实时荧光定量PCR原理课件

1、实时荧光定量PCR技术 RealTime QuantitativePCR,南开大学医学院 lfnn,Logo,RT-qPCR 原理,Contents,1,RT-qPCR 步骤,2,SYBR 实验步骤,3,Logo,RT-qPCR 原理,1,定义：在PCR反应体系中加入荧光基团，利用荧光信号累积实时监测整个PCR扩增反应中每一个循环扩增产物量的变化，最后通过通过Ct值和标准曲线的分析对起始模板进行定量分析的方法。,1.荧光原理：SYBR Green 2.定量原理：（1）介绍三个概念：扩增曲线、荧光阈值、Ct值（2）定量原理：绝对定量（标准曲线）、相对定量（2-Ct）（3）融解曲线,非特异性荧光标记：1、SYBR Green 结合于双链D。

2、,实时荧光定量PCR技术的原理及应用 (Real time Quantitative PCR),讲 座 提 纲,实时荧光定量PCR原理实时荧光定量PCR的几种方法介绍,实时荧光定量PCR原理实时荧光定量PCR的几种方法介绍实时荧光定量技术的应用,实时荧光定量PCR定义,在PCR反应体系中加入荧光基团，利用荧光信号累积实时监测整个PCR进程，最后通过标准曲线对未知模板进行定量分析的方法,实时荧光定量PCR 原理 实时原理,常 规 PCR技术：对PCR扩增反应的终点产物进行定量和定性分析无法对起始模板准确定量，无法对扩增反应实时检测,实时定量PCR技术：利用荧光信号的变化实时检。

3、实时荧光定量PCR实验结果分析,邓椋爻 技术支持 广州市昊洋贸易有限公司,定量分析 绝对定量 相对定量,定量PCR应用,定性分析 SNP分析，基因扫描 阴阳性判定 熔解曲线分析,绝对定量：How Many 优点：给出目标基因初始模板的绝对数量，数据容易处理 缺点：必须有标准品，做标准曲线 应用：病毒拷贝数；转基因的拷贝数；转基因成分百分含量检测,绝对定量与相对定量,相对定量:How Much 优点：需要/不需要标准品；使用广泛 缺点：数据理解困难 应用：差异表达分析；芯片评估,14500 copies,108,106,102,104,绝对定量,108,106,102,104,绝对定量,绝。

4、实时荧光定量PCR仪技术简介,聂尚海 博士,定量PCR仪组成概述,1、热循环仪（PCR仪） 2、检测系统 3、总结,定量PCR原理及Opticon,热循环技术之 PCR仪组成,加热 制冷 控温,热循环技术之 加热,电阻丝加热 半导体/电阻丝加热,热循环技术之 电阻丝加热,热循环技术之 电阻丝/半导体加热,优点： 升温快速 准确,热循环技术之 制冷,风扇制冷 压缩机制冷 半导体制冷,热循环技术之 风扇制泠,优势 价格低劣势 精确性和均一性差 不能主动致冷 控温不能低于室温,热循环技术之 压缩机制冷,聚乙烯醇管,压缩机,优势 制冷快 精确性尚可接受 劣势 体积大 控温易。

5、实时定量PCR技术,目录,实时定量PCR基本原理 实时定量PCR的实验设计和数据处理 实时定量PCR两种相对定量方法比较 实时定量PCR实验实例分析 实时定量PCR常见故障排查 实时定量PCR的新应用,实时定量PCR基本原理,常规vs实时,常规PCR：借助电泳对扩增反应的终产物进行半定量及定性分析 定量PCR技术：利用荧光信号的变化实时检测PCR扩增反应中每一个循环扩增产物量的变化，最终精确的对起始模板的定量分析,常规vs实时,优缺点比较,定量PCR三个基本概念,扩增曲线,指数增长期,平台期,线性增长期,背景期,阈值与C(t)值,阈值：是循环开始315个循环的荧。

6、实时荧光定量PCR仪,一、实时荧光定量PCR的原理,荧光定量 PCR通过荧光染料或荧光标记的特异性的探针，对PCR产物进行标记跟踪，实时在线监控反应过程，结合相应的软件可以对结果进行分析，计算待测样品的初始模板量。荧光定量 PCR仪荧光定量PCR仪是一种带有激发光源和荧光信号检测系统的PCR仪，通常配有电脑系统及相应的分析软件。,定量PCR技术的产生1992年由Higuchi等人第一次报告：使用EB内插染料法插至双链DNA，经改装的带有冷CCD的PCR仪检测样品的荧光强度PCR循环 = 双链DNA = 染料 = 荧光后来用与双链DNA有更强结合力的SYBR Green I取。

7、用SYBR Green I进行GMO定量,转基因生物又称遗传修饰生物（Genetically Modified Organisms，GMO），是经基因工程技术改变基因组构成的生物，包括转基因植物、转基因微生物和转基因动物。 目前为止，已有包括欧盟国家在内的40余个国家、地区要求对转基因生物及其产品进行标识管理 食物种转基因成分规定：欧盟出台转基因产品的标识制度(1990) ，规定0.9%阈值标准（2003),用SYBR Green I进行GMO定量,转基因生物包括了转基因载体的核酸序列，包括调控序列，抗性基因序列 食物中不同程度的混有转基因成分 通过内标基因（转基因与非转基因植物都。

8、1.实时荧光定量PCR技术原理及特点实时荧光定量PCR是将荧光能量传递技术(fluorescenceresonanceenergytransfer,FRET)应用于常规PCR仪中,指在PCR反应体系中加入荧光基团或荧光染料,利用荧光信号积累,从而实时监测整个PCR过程,最后通过标准曲线对未知模板浓度进行定量分析的方法 。,1.1 基本原理在实时荧光定量PCR中,对整个PCR反应扩增过程进行了实时的监测和连续地分析扩增相关的荧光信号,随着反应时间的进行,监测到的荧光信号的变化可以绘制成一条曲线。在PCR反应早期,产生荧光的水平不能与背景明显地区别,而后荧光的产生进入指数期、线性。

9、2013-11-26,实时荧光定量PCR技术 的原理及应用 （Real Time Quantitative PCR）,Contents,实时荧光定量PCR目录,实时荧光定量PCR的定义,普通,PCR,在PCR结束后对 进行定量分析,终点产物,PCR技术和荧光检测技术的结合通过荧光染料或荧光标记的特异性探针，对PCR产物进行 标记跟踪，实时在线监控反应过程，通过仪器和相应的软 件分析结果，对待测样品的初始模板进行定量或定性分析。克服了普通PCR：1、终点定量重复性不好2、EB有毒，荧光太贵等缺点,实时荧光定量PCR的定义,PCR技术和荧光检测技术的结合通过荧光染料或荧光标记的特异性探针，对。

10、1实时荧光定量 PCR 的原理及实验无论是对遗传病(如地中海贫血和血友病) 、传染病( 如肝炎和艾滋病)或肿瘤进行基因诊断，还是研究药物对基因表达水平的影响，或者监控药物和疗法的治疗效果，定量 pcr 技术都可以发挥很大作用。定量 pcr 技术的最新进展是实时荧光定量。该技术借助于荧光信号来检测 pcr 产物，一方面提高了灵敏度，另一方面还可以做到 pcr 每循环一次就收集一个数据，建立实时扩增曲线，准确地确定 ct 值，从而根据 ct 值确定起始 dna 拷贝数，做到了真正意义上的dna 定量。这是 dna 定量技术的一次飞跃。 根据最终得到的数。

11、实时荧光定量PCR技术原理与应用 聚合酶链式反应 ( PCR) 可对特定核苷酸片断进行指数级的扩增 。在扩增反应结束之后，我们可以通过凝胶电泳的方法对扩增产物进行定性的分析，也可以通过 放射性核素掺入标记后的光密度扫描来进行定量的分析 。无论定性还是定量分析，分析的都是 PCR 终产物。但是在许多情况下，我们所感兴趣的是未经 PCR 信号放大之前的起始模板量。例如我们想知道某一转基因动植物转基因的。

12、 通过荧光染料或荧光标记的特异性的探针，对PCR产物进行标记跟踪，实时在线监控反应过程，结合相应的软件对结果进行分析，计算待测样品的初始模板量。荧光定量 PCR仪 荧光定量PCR仪是一种带有激发光源和荧光信号检测系统的PCR仪，通常配有电脑系统及相应的分析软件。,实时荧光定量PCR（FQPCR), 实时在线监控对样品扩增的整个过程进行实时监控，能够实时地观察到产物的增加，直观地看到反应的对数期 降低反应的非特异性使用引物和荧光探针同时与模板特异性结合，提高了PCR反应的特异性 增加定量的精确性全程监控，精确定量 结果分析更快捷。

13、逆转录-实时荧光定量PCR（RT-）qRT-PCR,（RT-）qRT-PCR （Reverse transcription） quantitative real time PCRRT-PCR Reverse transcription-PCR Real-time PCR,样品处理,细菌样品 收集1-5*109细菌，置于液氮 研磨，加入1mL Trizon，混匀，高温（55）细胞样品 收集1-5*107细胞，加入1mL Trizol，混匀，进行RNA提取或者放置于-80冰箱动物样品 取50-100mg组织（新鲜或-70及液氮中保存的组织均可）置1.5 mL离心管中，加入1ml Trizol充分匀浆。,RNA提取及反转录,将处理好的样品置于室温，静置5 min 加入0.2mL氯仿，振荡15s，静置5 min 4离心。

14、 实时荧光定量 PCR 原理和实验陈云地作者单位：200030 美国应用生物系统公司(Applied Biosystems)无论是对遗传病(如地中海贫血和血友病)、传染病(如肝炎和艾滋病)或肿瘤进行基因诊断，还是研究药物对基因表达水平的影响，或者监控药物和疗法的治疗效果，定量 PCR 技术都可以发挥很大作用。定量 PCR 技术的最新进展是实时荧光定量。该技术借助于荧光信号来检测 PCR产物，一方面提高了灵敏度，另一方面还可以做到 PCR 每循环一次就收集一个数据，建立实时扩增曲线，准确地确定 CT 值，从而根据 CT 值确定起始 DNA 拷贝数，做到了真正意义上。

15、实时实时实时实时 荧光定量荧光定量荧光定量荧光定量 PCR技术原理技术原理技术原理技术原理王秋泉王秋泉王秋泉王秋泉Field Application ScientistTel: 800 820 8982 / 400 820 8982什么是实时荧光定量什么是实时荧光定量什么是实时荧光定量什么是实时荧光定量什么是实时荧光定量什么是实时荧光定量什么是实时荧光定量什么是实时荧光定量 PCR?一种实时监控核酸扩增的技术在 PCR反应体系中加入荧光基团 ，利用荧光信号的变化对 PCR过程进行实时监控 ，以此实现对初始模板的定量分析 。2 Life Technologies定量定量定量定量定量定量定量定量 。

16、实时荧光定量PCR原理及应用,上海吉泰生物科技有限公司,张达威,主要内容,荧光定量PCR原理荧光定量PCR方法与应用,荧光定量PCR定义,在PCR反应体系中，加入荧光集团，利用荧光信号的累积对PCR反应过程实时监控，最终对初始模板进行定量。,传统PCR定量与实时定量PCR,传统的PCR定量是一种终点法的检测： 动态范围受限检测重现性极差 实时定量PCR依靠荧光信号的扩增进行检测：灵敏度高重复性 好动态范围宽高通量,Gel-based quantification,11,500 counts / 5200 counts = 2.2 fold difference,Real-time quantification,Ct 18 and Ct 22, 2(4 Ct 。

17、实时荧光定量PCR技术 原理、应用及实践,(Real time Quantitative PCR),Real time Quantitative PCR,主要内容,Real-time qPCR的定量原理,2,Real-time qPCR的检测方法,3,Real-time qPCR的基本概念,1,Real-time qPCR的解析方法,4,PCR：基本原理,Denaturation: 94 96C,Annealing: 50 65C,Extension: 70 75C,基本要素：TemplatePrimersDNA polymerasedNTP, N=A,G,C or T,PCR：基本原理,理想的PCR反应：N=N0*2n实际的PCR反应：N=N0* (1+E)nN0：初始模板量 N：第n次循环后的产物量 n：扩增反应的循环次数E：扩增效率,S形曲线，具有平台效应,与普。

18、实时荧光定量 PCR原理与应用提纲PCR定量 PCR荧 光化学 监测 物 质实时荧 光定量 PCR应 用PCR目的及背景 多聚酶链式反应 (polymerase chain reaction)简称技术 ， 是年代中期发展起来的一种体外扩增特异片段的技术 。 此法操作简便 ， 可在短时间内在试管中获得数百万个特异的目的序列的拷贝 . 分子克隆 ， 目的基础检测 ， 遗传病的基因诊断 ， 法医学 ， 考古学等方面得到了广泛的应用 。 技术实际上是在模板 ， 引物和种脱氧核苷酸存在的条件下依赖于聚合酶的酶促合反应 ， 技术的特异性取决于引物和模板结合的特异性 。 反 应 分 三 步。

19、,实时荧光定量PCR主讲人：廖旭东,PCR定义,PCR 简称聚合酶链式反应。聚合酶链式反应，是指在体外，酶促合成特异性DNA片段的一种方法,由高温变性、低温退火和适温延伸等几步反应组成一个周期,循环进行,使目的DNA得以迅速扩增,具有特异性强、灵敏度高、操作简便、省时的特点。,DNA聚合酶以单链DNA为模板，通过一个或两个人工合成的寡核苷酸引物与单链DNA模板中的一段互补序列结合，形成部分双链。,PCR反应条件,PCR反应条件为温度、时间和循环次数。 温度与时间的设置： 基于PCR原理三步骤而设置变性-退火-延伸三个温度点。在标准反应中采用三。