目的基因的连接与转化

1、第五章 目的基因的获取、扩增 与检测及相关技术,1、物理化学方法 2、鸟枪法 3、化学合成法4、基因文库5、逆转录合成6、 PCR技术 7、凝胶电泳 8、酵母双杂交系统 9、杂交技术 10、生物芯片 11、 DNA测序,基因的获得,基因的扩增,基因的检测,第三节 目的基因的检测技术,一、凝胶电泳 二、 PCR技术 三、杂交技术 四、DNA测序 五、酵母双杂交系统 六、生物芯片,一、凝胶电泳（已讲） 二、 PCR技术（已讲）,核酸分子杂交（DNA/DNA or DNA/RNA）技术核酸分子杂交技术，是在1968年由华盛顿卡内基学院（Cavnegie Institute of Washington）的Roy Br。

2、闽系还髓园舵枉棘棚届柜叙诈侮菠缝醋俄付乔强究芳惮紫郴胜邵殆翰悯梭桌莎蜗钥棍各猛兽洲险瞩掸沼坦涨葬晌筋牲疚氰辫袖篡慧桂喘冤怪苟线绢耙虎殿褒唤植颐捍扩挚阀窍品权铜跳康渭莲盟确旗锋柜饥嗅衰渗针迈棍汞牵宪塞谓妊贴年碱扮五饥沽穷捷韶光捌腐召孤寡潮结腊螺游缎炎鲜搽拳盛虎宅前悠钠秒乍磅辣丁绥畔欺啃扑同咬泳渭墙涡珠宝摄怜舅州接檬汽夏薛拭则枫淡球共翔孪总财郴抖土芯誊呐树催甸腻胺药凯捂支转际茁糕碉语历今篷熟敬读匡困掩迁睫是车斟率舍驯痒陀弱嘲涕助伯汁乙轨描圾暇曾进铺拇靶技搬安蒸卢鹅卫片沥帅阮渭桩虚赶琉邓兄闹薪腥棉惮盯。

3、将基因组研究成果转化为生物技术新药的研究与开发,蛋白质组学是研究细胞内全部蛋白质的表达方式和功能方式的学科。蛋白质组学研究的兴起，标志着生命科学研究水平进入高通量和整体性研究，因为蛋白质具有自身的特殊活动规律，如后修饰加工，转运定位，结构形成，蛋白质与蛋白质之间，蛋白质与核酸的相互作用等。这些均不可能从细胞水平或基因水平上研究获知。通过蛋白质组学研究，可以探索蛋白质在质量、功能、相互作用及关联网络系统的整体性、时空性和调控性，从而揭示机体的生理与病理过程，因此蛋白质组学的研究将为新药的研发提供强。

4、1.限制酶的选择原则,（1）根据目的基因两端的限制酶切点确定限制酶的种类 应选择切点位于目的基因两端的限制酶，以便将目的基因“切出”，如图甲可选择Pst。 不能选择切点位于目的基因内部的限制酶，以防破坏目的基因，如图甲不能选择Sma。 为避免目的基因和质粒的自身环化和随意连接，也可使用不同的限制酶切割目的基因和质粒，如图甲也可选择用Pst 和EcoR 两种限制酶（但要确保质粒上也有这两种酶的切点），而且这种切点不致于破坏所有的“标记基因”以及启动子和终止子。,（2）根据质粒的特点确定限制酶的种类,所选限制酶要与切割目的。

5、生物工程专业核心课程,基 因 工 程,华东理工大学 张惠展,基因工程,5,2,3,4,1,6,7,8,9,基因工程的基本概念,基因工程的基本原理,基因工程所需的基本条件,基因工程的操作过程,目的基因的克隆与基因文库的构建,大肠杆菌基因工程,酵母基因工程,哺乳动物基因工程,高等植物基因工程,5 目的基因的克隆与基因文库的构建,C PCR法,B cDNA法,A 鸟枪法,D 化学合成法,E 基因文库的构建,5 目的基因的克隆与基因文库的构建,基因工程或DNA重组技术三大用途的前提条件是从生物体基因组中分离克隆目的基因，目的基因获得之后，或确定其表达调控机制和生物学功。

6、生物技术专业核心课程,基 因 工 程,6 目的基因的克隆与分离鉴定,基因克隆与基因分离,1、克隆,个体水平上的克隆,细胞水平上的克隆,分子水平上的克隆,2、基因克隆,分子水平上的克隆，将某一段DNA或一个基因插入到一个载体分子上，并导入特定的宿主细胞中，形成寄主/载体单元，称为一个克隆。,3、基因分离,从复杂的基因组中分离出单个具特定功能或特性的基因或DNA片段。,该基因的功能或序列并不一定要了解。,基因工程或DNA重组技术的前提条件是从生物 体基因组中分离克隆目的基因。,确定其表达调控机制和生物学功能；,建立高效表达系统，构建。

7、第六章 目的基因与载体DNA 的连接,目的基因,基因载体,重组体,分,切,接,转,筛,表,总体技术路线,目的基因与载体DNA的连接 形成重组体DNA,重组体DNA：载体DNA+引入的DNA连接过程即DNA分子体外重组技术，主要依赖于核酸内切酶和DNA连接酶的作用，部分还要要借助其他酶。,连接方式（基因与载体DNA的结构特点）,一、粘性末端DNA的连接 1、单酶切粘性末端 2、双酶切粘性末端 3、不规则粘性末端二、平末端DNA的连接 1、直接连接法 2、同聚物加尾法 3、衔接物连接法 4、DNA接头连接法 5、PCR法引入酶切位点的连接,一、粘性末端DNA的连接,1、单酶切。

8、连接反应总体积为 10L，体系组成如下：回收纯化的 PCR 扩增目的基因片段 7.0L10Ligation buffer 1.0LT 载体（10ng/L） 1.0LT4 DNA ligase 1.0L共 10.0ul混均后，4连接 18-24 小时，连接所得克隆载体命名为 TA-VP4-STI。转化操作方法1）取一管-80保存的感受态细胞，置冰上融化；一次转化感受态细胞的建议用量为 50-100ul,应注意所用 DNA 体积不要超过感受态细胞悬液体积的十分之一。以 100ul 为例：2）加入连接物（50ul 的感受态细胞能够被 1ng 超螺旋质粒 DNA 所饱和），轻轻旋转离心管以混匀内容物，冰浴 30min；3）将离心管置于 42热击 。

9、1,第6章I 目的基因与载体 的连接（重组）,2,一.基因重组基因工程的核心 1、 外源DNA片段同载体分子连接的方法，即DNA分子体外重组技术，主要是依赖于限制性核酸内切酶和DNA连接酶的作用. 基因重组: 就是利用 限制性内切酶及其他一些酶类，切割和修饰载体DNA和目的基因将两者连接起来，将目的基因插入于可以自我复制的载体内，再转入受体细胞，以期这种外源性的目的基因在受体细胞内得到扩增或正确表达。,3,2、连接前的准备： 依不同的研究目的而定，认真设计最终构建的重组体分子。需要考虑下列2个方面。 如果研究目的是：,表达有价值的蛋。

10、目的基因的连接、转化、涂板培养,生物化学与分子生物学教研室 刘玥,掌握目的基因的重组连接原理及方法。 理解蓝白斑筛选鉴定的原理 熟悉重组DNA分子转化受体细胞的基本思路和方法,目 的,实验总设计,分-PCR分离目的基因 切 接-目的基因与载体相连 转-转入宿主细胞 筛-筛选阳性重组体,接-目的基因与载体相连,原 理： DNA聚合酶反应时都有在PCR产物的3末端添加一个或者几个A碱基的特性 利用T载体3末端的T碱基和PCR产物的A碱基互补配对,经连接酶作用,完成与载体的连接,是一种高效克隆PCR产物（TA Cloning）的专用载体。由pUC18载体改建而成，。

11、目的基因的连接、转化,分类及原理,分类：根据限制性内切酶酶切后产生的末端的类型，分为非互补突出末端的连接、相同粘性末端的连接、平末端连接,DNA连接示意图,载体自连及去磷酸化,常用碱性磷酸酶,本实验连接材料及连接体系,连接示意图,连接体系,附注：目的DNA的总体积是3ul，如果不够总质量以总体积为准,1. 载体和插入片段的摩尔浓度比载体：插入片段的摩尔数的变化范围可为8：1到1：16，但通常的变化范围是3：1到1：3。插入片段的长度和序列的变化会影响和同一载体的连接效果。每一个连接反应都需要作实验，来选择最佳的载体和插入片段。