋白质的真核细胞中提取mRNA，以其为模板，在逆转录酶的作用下，反转录合成该蛋白质mRNA的互补DNA（cDNA第一链），再以cDNA第一链为模板，在逆转录酶或DNA聚合酶I（或者Kl
9、enow大片段）作用下，最终合成编码该多肽的双链DNA序列。 cDNA与模板mRNA序列严格互补，而不含内含子。,一、反转录法,目的基因的获取途径：,23,1、mRNA的纯化 2、cDNA第一链的合成 3、cDNA第二链的合成 4、cDNA克隆 5、将重组体导入宿主细胞 6、cDNA文库的鉴定 7、目的cDNA克隆的分离和鉴定,24,cDNA克隆示意图,mRNA,逆转录酶,ss-DNA,逆转录酶,ds-cDNA,ds-cDNA,25,1、mRNA的纯化,a. 细胞内RNA的组成和含量:DNA:95%核内，5细胞器RNA：75细胞质，10%核内，15%细胞器rRNA80-85%;tRNA10-1
10、5%;mRNA1-5%b. 真核细胞mRNA 的特点及分离纯化方法。3-polyA（20-250AAA）-oligo(dT),26,在真核细胞中mRNA的3末端常含有一多聚腺苷酸polyA组成的末端，长达20250个腺苷酸，可采用Oligo dT-纤维素，以亲和层析法将mRNA从细胞总RNA中分离出来。洗脱方法：是高浓度盐溶液使mRNA特异结合于寡聚dT，再以低盐溶液和蒸馏水将其洗脱，经过两次寡聚dT，可得到较纯的mRNA。,27,纤维素柱纯化Poly(A)mRNA 流程图,28,2、cDNA第一链的合成,一般mRNA都带有3-polyA，所以可用寡聚dT作为引物，在反转录酶的催化下，合成cD
11、NA链。,29,3、cDNA第二链的合成,先用碱解或RNaseH酶解的方法除去cDNA-mRNA杂交链中的mRNA链，然后以cDNA第一链为模板合成第二链。 由于第一链cDNA链3末端往往形成一个发夹形结构，所以，可以从这一点开始合成cDNA第二链。 此反应是在DNA聚合酶I催化下完成的。核酸酶S1专一性切除单链DNA，因此用它可以切除发夹结构。,30,4、cDNA克隆,用于cDNA克隆的载体有两类：质粒DNA（如pUC、pBR322等）和噬菌体DNA（如gt10、 gt11等）。 根据重组后插入的cDNA是否能够表达、能否经转录和翻译合成蛋白质，又将载体分为表达型和非表达型载体。,31,pU
12、C及gt11为表达型载体，在cDNA插入位置的上游具有启动基因顺序；而pBR322及gt10为非表达型载体。在cDNA克隆操作中应该根据不同的需要选择适当的载体。 cDNA插入片段小于10kb，可选质粒载体，如大于10kb则应选用噬菌体DNA为载体。 选用表达型载体可以增加目的基因的筛选方法，有利于目的基因的筛选。,32,cDNA片段与载体的连接,方法一：加同聚尾连接用3末端脱氧核苷酸转移酶催化，使载体与cDNA的3末端带上互补的同型多聚体序列，如载体加上polyC（或A）的尾巴，则cDNA加上polyG（或T）的尾巴，这两种粘性末端只能使载体与cDNA连接而不能自我环化，借助同型多聚体的退火
13、作用形成重组分子，最后用T4DNA连接酶封口。,33,34,方法二：加人工接头连接 用T4DNA连接酶在平末端接上人工接头可以使DNA发生连接。 所谓人工接头是指人工合成的、连接在目的基因两端的含有某些限制酶切位点的寡核苷酸片段。cDNA连上人工接头后，用该种限制酶酶切就可得到粘性末端，从而能够与载体连接； cDNA中也可能也带有同样的限制酶切点，为了保护cDNA不受限制酶破坏，可在加接头前用甲基化酶修饰这些限制酶切位点。,35,36,5、将重组体导入宿主细胞,体外包装的噬菌体，感染感受态大肠杆菌形成噬菌斑；或转化感受态大肠杆菌使质粒进入细胞内。,37,6、cDNA文库的鉴定,根据重组体的表型
14、进行筛选，主要有抗性基因失活法和菌落或噬菌斑颜色改变法。然后采用凝胶电泳、分子杂交、DNA序列分析测定等方法进行进一步筛选和鉴定。,38,genomic library,39,cDNA library,40,7、目的cDNA克隆的分离和鉴定,从cDNA文库中分离特异的cDNA克隆，主要采用： （1）核酸探针杂交法用层析和高分辨电泳等技术纯化微克量的目的蛋白质，根据目的蛋白质纯品的氨基酸序列分析结果，人工合成相应的单链寡核苷酸作为探针，从cDNA文库中分离特异cDNA克隆。,41,（2）免疫反应鉴定法在既无可供选择的基因表型特征，又无合适探针的情况下，本法是重要途径。用表达型载体构建的cDNA文
15、库，可用免疫学方法分组逐一鉴定各cDNA的表达产物，即以某种蛋白质的抗体寻找相应的特异cDNA克隆。,42,二、化学合成法,较小的蛋白质和多肽的编码基因可以用人工化学合成法获得。化学合成法有个先决条件是：必须知道目的基因的核苷酸排列顺序，或知道目的蛋白质的氨基酸顺序，再按相应的密码子推导出DNA的碱基系列。 方法：合成目的基因DNA不同部位的两条链的寡核苷酸短片段，再退火成为两端形成粘性末端的DNA双链片段，然后将这些双链片段按正确的次序进行退火连接成较长的DNA片段，再用连接酶连接成完整的基因。,43,人工化学合成基因的限制：a. 不能合成太长的基因。最长50-60bp，只适用于克隆小分子肽
16、的基因。b. 人工合成基因时，遗传密码的简并会为选择密码子带来很大困难， 如用氨基酸顺序推测核苷酸序列，得到的结果可能与天然基因不完 全一致，易造成中性突变。c. 费用太高。,44,克隆蛋白质药物基因的一个主要目的是为了高效的表达该基因，从而大量地市场原本难以获得的药物。基因表达是指结构基因在生物体中的转录、翻译以及所有加工过程。基因高效表达研究是指外源基因在某种细胞中的表达活动，即剪切下一个外源基因片段，拼接到另一个基因表达体系中，使其能获得既有原生物活性又可高产的表达产物。进行基因表达研究的主要问题是目的基因的表达产量、表达产物的稳定性、产物的生物学活性和表达产物的分离纯化。因此，建立最佳
17、的基因表达体系，是基因表达设计的关键。,第四节 基因表达,45,一、宿主细胞的选择宿主细胞的基本要求： 容易获得较高浓度的细胞； 能利用易得廉价原料； 不致病、不产生内毒素； 发热量低，需氧低，适当的发酵温度和细胞形态； 容易进行代谢调控； 容易进行DNA技术操作； 产物的产量、产率高，且易提取纯化。,46,宿主细胞的分类： 原核细胞，常用的有大肠杆菌、枯草芽孢杆菌、链霉菌等； 真核细胞，常用的有酵母、丝状真菌、哺乳动物细胞。,47,1、原核细胞,（1）大肠杆菌 大肠杆菌表达基因工程产物的形式：细胞不溶性表达（包含体）、细胞内可溶性表达、细胞周质表达等，极少数情况下还可分泌到细胞外表达。不同的
18、表达形式具有不同的表达水平，且杂质的含量和种类也会变化。,48,大肠杆菌中的表达的特点： 不存在信号肽，产品多为胞内产物； 分泌能力不足，真核蛋白质常形成不溶性的包含体，产物须在下游处理过程中经过变性和复性处理才能恢复其生物活性； 不存在翻译后修饰作用； 翻译通常从甲硫氨酸的AUG密码子开始，故目的蛋白质的N端常多余一个甲硫氨酸残基，容易引起免疫反应； 产生的内毒素难以除去； 产生的蛋白质酶会破坏蛋白质。,49,（2）枯草芽孢杆菌 分泌能力强，可以将蛋白质产物直接分泌到培养液中，不形成包含体。 该菌也不能使蛋白质产物糖基化，另外由于它有很强的胞外蛋白酶，会对产物进行不同程度的降解，因此在外源基
19、因克隆表达的应用中受到影响。,50,（3）链霉菌 其是重要的工业微生物，近年来作为外源基因表达体系正日益受到人们的重视。 其主要特点是：不致病、使用安全，分泌能力强，可将表达产物直接分泌到培养液中，具有糖基化能力，变铅青链霉菌限制修饰能力弱，可以作为理想的受体菌。现已构建了一系列有效的载体，下游培养工艺也已经成熟。,51,2、真核细胞,（1）酵母 真核生物细胞，故有后翻译过程；基因组小，仅为大肠杆菌的4倍； 世代时间短，有单倍体和双倍体两种形式；基因操作与原核生物相似；可以建立有分泌功能的表达系统，将产物分泌出胞外，分离纯化工艺相对简单。 酿酒酵母（Saccharomyces cerevisi
20、ae）的应用历史最为悠久，研究资料也最丰富。,52,（2）丝状真菌 近年来，已在约30种以上丝状真菌中建立了DNA转化系统。 其特点是：有很强的蛋白分泌能力；能正确进行翻译后加工，包括肽剪切和糖基化等，而且其糖基化方式与高等真核生物相似；丝状真菌（如曲霉等）等又确认是安全菌株，有成熟的发酵和后处理工艺。,53,（3）哺乳动物细胞：由于外源基因的表达产物可由重组转化的细胞分泌到培养液中，培养液成分完全由人控制，从而是产物纯化变得容易。产物是糖基化的，接近或 类似于天然产物。 但动物细胞生产慢，生产率低，而且培养条件苛刻，费用高，培养液浓度较稀。虽然从理论上讲，各种微生物都可以用于基因表达，但由于
21、克隆载体、DNA导入方法以及遗传背景等方面的限制，目前使用最广泛的宿主菌仍然是大肠杆菌和酿酒酵母。,54,二、大肠杆菌体系中的基因表达,（一）表达载体表达载体必须具备的条件： （1）载体能独立地进行复制：分严紧型和松 （2）应具有灵活的克隆位点和方便的筛选标记，且克隆位点位于启动子序列后，以便外源基因表达。 （3）应具有很强的启动子，能为大肠杆菌的RNA酶所识别。,55,（4）应具有阻遏子，使启动子受到控制，只有当诱导时才进行转录。阻遏子的阻遏作用可以由物理（如温度）、化学（如IPTG、IAA等）因素进行调节，因而可人为地选择启动子启始转录mRNA的时机，以获得外源蛋白质表达合成的最佳时机。外
22、源基因的高效表达往往会抑制宿主细胞的生长、增殖，而阻遏子可使宿主细胞免除此不良影响。,56,（5）应具有很强的终止子，以便使RNA聚合酶集中力量转录克隆的外源基因，而不转录其他无关的基因，同时，很强的终止子所产生的mRNA较为稳定。诱导表达时，由于强启动子所致的高水平转录反过来还会影响质粒DNA本身的复制，从而引起质粒的不稳定或脱质粒现象，因此表达载体需在外源基因的下游安置一个强转录终止子，以克服由质粒转录引进的质粒不稳定。,57,（6）所产生的mRNA必须具有翻译的起始信号，即起始密码AUG和SD序列（Shine-Dalgarno sequence），以便转录后能顺利翻译。两个基因工程药物研
23、究中常用的表达载体：pBV220系统和pET系统。,58,常用表达载体 - 质粒pBV220的结构,59,（二）影响目的基因在大肠杆菌中表达的因素,60,（1）外源基因的拷贝数 （2）外源基因的表达效率启动子的强度核糖体结合位点的有效性SD序列和起始密码ATG的间距密码子的组成,61,（3）表达产物的稳定性组建融合蛋白；利用大肠杆菌的信号肽或真核多肽中自身的信号肽； 采用位点突变的方法；选用蛋白酶缺陷型大肠杆菌为宿主细胞，可能会减弱表达产物的降解。如黄嘌呤核苷（Ion）是大肠杆菌合成蛋白酶的主要底物，Ion-营养缺陷型大肠杆菌不能合成黄嘌呤核苷，从而不能合成蛋白酶，减少了表达产物在细胞体内的降
24、解。,62,（4）细胞的代谢负荷 外源基因的表达产物属于异己物质，并可能对宿主细胞有毒性。调节表达物质的积累与细胞的生长和代谢之间的平衡有利于外源基因的高效表达。 通过将细胞的生长和外源基因的表达分成两个阶段，或将宿主细胞的生长与重组质粒的复制分开两种手段也可以减轻细胞代谢的负荷。 形成不溶性的包含体可以降低表达产物对宿主细胞的毒害作用。,63,（5）工程菌的培养条件 除宿主、载体和克隆基因三者之间的关系影响外源基因的高水平表达外，培养条件亦是非常值得研究的因素。以后会对其进行详细的介绍。,64,（三）真核基因在大肠杆菌中的表达形式,（1）融合蛋白的形式药物基因 （2）非融合蛋白的形式表达药物
25、基因 （3）分泌型表达蛋白药物基因,65,以融合蛋白的形式表达药物基因 以原核多肽和真核蛋白结合在一起称融合蛋白。优点：操作简便，表达蛋白在菌体内稳定，易实现高效表达；缺点：只能作抗原用。,66,以非融合蛋白的形式表达药物基因非融合蛋白指在大肠杆菌中表达的蛋白质以真核蛋白的mRNA的AUG为起始，在其氨基端不含细菌多肽序列。优点：保持原有蛋白活性；缺点：易被蛋白酶破坏。,67,通过将外源基因融合到编码原核蛋白信号肽序列的下游来实现。 特点：一些可被胞内蛋白酶所降解的蛋白质在周质中是稳定的；由于有些蛋白质能按一定的方式折叠，所以在细胞内表达时无活性的蛋白质分泌表达时却具有活性；蛋白信号肽和编码序
26、列之间能被切割，因而分泌蛋白质不含起始密码AUG所编码的甲硫氨酸等。 缺点：产量不高、信号肽不被切割或不在特定位置上切割等。, 分泌型表达药物基因,68,主要基因工程表达体系比较,69,第五节 基因工程菌生长代谢的特点,菌体的生长通常用比生长速率来表示。工程菌培养可通过选用不同的碳源、控制补料和等方法来控制菌体的生长。控制菌体的生长对提高质粒的稳定性、减少代谢副产物积累,提高外源蛋白产率有重要意义。,70,一、菌体的生长与能量的关系,碳源物质是组成培养基的主要成分。碳源物质为细胞提供能量，当菌体生长所需能量大于菌体有氧代谢提供的能量时，菌体会产生乙酸，导致培养基的pH值下降，从而影响菌体的生长
27、。适当提高pH，可减少乙酸的抑制作用。,71,分批培养中选择不同的碳源，补料培养中通过控制补料速度，连续培养中控制稀释速率等都能一定范围内控制菌体的生长，从而控制乙酸的产生，减少它的抑制作用。加入蛋氨酸和酵母提取物都能减少乙酸的产生。,72,二、菌体生长与前体供应的关系,基因工程菌质粒的表达需与宿主细胞竞争共同的前体和催化结构，致工程菌生长速率降低。在基础培养基中加入氨基酸（小分子前体）能使菌体比生长率提高，蛋白合成增加。,73,第六节 基因工程菌的不稳定性,基因工程菌在传代过程中常出现质粒不稳定的现象。 质粒不稳定可分为：分裂不稳定结构不稳定,一、质粒不稳定性,74,分裂不稳定：指工程菌分裂
28、时出现一定比例不含质粒子代菌的现象。结构不稳定：指外源基因从质粒上丢失或碱基重排、缺失所致工程菌性能的改变,75,常见分裂不稳定的两个因素：, 含质粒菌产生不含质粒子代菌的频率质粒丢失率与宿主菌、质粒特性和培养条件有关。 这两种菌比速率差异的大小,76,质粒稳定性的分析方法,不含抗性标记抗生素平板培养基,10-12h,100个菌落,含抗性标记抗生素 平板培养基,10-12h,统计生长菌落数,重复三次,计算比值(稳定性stability),样品,77,二、提高质粒稳定性的方法,1、选择合适的宿主菌 2、选择合适的载体 3、选择压力 4、分阶段控制培养 5、控制培养条件 6、固定化,78,第七节
29、基因工程菌发酵,基因工程菌的培养过程主要包括： 1、实验室：通过摇瓶操作了解工程菌生长的基础条件，如温度、pH、培养基各种组分以及碳氮比，分析表达产物的合成、积累对受体细胞的影响； 2、中试：获得大量产品，提供数据供生产设计时参考。 3、工业生产 4、高密度发酵,79,中试,中间阶段的试验；正式投产前的试验 中试是在大规模产量前的较小规模试验 在确定一个项目前，第一要进行试验室试验；第二步是“小试”，也就是根据试验室效果进行放大；第三步是“中试”，就是根据小试结果继续放大。中试成功后基本就可以量产了。 成果产业化的成败主要取决于中试的成败。,80,基因工程菌中试应考虑的问题：,适宜商品化生产的
30、工程菌，设计发酵反应器，选择反应过程，发酵培养基组分，维持生产工艺最佳化的方法，工艺监测方法，工艺控制方法，工艺自动化使用方法，生物催化剂使用，产品提取方法的选择，分离精制技术的选择。,81,(1) 工程菌选择能用一般基因重组技术获得，有高产潜力，能用工业原料为培养基，生产工艺能采用一般工业生产经验，能产生和分泌蛋白质，不致病，无毒性，能安全生产，符合国家卫生部门有关规定，产品有特异性，发酵液粘度小。,82,(2) 反应器设计 (3) 发酵培养基组成提供化学元素（碳、氮等）提供特殊营养源（AA,Vitamine）提供能源(葡萄糖)控制代谢,83,(4) 工艺最佳化与参数监测控制 工艺最佳化是指
31、最快周期，最高产量，最好质量，最低消耗，最大安全性，最周全的服务处理效果，最佳化速度与最低失败率等的综合指标。 参数监测控制需监测与控制的4种参数：A，主要参数：pH,温度，溶氧；B，生物量：浑浊度，细胞组分，总氮量及菌丝干重；C，碳源：糖，有机酸，淀粉；D，产品,84,(5) 计算机的应用,以计算机兼容的传感器，监测生物反应各项参数。 计算机记录与控制全部生产过程的数据，使工艺最佳化，产品产量和质量不断提高，原材料和能耗不断下降，成本不断降低。 经计算机技术，确定对控制微生物生长最重要的因素，模拟出一个高质、高产、低成本生产工艺最佳化的控制微生物数学公式。,85,良好的的发酵工艺对表达外源蛋
32、白至关重要，直接影响到产品的质量和生产成本，觉得产品在市场上的竞争力。,重组工程菌的培养,86,一、基因工程菌的培养方式,1、分批培养 2、补料分批培养 3、连续培养 4、透析培养 5、固定化培养,87,二、基因工程菌的发酵工艺,生物工程菌与传统发酵的区别：生物材料不同；生物工程菌的发酵目的。 工艺要求：外源基因既高效表达，又有利于产品分离纯化。,88,对发酵影响较大的几个因素有： 培养基 接种量的影响 温度 溶解氧的影响 诱导时机的选择 pH的影响,89,1、培养基的影响培养基的组成既要提高工程菌的生长速率，又要保持工程菌的稳定性，使外源基因高效表达。常用的碳源：葡萄糖、甘油、乳糖、甘露糖、
33、果糖等。常用的氮源：酵母提取液、蛋白胨、酪蛋白水解物、玉米浆、氨水、硫酸铵、氯化铵等。还有无机盐、维生素等。,90,不同的碳源对菌体的生长和外源基因表达有较大的影响。使用葡萄糖和甘油对菌体比生长速率及呼吸强度相差不大。但使用甘油菌体得率较大，而使用葡萄糖菌体产生的副产品较多。葡萄糖对lac启动子有阻遏作用。乳糖对lac启动子有利。,91,在氮源中，酪蛋白水解物有利于产物的合成与分泌。色氨酸对trp启动子控制的基因有影响。无机磷在许多代谢反应中是一个效应因子，磷浓度不同，影响菌体生长。,92,接种量是指移入的种子液体积和培养液体积的比例。接种量的大小影响发酵的产量和发酵周期。接种量小，菌体延迟期
34、较长，使菌龄老化，不利于外源基因表达。,2、 接种量的影响,93,接种量大，可缩短生长延迟期，菌体迅速繁衍，很快进入对数生长期，适于表达外源基因。接种量过高，使菌体生长过快，代谢物积累过多，反而会抑制后期菌体的生长。,94,3、温度的影响,温度对基因表达的调控作用发生在复制转录翻译和小分子调节分子的合成等水平上。温度对发酵过程的影响是多方面的。它影响各种酶的反应速度，改变菌体代谢产物的反应方向，影响代谢调控机制。,95,适宜的发酵温度是既适合菌体的生长，又适合代谢产物合成的温度。高温或低温都会使发酵异常，影响终产物的形成并导致减产。温度还影响蛋白质的活性和包含体的形成。,96,4、溶解氧的影响
35、,对于好氧发酵,溶解氧浓度是重要的参数。 好氧微生物利用溶解于培养液中的氧气进行呼吸。 若能提高溶氧速度和氧的利用率，则能提高发酵产率。,97,外源基因的高效表达需要大量的能量，促进细胞的呼吸作用，提高对氧的需求。维持较高的DO2值，才能提高工程菌的生长，利于外源蛋白产物的形成。采用调节搅拌转速的方法,可改变培养过程中的氧供给，提高活菌产量。,98,5、诱导时机的影响,对于P启动子型的工程菌，使用cI阻遏蛋白的温度敏感型突变株（clts857），在2830 0C下培养时，该突变体能合成有活性的阻遏蛋白阻遏PL启动子的转录；当温度升高42 时，该阻遏蛋白失活，使启动子启动转录，提高目的基因的表达
36、效率。一般在对数生长期或对数生长后期升温诱导表达。,99,6、pH的影响,pH对细胞的正常生长和外源蛋白的高效表达都有影响，所以应根据工程菌的生长和代谢情况，对pH进行适当的调节。,如采取两段培养工艺，培养前期重点是优化工程菌的生长条件，其最佳pH在6.87.4左右;培养后期重点是优化外源蛋白的表达条件,其最佳pH为6.06.5。,100,总之，最佳化的工艺是获得:最快周期、最高产量、最好质量、最低消耗、最大安全性、最周全的废物处理效果、最佳速度和最低失败率等。,101,应用发酵罐大规模培养基因工程菌。它不同于微生物发酵，微生物发酵目的是为了获得初级或次级代谢产物，细胞生长并非主要目标，而基因
37、工程发酵是为了获得最大量的基因表达产物。新型自动化发酵罐。,三、基因工程菌的培养设备,102,发酵罐的组成：发酵罐体、保证高传质作用的搅拌器、精细的温度控制和灭菌系统、空气无菌过滤装置、残留气体处理装置、参数测量与控制系统、培养液配制和连续操作系统。,103,对发酵罐要求：提供菌体生长最适生长条件;培养过程不得污染;保证纯菌培养;培养及消毒过程不得游离异物，不能干扰细菌代谢活动等。,104,105,高密度发酵,高密度发酵是一个相对概念，一般指培养基中工程菌的菌体浓度在50gDCW/L以上，理论上的最高值可达200gDCW/L。 高密度发酵是大规模制备重组蛋白质过程中不可缺少的工艺步骤。 高密度
38、发酵可以提高发酵罐内的菌体密度，提高产物的细胞水平量，相应减少了生物反应器的体积，提高单位体积设备生产能力，降低分离费用，缩短生产周期，从而降低生产成本，提高生产效率。,106,1、影响高密度发酵的因素,培养基（营养源的种类和含量如碳氮比） 溶氧浓度（发酵罐的通气量和搅拌速度） pH（稳定） 温度 代谢副产物（乙酸、二氧化碳等）,107,2、实现高密度发酵的方法,（1）发酵条件的改进 培养基的选择 （易被工程菌利用如甘油，目前常用6g/L的甘油作为高密度发酵培养基的碳源；培养基中各组分的浓度比普通培养基高2倍）,108,建立流加式培养的方式 当碳源和氮源等营养物质超过一定浓度时可抑制菌体生长，
39、因此在分批培养中增加营养物质的浓度不能产生高密度。 补料分批发酵被广泛用于高密度发酵。,109,提高供氧能力 空气和纯氧混合通气，提高氧分压。 增加发酵罐的压力 发酵液中添加过氧化氢。,110,（2）构建出产乙酸能力低的工程化宿主菌 阻断乙酸产生的主要途径 对碳代谢流进行分流 限制进入糖酵解途径的碳代谢流 引入血红蛋白基因 （3）构建蛋白水解酶活力低的工程化宿主菌,111,第八节 基因工程药物的分离纯化,基因工程药物的分离、纯化非常重要。表达的产物都是多肽或蛋白质。它的制得具有以下特点：表达产物在初始料中含量较低；,112,含目的产物的初始物料组成复杂，含有大量细胞及代谢产物； 表达产物稳定性
40、差，易失活变性； 表达产物的种类繁多、结构不一、活性各异； 对其质量要求纯度高、无菌、无热原。,113,一、建立分离纯化工艺需了解的各种因素,1、含目的产物的起始料的特点基因工程菌的发酵产物其上游过程的各种因素对分离、纯化工艺有影响。包括：菌种的类型及其代谢特性原材料培养基的来源及其质量稳定性生产工艺及条件初始物料的理化、生物学性质,114,2、物料中杂质的种类和性质相关性和非相关性杂质的量、化学及生物学性质。 3、目的产物特性化学、物理和生物学性质4、产品质量的要求产品的质量指标，产品用途，对纯度、生物活性、比活的要求，杂质的量及影响，产品剂型、贮存稳定性等。,115,二 、分离纯化的基本过
41、程,发酵液细胞分离 胞内产物 胞外产物细胞破碎固液分离 浓缩 初步分离 高度纯化 制剂 产品包含体 细胞碎片分离变性复性,116,三、分离纯化的技术,分离纯化的技术要求： 技术条件温和能保持产物生物活性。 选择性好，能从复杂的混合物中有效的将目的产物分离，达到较高的纯化倍数。,117,收率要高 两个技术间能直接衔接，不需要对物料加以处理 纯化过程要快，满足高生产率的要求,118,1、细胞破碎与固液分离 细胞收集： 离心法、膜分离法。 细胞破碎：机械破碎法、非机械破碎法。 固液分离：离心、膜过滤、双水相分配,119,2、目的产物的分离纯化,目的产物含有大量杂质必须进行分离纯化。 蛋白质分离纯化方
42、法的设计根据其分子的理化性质和生物学特性来决定。,120,产 物 特 性 作 用等电点 决定离子交换种类及条件相对分子量 选择不同孔径的介质疏水性 与疏水、反相介质结合的程度生物特异性 决定亲和配基溶解性 决定分离体系及蛋白浓度稳定性 决定工艺采用温度及流程时间,产物的特性在分离纯化中的作用,121,重组蛋白质的分离纯化主要依赖： 色谱分离方法！,122,色谱分离法是一组相关分离方法的总称。 利用多组分混合物中各个组分物理化学性质（吸附力、分子极性、分子形状和大小、分子亲和力、分配系数等）的差别，使各组分以不同程度分配在两相中，其中一相为固定相，另一相为流动相（气体或液体）。 当多组分混合物与
43、随流动相流动时，由于各组分物理化学性质的差异，易分配于固定相的物质移动速度慢，易分配于流动相中的物质移动速度快，从而分离。,123,（1）离子交换层析（ion exchange chromatography IEC）离子交换是以离子交换剂为固定相，依据流动相中的组分离子与交换剂上的平衡离子进行可逆交换时的结合力大小的差别进行分离的一种层析方法。它具有分辨率高容量大操作容易，该法已成为多肽蛋白质核酸分离纯化的重要方法。,124,（2）疏水层析 （hydrophobic interaction chromatography，HIC）,疏水层析主要是利用蛋白质分子表面上的疏水区域和介质中的疏水基团之
44、间的相互作用力的差异，对蛋白质组分进行分离的层析方法。,125,在高盐浓度时，蛋白质分子中疏水性部分与介质的疏水基团产生疏水性作用而被吸附；盐浓度降低时蛋白质疏水性作用减弱，目的蛋白质被逐步洗脱下来，蛋白质疏水性越强，洗脱时间越长。 疏水色谱回收率较高，蛋白质变性可能性小。,126,（3）亲和层析（affinity chromatography，AC）,亲和层析是利用固定化配基与目的蛋白质之间特异的生物亲和力进行吸附，如抗体与抗原、受体与激素、酶与底物之间的作用。,127,配基：亲和层析中起可逆性结合的特异性物质。 载体：与配基结合的支撑物。 亲和层析大体可分三步：配基固定化吸附目的物样品解吸
45、,128,129,130,（4）凝胶过滤,凝胶过滤是以具有大小一定的多孔性凝胶作为分离介质，小分子能进入孔内，在柱中缓慢移动，而大分子不能进入孔内，快速移动，利用这种移动差别可使大分子与小分子分开。,131,132,根据蛋白质的相对分子量和蛋白质分子的动力学体积的大小差异，可以利用凝胶过滤来分离纯化目的蛋白。 在产品的形成阶段前用于除去产物的多聚体及降解产物。,133,3、非蛋白质杂质的去除,（1） DNA的去除 DNA在pH4.0以上呈阴离子，蛋白质的pI在6.0以上,可用阴离子交换剂吸附除去。 如蛋白质为强酸性，可选择条件使其吸附在阳离子交换剂上，而DNA不吸附。 亲和层析和疏水层析也有效
46、。,134,（2）热原质的去除 热原质是肠杆菌科产生的细菌内毒素（脂多糖）,去除困难。分子量小的多肽或蛋白质中的热原可用超滤或反渗透，脂多糖是阴离子可用阴离子交换层析除去，脂多糖是疏水性可用疏水层析法。 （3）病毒的去除 层析或过滤可将病毒去除。,135,四、选择分离纯化方法的依据,1、根据产物表达形式来选择分泌型表达产物的发酵液体积很大，但浓度较低，纯化前必须浓缩可用沉淀和超滤法。,136,产物在周质表达是介于细胞内可溶性表达和分泌表达的一种形式,它可以避开可溶性表达蛋白和培养基中蛋白类杂质,在一定程度上有利于分离纯化。为了获得周质蛋白经低浓度溶菌酶处理后,可采用渗透压休克的方法来获得。 可
47、溶性表达产物破菌后的细胞上清，首选亲和分离方法，或离子交换层析。,137,2、根据分离单元之间的衔接选择,应选择不同机制的分离单元组成一套分离工艺，尽早采用高效的分离手段。 先将最多的杂质去除，将费用最高、最费时的分离单元放在最后阶段，即通常先运用非特异、低分辨的操作单元（如沉淀超滤和吸附等），以尽快缩小样品体积，提高产物浓度，去除最主要杂质（包括非蛋白类杂质）。,138,随后采用高分辨率的操作单元（离子交换层析和亲和层析）凝胶过滤放在最后，这样可以提高分离效果。 层析分离次序的选择同样重要，合理的组合能提高分辨效率，并有利于各步骤间的过渡。如离子交换层析、亲和层析、凝胶过滤。,139,3、根
48、据分离纯化工艺的要求来选择,分离纯化工艺应遵循以下原则： （1）具有良好的稳定性和重复性 （2）尽可能减少组成工艺的步骤 （3）各技术步骤间要相互适应和协调,140,（4）工艺过程中尽可能少用试剂 （5）工艺所用时间要短 （6）工艺和技术必须高效收率高易操作能耗低 （7）具有较高的安全性,141,第九节 变性蛋白的复性,外源基因在大肠杆菌中的高表达常常导致包涵体的形成，虽然包涵体具有富集目标蛋白质、抗蛋白酶、对宿主毒性小等优点，但包涵体蛋白质的复性率一般都很低。,142,一、包涵体的形成原因,1、包涵体的定义包涵体是指细菌表达的蛋白在细胞内凝集，形成无活性的固体颗粒。,143,2、包涵体的形成
49、 主要因为重组蛋白的高水平表达。 重组蛋白缺乏蛋白折叠过程中需要的酶和辅助因子。,144,二、包涵体的分离和溶解,1、包涵体的分离重组菌破碎洗涤：除去包涵体上粘附的杂质，如膜蛋白或核酸，应用洗涤液洗涤包涵体，通常用低浓度的变性剂（如脲或盐酸胍）、去垢剂等洗涤去除膜碎片和膜蛋白。,145,2、包涵体的溶解 一般用强的变性剂如尿素、盐酸胍或硫氰酸盐。或用去垢剂，如SDS、正十六烷基三甲基铵氯化物等。 对于含有半胱氨酸的蛋白质，还需加入还原剂，如巯基乙醇、二硫苏糖醇（DTT）、二硫赤藓糖醇、半胱氨酸。 温度一般30。 金属螯合剂EDTA。,146,三、包含体蛋白复性方法,稀释复性和透析复性 含二硫键的蛋白的复性 封闭蛋白的疏水蔟促进复性 凝胶过滤层析复性 小分子添加剂促进的复性 分子伴侣或折叠酶促进的复性 人工分子伴侣的复性,
