1、第二章 基因工程制药,第一节 概述 第二节 基因药物生产的基本过程 第三节 目的基因的获得 第四节 基因表达 第五节 基因工程菌的稳定性 第六节 基因工程菌发酵 第七节 基因工程药物的分离纯化 第八节 基因工程药物的质量控制,第二章 基因工程制药,第一节 概 述,生物技术的核心就是基因工程，基因工程技术最成功的应用就是用于生物治疗的新型生物药物的研制。 传统生物药物由于来源及制备上的困难、价格等因素的影响，此外在制备过程可能受到的病毒、衣原体、支原体等的感染等问题，促使人们寻求安全、实用、疗效可靠的新方法来制备生物药物。,基因工程正在逐渐显示其在生物技术药物制备上的优势。 应用基因工程技术可十
2、分方便且有效地解决上述提到的问题，从质和量上都可以得到改进，而且可以创造全新物质。 如今，癌症、病毒性疾病、心血管疾病以及内分泌等方面的预防、治疗和诊断已可通过基因工程技术获得。,利用基因工程技术生产药品的优点：,（1）可以大量生产过去难以获得的生理活性蛋白和多肽（如胰岛素、干扰素、细胞因子等），为临床使用提供有效的保障； （2）可以提供足够数量的生理活性物质，以便对其生理、生化和结构进行深入的研究，从而扩大这些物质的应用范围； （3）利用基因工程技术可以发现、挖掘更多的内源性生理活性物质；,（4）内源性生理活性物质在作为药物使用时存在的不足之处，可通过基因工程和蛋白质工程进行改造和去除。如白
3、细胞介素-2的第125位半胱氨酸是游离的，有可能引起-S-S-键的错配而导致活性下降，如将此半胱氨酸改为丝氨酸或丙氨酸，白细胞介素-2的活性以及热稳定性均有提高； （5）利用基因工程技术可获得新型化合物，扩大药物筛选来源。基因工程技术可将不同种类和用途的基因，在原核细胞中表达的特性使其不仅在医药，而且在很多行业中都会有重要的应用。,第二节 基因工程药物生产的基本过程,基因工程技术就是将重组对象的目的基因插入载体，拼接后转入新的宿主细胞，构建工程菌（或细胞），实现遗传物质的重新组合，并使目的基因在工程菌内进行复制和表达的技术。 基因工程药物制造的主要程序是：目的基因的克隆，构建DNA重组体，将D
4、NA重组体转入宿主菌构建工程菌，工程菌的发酵，外源基因表达产物的分离纯化，产品的检验等。以上程序中的每个阶段都包含若干细致的步骤，这些程序和步骤将会随研究和生产条件的不同而改变。,DNA重组技术,基因工程药物生产的上游和下游,上 游：主要指的是目的基因分离、工程菌（或细胞）构建。上游阶段的工作主要在实验室内完成；（DNA重组技术） 下 游：主要指的是从工程菌（或细胞）的大规模培养一直到产品的分离纯化、质量控制等。,工程菌（或细胞）构建中重要的工具,该过程中重要的工具便是酶：限制性内切酶和连接酶是将所需目的基因插入适当的载体质粒或噬菌体中并转入E. coli 或其它宿主菌（细胞）大量复制目的基因
5、过程中的重要工具。 同时为保证目的基因的正确性，对目的基因要进行限制性内切酶和核苷酸序列分析。 基因表达系统就是上述的工程菌或细胞，有原核生物和真核生物两类表达系统；选择基因表达的系统主要考虑的是保证表达蛋白质的功能，其次要考虑的是表达量的多少和分离纯化的难易。,Cutting by enzymes,下游阶段在产业化中是极其重要的,下游阶段是将实验室成果产业化、商品化，主要包括工程菌大规模发酵最佳参数的确立，新型生物反应器的研制，高效分离介质及装置的开发，分离纯化的优化控制，高纯度产品的制备技术，生物传感器等一系列仪器仪表的设计和制造，电子计算机的优化控制等。 工程菌的发酵工艺不同于传统的抗生
6、素和氨基酸发酵，需要对影响目的基因表达的因素进行分析，对各种影响因素进行优化，建立适于目的基因高效表达的发酵工艺，同时建立一系列相应的分离纯化、质量控制、产品保存等技术。,第三节 目的基因的获得,对于目的基因的获得需要根据目的基因的来源采取适当的方法。 对于真核细胞来源的目的基因，是不能直接进行分离的。真核细胞中单拷贝基因仅是染色体DNA中的很小一部分，即使多拷贝基因也是极少的，因此从染色体中分离纯化目的基因是很困难的。 另外，原核表达系统是有局限性的，主要是由于真核基因的内含子及基因的后翻译过程，所以真核系统得到了相应发展。,克隆真核基因常用的方法,逆转录：逆转录酶催化的反应，即以RNA为模
7、板合成DNA的过程称为逆转录 逆转录酶 逆转录病毒：需在逆转录酶的作用下首先将RNA转变为cDNA，再在DNA复制、转录、翻译等蛋白酶作用下扩增的一类病毒。,一、逆转录法,逆转录酶及其催化特性,RNA,3 ,5 ,依赖于RNA的DNA聚合酶,RNA,3 ,5 ,核糖核酸酶H,5,3 ,5,3 ,cDNA,依赖DNA的DNA聚合酶,cDNA,杂种分子,3,5 ,5,3 ,双链DNA,新合成的双链DNA整合到寄主染色体DNA中,16,逆转录过程,一、逆转录法 1、mRNA的纯化 2、cDNA第一链的合成 3、cDNA第二链的合成 4、cDNA克隆 5、将重组体导入宿主细胞 6、cDNA文库的鉴定
8、7、目的cDNA克隆的分离和鉴定,18,cDNA文库,1、mRNA的纯化,分离纯化目的基因的mRNA极其困难种类多；总RNA总量少（2%5%）；相对分子质量大小很不一致，由几百到几千个核苷酸组成。 在真核细胞中mRNA的3末端常常含有一多聚腺苷酸polyA组成的末端，长达20250个腺苷酸，可采用Oligo dT-纤维素，以亲和层析法将mRNA从细胞总RNA中分离出来。洗脱方法是高浓度盐溶液使mRNA特异结合于寡聚dT，再以低盐溶液和蒸馏水将其洗脱，经过两次寡聚dT，可得到较纯的mRNA。,2、cDNA第一链的合成,一般mRNA都带有3-polyA，所以可用寡聚dT作为引物，在逆转录酶的催化下
9、，开始cDNA链的合成。在合成反应体系中加入一种放射性标记的dNTP，在反应中以及反应后可通过测定放射性标记的dNTP掺入量，计算出cDNA的合成效率；在凝胶电泳后，进行放射自显影分析产物的分子大小，探索最佳反应条件。 一次好的逆转录反应可使寡聚dT选出的mRNA有5% 30%被拷贝。,RT-PCR反转录PCR,mRNA-cDNA-PCR,3、cDNA第二链的合成,先用碱解或RNaseH酶解的方法除去cDNA-mRNA杂交链中的mRNA链，然后以cDNA第一链为模板合成第二链。由于第一链cDNA链3末端往往形成一个发夹形结构，所以，可以从这一点开始合成cDNA第二链。 此反应是在DNA聚合酶I
10、催化下完成的。核酸酶S1专一性切除单链DNA，因此用它可以切除发夹结构。发夹结构结构切除后，双链cDNA分子的大小常用变性琼脂糖凝胶电泳进行测定。,4、cDNA克隆,用于cDNA克隆的载体有两类：质粒DNA（如pUC、pBR322等）和噬菌体DNA（如gt10、 gt11等）。根据重组后插入的cDNA是否能够表达、能否经转录和翻译合成蛋白质，又将载体分为表达型和非表达型载体。 pUC及gt11为表达型载体，在cDNA插入位置的上游具有启动基因顺序；而pBR322及gt10为非表达型载体。在cDNA克隆操作中应该根据不同的需要选择适当的载体。 cDNA插入片段小于10kb，可选质粒载体，如大于1
11、0kb则应选用噬菌体DNA为载体。 选用表达型载体可以增加目的基因的筛选方法，有利于目的基因的筛选。,cDNA片段与载体的连接,方法一：加同聚尾连接，用3末端脱氧核苷酸转移酶催化，使载体与cDNA的3末端带上互补的同型多聚体序列，如载体加上polyC（或A）的尾巴，则cDNA加上polyG（或T）的尾巴，这两种粘性末端只能使载体与cDNA连接而不能自我环化，借助同型多聚体的退火作用形成重组分子，最后用T4 DNA连接酶封口。,cDNA片段与载体的连接,方法二：加人工接头连接，用T4 DNA连接酶在平末端接上人工接头可以使DNA发生连接。 所谓人工接头是指人工合成的、连接在目的基因两端的含有某些
12、限制酶切位点的寡核苷酸片段。 cDNA连上人工接头后，用该限制酶酶切就可得到粘性末端，从而能够与载体连接；cDNA中也可能带有同样的限制酶切点，为了保护cDNA不受限制酶破坏，可在加接头前用甲基化酶修饰这些限制酶切位点。,5、将重组体导入宿主细胞,体外包装的噬菌体，感染感受态大肠杆菌形成噬菌斑；或转化感受态大肠杆菌使质粒进入细胞内。,6、cDNA文库的鉴定,根据重组体的表型进行筛选，主要有抗性基因失活法和菌落或噬菌斑颜色改变法。然后采用凝胶电泳、分子杂交、DNA序列分析测定等方法进行进一步筛选和鉴定。,7、目的cDNA克隆的分离和鉴定,从cDNA文库中分离特异的cDNA克隆，主要采用： （1）
13、核酸探针杂交法。用层析和高分辨电泳等技术纯化微克量的目的蛋白质，根据目的蛋白质纯品的氨基酸序列分析结果，人工合成相应的单链寡核苷酸作为探针，从cDNA文库中分离特异cDNA克隆。 （2）免疫反应鉴定法。在既无可供选择的基因表型特征，又无合适探针的情况下，本法是重要途径。用表达型载体构建的cDNA文库，可用免疫学方法分组逐一鉴定各cDNA的表达产物，即以某种蛋白质的抗体寻找相应的特异cDNA克隆。,分离得到含有目的基因的阳性克隆后，必须对其作进一步的验证和鉴定，主要是进行限制酶图谱的绘制、杂交分析、基因定位、基因测序以及确定基因的转录方向、转录起始点等。 1985，PCR发明以后，RT-PCR得到了广泛的应用。,7、目的cDNA克隆的分离和鉴定,RT-PCR反转录PCR,mRNA-cDNA-PCR,二、化学合成法,人工化学合成的限制：（1）不能合成太长的基因，5060bp；（2）是人工合成时，遗传密码的简并性可导致中性突变；三是费用较高。,Thank You !,
