1、SDS PAGE测定酶 目录 一 实训目的二 实训原理三 实训材料四 实训步骤 一 实训目的 掌握SDS PAGE电泳技术的原理 凝胶配制等知识能够熟练进行加样能够正确使用电泳仪 二 实训原理 1 SDS PAGE分离样品的主要依据是各种物质分子量的差异性 当SDS与各种酶分子结合后 酶分子即带有大量的负电荷 并远远超过了其原来的电荷 因此在电泳时 电泳迁移仅取决于分子量大小而与其所带的电荷无关 三 实训材料 1 试剂30 丙烯酰胺溶液 Acrylamide Bis 配置100mL 29克丙烯酰胺 1克甲叉双丙烯酰胺 置于250mL烧杯中 向烧杯中加入约80mL的去离子水 充分搅拌溶解 最后定
2、溶100mL 置于棕色瓶4 保存 0 5moL L浓缩胶缓冲液配置100mL 6 0克Tris 置于100mL烧杯中 加80mL去离子水搅拌溶解 用HCl调节pH值到6 8 加水混匀定容至100mL 1 5moL L分离胶缓冲液配置100mL 18 2克Tris 置于100mL烧杯中 加80mL去离子水搅拌溶解 用HCl调节pH值到8 8 加水混匀定容至100mL 5xTris 甘氨酸电极缓冲液组分浓度0 125moL LTris 1 25moL LGlycine 0 5 m v SDS 配置1L 15 1克Tris 94克甘氨酸 5克SDS 加水混匀定容至1L 室温保存10 m v 过硫酸铵
3、配置10mL 1克过硫酸铵溶于l0ml蒸馏水中 临用前配制 10 m v SDS配置10mL 配置方法同过硫酸铵2x样品处理液组分100mmol LTris HCl Ph6 8 4 m v SDS 0 2 m v 溴酚兰 20 体积倍数 甘油 2 m v 巯基乙醇 配置量5mL 取1mol LTris HCl Ph6 8 0 5mL SDS0 2g 溴酚蓝10mg 甘油1mL 加水溶解定溶至5mL 小份分装 0 5mL一管 室温保存 使用前将25 L的 巯基乙醇加入混匀考马斯亮蓝染色液配置量1000mL 称取0 125 考马斯亮兰R 2501 25g 250mL甲醇或乙醇 80mL乙酸 加蒸馏
4、水补足1000mL 充分混匀后进行过滤 收集滤液备用 脱色液7 醋酸蛋白质样品46kda的酶其他试剂15g L琼脂糖溶液 封胶用 用1xTris 甘氨酸电极缓冲液配置 2 仪器 1 电泳仪2 电泳槽及灌胶模具3 电炉4 微量移液器5 烧杯 量筒 摇床等 四 实训步骤 1 准备工作将垂直板型电泳装置的玻璃片洗干净 晾干 嵌入凹槽中 夹好 将电泳槽 凝胶模子串成一体的垂直板型电泳装置 垂直放置在水平台面上 2 分离胶的制备 按比例取试剂立即混匀 将混合液 迅速在电泳槽的两玻璃板之间灌注 留出灌注浓缩胶所需空间 梳子的齿长再加0 5 1cm 用滴管小心地在溶液上覆盖一层蒸馏水 以隔绝空气中的氧气 并
5、使胶面平整 将电泳槽垂直静置于室温约1h或更长 待分离胶聚合完全后 水封层和凝胶面之间会出现明显的水胶分界线 倾出覆盖的水 再用滤纸吸净残留水 注意勿将滤纸碰到胶面 准备灌注浓缩胶 3 浓缩胶的制备 在聚合的分离胶上直接灌注浓缩胶 立即在浓缩胶溶液中插入干净的梳子 梳底距离分离胶至少有0 5 1cm 4 样品的处理 在待测酶样品中按1 1体积比加入2倍样品处理液 在100 沸水中加热3 5min以使酶变性 另外选择相对分子量大小合适的标准蛋白质作为参照 并做同样处理 5 加样 待浓缩胶完全聚合后 小心移出梳齿 用电极缓冲液洗涤加样孔数次 然后将凝胶固定于电泳装置上 槽中加入Tris 甘氨酸电极
6、缓冲溶液 必须设法排出凝胶底部两玻璃板之间的气泡 用微量注射器向凝胶梳孔内加样 动作轻缓 准确 迅速 防止窜孔 6 电泳接上电泳仪 上电极接电源的负极 下电极接电源的正极 电泳时 调节电流至20 30mA并保持电流强度恒定 待蓝色的溴酚蓝条带迁移至距离凝胶下端约1cm时 关闭电源停止电泳 7 剥胶电泳结束后小心从电泳装置上卸下玻璃板 将胶取出 注意凝胶的完整性 8 染色和脱色经SDS 聚丙烯酰胺凝胶电泳分离的酶样品可用考马斯亮蓝R250染色 将凝胶完全浸入固定染色液中放摇床上 轻轻摇动使染色均匀 染色1 2h或过夜 至显出条带 染液收回 用水洗去凝胶表面染液 加脱色液脱色 需3 10小时 期间
7、更换多次洗色液至背景无色 9 凝胶保存可用7 醋酸或20 甘油保存 也可拍照 扫描或脱水制成干胶保存 10 相对分子质量的计算 10 相对分子质量的计算 1 电泳相对迁移率的计算用直尺分别量出标准蛋白质 待测酶区带中心以及溴酚蓝距分离胶顶端的距离 按以下公式计算相对迁移率 2 标准曲线绘制以各标准蛋白样品的相对迁移率为横坐标 其相对分子质量 Mr 的对数值为纵坐标 在坐标纸上作图 可拟合绘制一条标准曲线 3 待测酶样品相对分子质量的计算根据待测酶样品的相对迁移率 从标准曲线上查出其相对分子质量的对数值 再进一步算出酶样品的相对分子质量 分离胶 分离胶 单位kD 150以上 6 100 150 8 50 100 10 20 50 12 20以下 16 一般为这个范围 也可有些许的差异 分离胶制备 12 10ml H2O3 35ml1 5MTris PH8 8 2 5ml10 SDS0 1mlAcr Bis4 0ml10 过硫酸铵0 05mlTEMED0 005ml 浓缩胶制备 5 5ml H2O3 6ml单体溶液 30 0 62ml1MTris PH6 8 0 63ml10 SDS0 05ml10 过硫酸铵0 05mlTEMED0 005ml压缩胶一般都为5 谢谢观看
