1、1,第6章I 目的基因与载体 的连接（重组）,2,一.基因重组基因工程的核心 1、 外源DNA片段同载体分子连接的方法，即DNA分子体外重组技术，主要是依赖于限制性核酸内切酶和DNA连接酶的作用. 基因重组: 就是利用 限制性内切酶及其他一些酶类，切割和修饰载体DNA和目的基因将两者连接起来，将目的基因插入于可以自我复制的载体内，再转入受体细胞，以期这种外源性的目的基因在受体细胞内得到扩增或正确表达。,3,2、连接前的准备： 依不同的研究目的而定，认真设计最终构建的重组体分子。需要考虑下列2个方面。 如果研究目的是：,表达有价值的蛋白质，要考虑选用适当的启动子、增强子等调节序列和终止序列，要将
2、目的基因置于启动子的转录起始点的下游，并审视“阅读框”是否正确，这些对表达融合蛋白至关重要。 (2) 对某一基因的上游序列进行调控机能分析， 则需考虑选择适当的报告基因，并将可能,4,具有调控机能的目的基因置于报告基因的上游适当位置。若调控基因可能有增强子（其特点一是位置变化大、二是其作用无明显方向性）作用，还应在报告基因下游适当部位设计一个插入位点，以插入一个功能基因，由此反映增强子的作用。,5,插入功能基因 的位点 转录 起始 点 启动子 操纵子 表达 调控 报告基因 目的 机能 基因 基因 5 3,6,二、连接前的处理 为了将目的基因重组于载体分子之中，需要将载体DNA和目的基因分别进行
3、适当处理，使其可以互相连接，形成新的重组分子。 1.对载体的要求： 一般采用限制性内切酶法将载体DNA分子切割成可与外源基因连接的线性分子.载体DNA通常有着许多酶切位点但是并不是所有的酶切位点都可用于重组切割，理想的酶切位点应该符合下列几个条件: 1） 位于载体上特定的酶切位点要尽可能少,最好是单一酶切位点,这样才能保证目的基因和载体DNA以最高的几率正确组合.,7,2)在酶切位点之前要有一个较强的启动子，使插入的目的基因可在该启动子的指导下高效表达。比如：高效表达质粒 pMH62l的Bgl2位点前有一个OMP多肽基因启动子 OMPF，外源基因插入后可以表达出外源基因与OMP多肽融合的蛋白。
4、其突出优点是因OMP多肽是细菌外膜蛋白(outer membrane protein, OMP)的主要成分，从而可使外源基因能在细菌外膜上表达, 十分有利于目的基因产物的收获和提取.,8,2、连接前的处理：末端的转换 当载体和外源DNA用同样的限制性内切酶，或是用能够产生相同的粘性末端的同裂酶等切割时，所形成的DNA末端就能够彼此退火（相匹配、相配伍），可以被T4连接酶共价地连接起来，形成重组体分子。 但是,当靶片段的末端与载体不匹配时，必须转换其中一个或两个片段的末端形式以便使之连接。这种末端的转换通常用以下三种方式转换：,屈艾制作,9, 3凹端补平：使用大肠杆菌DNA聚合酶I Klenow
5、片段部分补平3凹端，将不匹配的3凹端转换为粘端；或者完全补平，产生平端DNA分子，可与任何其他平端DNA相连接。 5 3 3 5,屈艾制作,10, 3突端切除：T4噬菌体DNA聚合酶具有强烈的3-5外切核酸酶活性，可将3突端切除。 平端加上人工合成接头：合成接头是自相互补的两个化学合成的寡核苷酸的等摩尔混合物，而两个寡聚体可形成带一个或多个限制性酶切位点的平端双链体。因此在平端DNA加接头可为其亚克隆操作增加一个或多个限制性酶切位点。,三基因与载体的连接(5种方法),载体DNA和目的基因DNA的连接,按DNA片段末端性质不同，可有下述不同的连接方法： 粘性末端连接法 平端连接法 同聚物加尾连接
6、法 人工接头连接法 加衔接物连接法,徐师大屈艾老师制作,屈艾制作,12,（一）粘性末端DNA片段的连接 1. 同一限制酶切位点连接: 由同一限制性核酸内切酶切割的不同DNA片段具有完全相同的末端。只要酶切割产生单链突出的粘性末端酶切位点附近的DNA序列不影响连接 .在连接酶的作用下即可形成重组DNA分子.,1) 上述方法的缺点：由限制酶产生的具有粘性末端的载体DNA分子，在连接反应中常发生自我环化作用，并在连接酶的作用下重新变成稳定的共价闭合环状结构。,解决方法：用细菌的碱性磷酸酶预先处理线性的载体DNA分子，去除其5末端的磷酸基。,徐师大屈艾老师制作,屈艾制作,13,2.不同限制酶切位点连接
7、: 由两种不同的限制性核酸内切酶切割的DNA片段、具有相同类型的粘性末端，彼此称为配伍(互补)末端也可以采用粘性末端连接. 如，同尾酶切割可以产生完全配伍的粘性末端，便于两个DNA片段的连接.用同属于GATC族的Mbo1(vGATC)和BamHI(GvGATCC)；TCGA族的Xho1(CvTCGAG)和Sal1(GvTCGAC)等等，共七族、30多个限制性核酸内酶，切割DNA后，均可与相应的配伍末端相互连接。,徐师大屈艾老师制作,屈艾制作,15,（二）平端连接,一些内切酶如Hae和Hpa切割产生DNA的片段没有粘性末端，而是平末端。具有平末端的酶切载体只能与平末端的目的基因连接。T4DNA连
8、接酶可催化相同或不相同的限制性内切酶切割的平端间的连接。平端连接比粘性末端连接要困难的多，其连接效率很低，约有粘性末端连接的1%。,徐师大屈艾老师制作,屈艾制作,16,故在平端DNA片段连接工作中，常增加DNA的浓度，同时用数倍于粘性末端连接的连接酶处理，以期获得比较满意的连接结果。有时载体DNA片段是平末端，而目的基因却是粘性末端，那就需要处理，使载体DNA和目的基因的末端一致，通常是将目的基因的粘性末端修饰成平末端，即添补法和消除法。,（三）同聚物加尾法,末端脱氧核苷酸转移酶的作用底物可以是具3-OH末端的单链片段，也可以是具3-OH突出末端的双链片段。此酶在不需要模板链的情况下，就能将脱
9、氧核苷酸加到单链的3-OH基团上，并按53方向聚合。当反应物中只存在一种脱氧核苷酸的时候，便能构成由同一种类型核苷酸组成的尾巴，如poly（dA）等，因此任何两条DNA分子,屈艾制作,18,只要分别获得poly(dA)和poly(dT)尾巴，就会彼此连接起来。这种连接DNA分子的方法叫同聚物加尾法。在特殊反应液(Co2+代替Mg2+)中，平末端DNA也可以作底物, 而且4种dNTP中任何一种都可以作反应的前体，即给平末端DNA 3-OH的末端，加上4种同聚物“尾巴”。末端转移酶还可用于DNA片段末端的标记。,19,总结： 同聚物加尾法就是利用末端转移酶的可催化dNTP加到单链或双链DNA的-O
10、H的能力，在目的DNA和质粒载体上加入互补同聚物，两者再通过互补同聚物间的氢键，形成重组子。,徐师大屈艾老师制作,屈艾制作,20,21,优点：通过DNA加尾，既可以使两个具平末端的DNA片段进行连接，也可以使具平末端的DNA片段与粘性末端的DNA片段进行连接。缺点：只对质粒载体有效；质粒和cDNA上的同聚物长度难以控制相等，影响克隆效率；用其转化宿主菌的效率依不同菌株而有较大差异。,22,（四）人工接头连接法,人工接头（DNA寡核苷酸连杆）是化学合成的核苷酸寡聚体，可带有一个或几个限制性酶切位点的平末端双链寡核苷酸短片段（一般由8-12个核苷酸组成）。如图所示。,徐师大屈艾老师制作,屈艾制作,
11、23,徐师大屈艾老师制作,屈艾制作,24,首先将人工合成的连杆与待连接的1种或2种DNA片段连接起来；再用适当的限制酶切割具人工合成的连杆的目的DNA分子和克隆载体分子，使二者都产生出彼此互补的粘性末端，这样便可以按照常规的粘性末端连接法，将目的DNA片段同载体连接成为重组分子。,徐师大屈艾老师制作,屈艾制作,26,徐师大屈艾老师制作,屈艾制作,27,人工接头连接法的优缺点,优点：此法是进行DNA重组的一种既有效又实用的手段，兼具有同聚物加尾法和粘性末端连接法的优点，而且它可以根据实验的不同要求，设计出具有不同限制酶位点的人工接头。若在体外连接反应中增加人工接头的浓度，还会大大提高平末端DNA
12、片段间的连接效率。缺点：如果待克隆的DNA片段或基因的内部，也含有与所加的人工接头相同的限制酶切位点，这样在酶切消化人工接头产生粘性末端的同时，也会把克隆的外源基因切成不同的片段，从而为后继的操作造成麻烦。,（五）加DNA衔接物连接法,DNA衔接物也是人工合成的一小段双链寡核苷酸，与人工接头不同的是一头为平整末端（与双链目的DNA平端连接），另一头带有某种限制酶的粘性末端（与载体的相应粘端连接）。它在与双链目的DNA连接后无需限制酶消化，便可与去磷酸化载体DNA进行连接反应，如图所示。,徐师大屈艾老师制作,屈艾制作,29,徐师大屈艾老师制作,屈艾制作,30,第五章 复习题,一、填空题1、若表达
13、有价值的蛋白质，应考虑选用适当的启动子、增强子等调节序列和终止序列，要将目的基因置于启动子的转录起始点 的 位置，并审视“阅读框”是否正确。2、若对某一基因的上游序列进行调控机能分析， 则需考虑选择适当的报告基因，并将可,徐师大屈艾老师制作,屈艾制作,31,能具有调控机能的目的基因置于报告基因的 适当位置。3、若某一目的基因可能有增强子作用，则应在报告基因 的适当部位设计一个插入位点，以插入一个功能基因，并由此来反映增强子的作用。,徐师大屈艾老师制作,屈艾制作,32,二、简答题,1、在人工重组时，当目的基因DNA末端与载体末端不匹配时，必须转换其中一个或两个片段的末端形式以便使之连接。请说出末端转换的主要方法和转换使用的主要工具酶是什么？2、简要说明目的基因与载体DNA分子的5种连接方法。,徐师大屈艾老师制作,屈艾制作,33,thank you!,
