1、基因克隆的一般流程,基因的获得,PCR,RT-PCR,载体,连接,准备感受态细胞,转化,重组子筛选,下游工作,载体的选择,基因工程载体一般要求： 能在宿主细胞中复制繁殖，有较高的自主复制能力。 易进入宿主细胞，进入效率越高越好。 合适的多克隆位点（MCS）可接受外源片段，且不影响其进入宿主细胞和在细胞中的复制。 易从宿主细胞中分离纯化出来， 便于重组操作。 有筛选标志，当其进入宿主细胞、或携带着外源序列进入宿主细胞都能容易被辨认和分离出来。便于克隆操作。 常用的载体有质粒、噬菌体和病毒等,重组 DNA 技术的一般流程,目的DNA的获得 目的DNA与载体的连接 重组子导入受体细胞 重组子的筛选和
2、鉴定,实验一:pEGFP-NGF质粒载体的构建,NGF 基因的克隆(T-A克隆),NGF-sense: a GAGCTC aagatgctgtgcctcaagccagt NGF-antisense: at GGGCCC gtctagatcc agagtgtctg,5,6,pEGFP 荧光质粒表达载体,质粒DNA的酶切反应结果,质粒 M 酶切反应 M 酶切反应,pEGFP pT-NGF,酶切产物凝胶回收操作步骤 （Gel Extraction Kit）,仔细切下含DNA的凝胶，置一称重的1.5ml离心管中。称重。 按300lS1溶液/100mg凝胶加入的比例加入S1溶液，置50水浴10分钟，使凝
3、胶完全溶化，每2分钟颠倒混匀一次。 将溶化后的凝胶溶液移入吸附柱，置收集管中，9000g30秒，倒掉收集管中的液体，再将吸附柱放入同一收集管中。 在吸附柱中加入500l W1溶液，9000g15秒，倒掉收集管中的液体，再将吸附柱放入同一收集管中。重复一次洗柱。 将吸附柱放入同一收集管中。9000g1分钟。 将吸附柱放入一新1.5ml离心管中，在吸附膜中央加入30lddH2O，静置1分钟，9000g1分钟。备用。,重组子的筛选,耐药性基因 外源质粒赋予宿主抗生素抗性 蓝白斑筛选（互补现象） lacZ plasmid 和 M15 cell strain,关于连接酶,定义：ATP存在下，在3OH和5
4、 P之间形成磷酸二酯键。 特性：连接粘端的效率远高于平端。 策略：,首选不匹配粘端 次选匹配粘端，载体脱磷 平端连接，延长时间，提高酶量,平端连接图示,匹配粘端连接图示,不匹配粘端连接图示,连接反应的建立,连接反应的温度： 粘性末端，按A-T，G-C含量计算，5。 如 Pst I（CTGCAG，12 ），EcoRI（GAATTC，8）。 平末端，如EcoR（GATATC），可在室温进行，不超过30，酶的用量要比粘性末端加大10-100倍 。 DNA量： 摩尔数之比 载体:目的 DNA 1 : ( 13 ) 载体摩尔数 目标基因片段碱基数载体重量 目标DNA摩尔数 目标基因片段重量载体碱基数,载
5、体和目标基因的连接反应,如未定量可以按回收效率75计算DNA浓度，按载体与目的基因摩尔数比1:3进行连接。 连接反应在灭菌的0.5ml离心管中进行。15 l体积反应体系中： 加ddH2O使终体积为 15 l Liner vector 50-100 ng Target gene fragment 15- 30 ng 10Ligase Buffer (已含有ATP) 1.5 l T4 DNA Ligase 1.O l 轻轻混匀，稍加离心, 14-16或4,O/N 。,重组子转入受体细胞,体外重组的DNA引入受体细胞 感受态:受体细胞处于易于接受外源 DNA 的状态 原理:（1）遗传物质的传递 （2）受体菌的选择与改造,重组质粒的酶切鉴定,重组子的鉴定,插入片段长度大小鉴定 质粒抽提、酶切；PCR 插入片段方向性鉴定 可以选择基因内部切点进行不对称酶切 DNA序列测定,荧光质粒转染观察,
