1、SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳（SDS-PAGE） 测定蛋白质分子量,实验目的,学习PAGE分离蛋白质的原理 学习SDS-PAGE测定蛋白质分子量的原理。 掌握垂直板电泳的操作方法。 运用SDS-PAGE测定蛋白质分子量及染色鉴定。,一. PAGE分离蛋白质的原理,PAGE根据其有无浓缩效应，分为连续系统和不连续系统两大类，连续系统电泳体系中缓冲液pH值及凝胶浓度相同，带电颗粒在电场作用下，主要靠电荷和分子筛效应。不连续系统中由于缓冲液离子成分，pH，凝胶浓度及电位梯度的不连续性，带电颗粒在电场中泳动不仅有电荷效应，分子筛效应，还具有浓缩效应，因而其分离条带清晰度及分辨率均较前者佳。,聚丙烯酰胺凝
2、胶电泳-PAGE (Polyacryamide gel electrophoresis),以聚丙烯酰胺凝胶为支持物的电泳方法。 由于其分辨率高，不仅能分离含有各种大分子混合物，而且可以研究生物大分子的特性；如电荷、分子量、等电点及分子构型。,聚丙烯酰胺凝胶的合成,催化剂 聚合反应,聚丙烯酰胺凝胶的三维网状结构,稀溶液,浓溶液 交联剂,凝胶 结点,T= X100%,a+b,m,C= x100,b,a+b,C=6.5-0.3T,配制凝胶浓度计算及经验公式,凝胶浓度的计算,聚合后的聚丙烯酰胺凝胶的强度、弹性、透明度、粘度和孔径大小均取决于两个重要参数T和C，T是丙烯酰胺和甲叉双丙烯酰胺两个单体的总百
3、分浓度。C是与T有关的交联百分浓度。T与C的计算公式是：上式中a为丙烯酰胺的克数，b为甲叉双丙烯酰胺的克数，m为水或缓冲液体积（ml）。式中a与b的比例很重要。富有弹性，且完全透明的凝胶，a与b的重量比应在30左右。,）,聚丙烯酰胺的聚合及影响因素, 化学聚合：以过硫酸铵（AP）为催化剂，以四甲级乙二胺（TEMED）为加速剂，使丙稀酰胺、甲基双丙稀酰胺发生连锁反应形成网状的聚合物。丙稀酰胺由过硫酸铵（AP）在碱性条件下产生游离氧自由基引发单体丙稀酰胺成为自由基状态而成的。在碱性 PH 时，反应速率迅速；而在酸性条件时，同样浓度溶液，聚合速率减慢。在低温时聚合，凝胶会变得脆而浑浊，且重复性差，在
4、 25 聚合的凝胶则较透明和有弹性。 分子氧的存在会阻碍凝胶的化学聚合，O2使过硫酸铵（AP）分解。故在做胶后常要用水进行封闭； 金属离子也干扰凝胶的化学聚合。,光聚合：以核黄素为催化剂在少量的氧存在下,分解成无色的还原型，在少量的O2条件下，还原型的核黄素氧化成有游离基的黄素环，聚合反应发生。 用量少，不会对样品有任何不良的干扰现象；故常用于样品胶的聚合； 聚合的时间可以自由控制 缺点：光照的量不容易掌握，重现性不太好； 光聚合适合大孔径凝胶的聚合，化学聚合适合各种凝胶的聚合。,核黄素B1 还原型 游离基 聚合反应,光照,O2,聚丙烯酰胺凝胶的孔径和分子筛效应,凝胶是具有高粘度、高摩擦阻力的
5、支持介质，能起到防止对流，把扩散减到最小，而且能影响大分子颗粒的移动过程。大分子在凝胶中的分离是受其所带的电荷、尺寸、和形状因素的影响凝胶的这种用于分离不同尺寸分子的特性是由于它的尺寸筛分能力（Size sieving capacity），故将此现象称为分子筛效应（Molecular sieving effect）.有效孔径取决于凝胶的总浓度 T，孔径随着 T% 的增加而减小。甲基双丙稀酰胺的浓度为5%时，有效孔径最小；T= 5%时，甲基双丙稀酰胺的浓度为5%时，孔径为20nm。T是凝胶溶质的总百分浓度，C是与总浓度相关的交联百分浓度。故T是决定C，分离物的分子量的大小又决定了T的浓度。,5
6、7 9 11 13 15 T%,A B,凝胶浓度T对样品迁移率的影响,例：混合蛋白质A,B，A分子量较小，B分子带电荷较多，T5时，电泳行为主要以电荷起作用，B 迁移速度快。当 T 增加，分子筛效应增加，B的迁移速度减慢；T 9 时，A，B的迁移率相同，不能分开，T 再增加，凝胶孔径更小，A分子比B分子小，表现较高的迁移率。并且说明电泳只获得单一的带时，并不能证明是单一的均一成分。,迁移率,不连续凝胶电泳（disc）的分离原理,(一).原理 不连续凝胶电泳系统具有与一般电泳的 电荷效应分离外，还具有浓缩效应与分子筛效应，因而，能提高电泳的分辨率；使电荷性质与密度相近的但分子量有差别的分子得以分
7、离；或分子量相近、性质一样、电荷性质与密度有差别的分子可以分离；或电荷性质、分子量大小相近，但构型不同时亦可分离。碱性不连续分离酸性样品 不连续凝胶电泳洗脱酸性不连续分离碱性样品大多数蛋白质分子呈酸性或中性，适合用碱性系统进行电泳分离。,.浓缩效应,1.凝胶的组成：浓缩胶为大孔径（稀） T5，分离胶一般为小孔径（浓）T7.5。样品在较稀的凝胶上自由迁移，直至浓凝胶时，便形成一道栅栏，所有的样品分子在浓缩胶的界面堆积成一窄带，得到浓缩，然后，再依据分子量的大小进行电泳分离。2.缓冲液的组成:图示。PH系统的不连续，各种分子的电荷之间的差异进行分离。3.缓冲体系的不连续，其中各组成的离子、快慢离子
8、迁移快慢的差别是影响样品浓缩效应的重要因素。4.离子的迁移速率及浓度的不连续又造成电场强度与电导率的变化。,分子筛效应,移动界面到达浓缩胶和分离胶界面时，凝胶的PH变化明显，缓冲液中甘氨酸的觧离迅速增加，直至完全觧离出 gly-,其分子量小，迁移超过蛋白质分子。而丧失夹击的作用；同时，凝胶的孔径变小，降低了蛋白质的迁移率。故蛋白质分子在均一的电压梯度和PH 值中泳动，依其分子量的大小而分开。,电荷效应,蛋白质所带的净电的性质和电荷量与分子的迁移率的关系，在同一电场强度中，在单位时间内各分子迁移的距离的差别而到达分离。,操作,垂直柱状，板状的不连续凝胶电泳系统的组成和配制； 均一凝胶与梯度凝胶配
9、制； 电极缓冲液系统； 样品的准备； 加样要求 电泳 检测,PH8.3 PH6.7 PH8.9 PH8.3,垂直柱状，板状的不连续凝胶电泳系统的组成和配制,缓冲液系统,浓缩凝胶缓冲液 0.5mol/L Tris-HCl,PH6.8 分离凝胶缓冲液 1.5mol/L Tris-HCl,PH8.8 电极缓冲液系统0.025mol/L Tris（三羟甲基氨基甲烷） 0.2mol/Gly (甘氨酸) PH8.3 样品缓冲液0.1mol/L Tris-HCl,PH 6.8, 40%甘油、0.05mg/ml溴酚蓝 样品缓冲液的要求：选择合适的PH与离子强度，以保证样品的溶解性、稳定性、生物活性。并加入便于
10、观察电泳前沿的指示剂。,标准蛋白质样品,标准蛋白质样品：是一组（57种）已知的合适的分子量范围的、构形相近的一套蛋白质，溶解在样品缓冲液中备用。 样品的浓度 分析目的、检测方法和样品的组成是关键； 未知样品浓度：0.120mg/ml 考玛斯亮篮染色：12mg/ml 银 染 色 :0.020.2mg/ml高纯度样品： 0.52mg/ml加样电泳光吸收 检测 考玛斯亮篮染色染色银 染 色,二、 SDS聚丙烯酰胺凝胶电泳（SDS-PAGE）测定蛋白质的分子量,SDS-PAGE，主要用于测定蛋白质亚基的分子量。与其它方法相比，它不需要昂贵的仪器设备，操作简便，能在较短的时间内得到结果，有较高的重复性。
11、且不需要非常纯的样品，因此是目前用于测定蛋白质亚基的分子量的一种最好的方法。,实验原理,SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳，是在聚丙烯酰胺凝胶系统中引进SDS（十二烷基硫酸钠）， SDS能断裂分子内和分子间氢键，破坏蛋白质的二级和三级结构，强还原剂能使半胱氨酸之间的二硫键断裂，蛋白质在一定浓度的含有强还原剂的SDS溶液中，与SDS分子按比例结合，形成带负电荷的SDS-蛋白质复合物，这种复合物由于结合大量的SDS，使蛋白质丧失了原有的电荷状态形成仅保持原有分子大小为特征的负离子团块，从而降低或消除了各种蛋白质分子之间天然的电荷差异，由于SDS与蛋白质的结合是按重量成比例的，因此在进行电泳时，蛋白质分子的
12、迁移速度取决于分子大小。当分子量在15KD到200KD之间时，蛋白质的迁移率和分子量的对数呈线性关系，符合下式：logMW=K-bX，式中：MW为分子量，X为迁移率，k、b均为常数，若将已知分子量的标准蛋白质的迁移率对分子量对数作图，可获得一条标准曲线，未知蛋白质在相同条件下进行电泳，根据它的电泳迁移率即可在标准曲线上求得分子量。,实验原理,SDS电泳的成功关键之一是电泳过程中，特别是样品制备过程中蛋白质与SDS的结合程度。影响它们结合的因素主要有三个： 溶液中SDS单体的浓度，当单体浓度大于1mmol/L时大多数蛋白质与SDS结合的重量比为1:1.4，如果单休浓度降到0.5 mmol/L以下
13、时，两者的结合比仅为1: 0.4这样就不能消除蛋白质原有的电荷差别，为保证蛋白质与SDS的充分结合，它们的重量比应该为1:4或1:3 样品缓冲液的离子强度。SDS电泳的样品缓冲液离子强度较低，通常是10100mmol/L 二硫键是否完全被还原,实验原理,采用SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳法测蛋白质分子量时，只有完全打开二硫键， 蛋白质分子才能被解聚，SDS才能定量地结合到亚基上而给出相对迁移率和分子量对数的线性关系。因此在用SDS处理样品同时往往用巯基乙醇处理，巯基乙醇是一种强还原剂，它使被还原的二硫键不易再氧化，从而使很多不溶性蛋白质溶解而与SDS定量结合。 有许多蛋白质是由亚基（如血红蛋白）或
14、两条以上肽链（如胰凝乳蛋白酶）组成的，它们在SDS和巯基乙醇作用下，解离成亚基或单条肽链，因此这一类蛋白质，测定时只是它们的亚基或单条肽链的MW。 已发现有些蛋白质不能用SDS-PAGE测定分子量。如电荷异常或构象异常的蛋白质，带有较大辅基的蛋白质（某些糖蛋白）以及一些结构蛋白，如胶原蛋白等。 一般至少采用两种方法测定未知样品的分子量，互相验证。,实验试剂和器材,1.材料： 低分子量标准蛋白试剂盒: 低分子量标准蛋白： 兔磷酸化酶B MW=97,400 牛血清白蛋白 MW=66,200 兔肌动蛋白 MW=43,000 牛碳酸酐酶 MW=31,000 胰蛋白酶抑制剂 MW=20,100 鸡蛋清溶
15、菌酶 MW=14,400 根据说明书处理标准蛋白 样品：称3mg样品，加2 ml蒸馏水溶解。,2.实验试剂,(1) 30%丙烯酰胺（Acr）：称Acr30g，甲叉双丙烯酰胺 （Bis）0.8g，加蒸馏水至100ml，过滤后置棕色瓶中， 4贮存可用1-2月。 （2）10%SDS（十二烷基硫酸钠） （3）1.5mol/L pH8.8 Tris-HCl分离胶缓冲液：称取 Tris18.2g加入50ml水，用1mol/L盐酸调pH8.9， 最 后用蒸馏水定容至100ml。 （4）1.0mol/LpH6.8Tris-HCl浓缩胶缓冲液：称取 Tris12.1g，加入50ml水，用1mol/L盐酸调pH6
16、.8， 最后用蒸馏水定容至100ml。 （5）0.05mol/LpH6.8Tris-HCl样品溶解缓冲液：称取 Tris0.6g，加入50ml水，用1mol/L盐酸调pH6.8，最 后用蒸馏水容至100ml。,（7）10%过硫酸铵(AP) （8）TEMED（四甲基乙二胺） （9）样品溶解液：SDS（100mg）+巯基乙醇（0.1ml）+ 溴酚蓝（2mg）+甘油（2g） +0.05mol/L pH8.3Tris- HCl（2ml），最后定容至10ml。 （10）固定液：取50%甲醇454ml，冰乙酸46ml混匀。 （11）染色液：称取考马斯亮蓝R250 0.125g，加上述固定液 250ml，
17、过滤后备用。 （12）脱色液：冰乙酸75ml，甲醇50ml，加蒸馏水定容至1000ml。 （13）电极缓冲液（内含0.1%SDS，0.05mol/LTris- 0.384mol/L甘氨酸缓冲液pH8.3）：称Tris6.0g，甘 氨酸28.8g，加入SDS1g，加蒸馏水使其溶解后定容至1000ml。,2.实验试剂,3. 实验器材,垂直板电泳装置 直流稳压电源 移液管,滤纸 微量注射器 大培养皿,各部分凝胶配制参看实验指导 P57,操作步骤,1.将玻璃板用蒸馏水洗净晾干, 准备2个干净的锥形瓶. 2.把玻璃板在灌胶支架上固定好. 固定玻璃板时，两边用力一定要均匀，防止夹 坏玻璃板. 3.按比例配
18、好分离胶,用移液管快速加入,大约 5cm左右,之后加少许蒸馏水,静置40分钟. 凝胶配制过程要迅速, 催化剂TEMED要在注胶前再加入,否则凝结无法注胶.注胶过程最好一次性完成,避免产生气泡.,操作步骤,水封的目的是为了使分离胶上延平直，并隔绝空气 凝胶聚合好的标志是胶与水层之间形成清晰的界面. 4.倒出水并用滤纸把剩余的水分吸干,按比例配好浓缩胶,连续平稳加入浓缩胶至离边缘5mm处,迅速插入样梳,静置40分钟. 样梳需一次平稳插入,梳口处不得有气泡,梳底需水平.,操作步骤,5. 在上槽内加入缓冲液后,拔出样梳。 要使锯齿孔内的气泡全部排出,否则会影响加样效果. 6、加样（1）取10l标准蛋白
19、溶解液于EP管内，再加入10l 2倍样品缓冲液，上样量为10l。 （2）取10l样品溶液，再加入10l 2倍样品缓冲液，上样量分别为5l和3l。 7.用微量注射器距槽底三分之一处进样,加样前,样品在 沸水中加热3分钟，去掉亚稳态聚合。 注射器不可过低,以防刺破胶体,也不可过高,在样品下 沉时会发生扩散. 为避免边缘效应,最好选用中部的孔上样.,操作步骤,8.电泳槽中加入缓冲液，接通电源，进行电泳，开始电流恒定在10mA，当进入分离胶后改为20mA，溴酚蓝距凝胶边缘约5mm时，停止电泳。 9.凝胶板剥离与染色：电泳结束后，撬开玻璃板，将凝胶板做好标记后放在大培养皿内，加入染色液，染色1小时左右。
20、 10.脱色：染色后的凝胶板用蒸馏水漂洗数次，再用脱色液脱色，直到蛋白质区带清晰。 剥胶时要小心,保持胶完好无损,染色要充分. . 11.实验结果分析。,分析计算,绘制标准曲线：按下式计算相对迁移率：以每个蛋白标准的分子量对数对它的相对迁移率作图得标准曲线，量出未知蛋白的迁移率即可测出其分于量，这样的标难曲线只对同一块凝胶上的样品的分子量测定才具有可靠性。,思考题,为什么PAGE具有较高的分辨率？-回答三个效应及如何形成？ 在不连续体系SDS-PAGE中,当分离胶加完后,需在其上加一层水,为什么? 样品溶解液中各种试剂的作用是什么? 在不连续体系SDS-PAGE中,分离胶与浓缩胶中均含有TEMED和AP,试述其作用?,注意事项,丙烯酰胺具有中等毒性。常人每天允许的最大暴露量不超过0.5g/kg，皮肤接触可致中毒，症状为红斑、脱皮、眩晕、动作机能失调、四肢无力等。 丙烯酰胺是神经毒剂，可以透过皮肤 不要接触皮肤，戴手套、口罩操作,注意事项,没有聚合的丙烯酰胺不要倾倒到水源附近 一定要催化充分，使之完全聚合 集中处理，实验中全部的胶由专门受过训练的人收集到一起，在一个特殊标明的容器中保存，并进一步催化使之反应完全，最后送交学校危险品仓库，统一处理。,注意事项,聚丙烯酰胺通常认为无毒，但是也要小心操作，因为其中可能留下少量没有聚合的单体。 保护实验仪器，不得损坏。,
