RT-qPCR(实时荧光定量PCR).ppt

1、实时荧光定量PCR技术 RealTime QuantitativePCR,南开大学医学院 lfnn,Logo,RT-qPCR 原理,Contents,1,RT-qPCR 步骤,2,SYBR 实验步骤,3,Logo,RT-qPCR 原理,1,定义：在PCR反应体系中加入荧光基团，利用荧光信号累积实时监测整个PCR扩增反应中每一个循环扩增产物量的变化，最后通过通过Ct值和标准曲线的分析对起始模板进行定量分析的方法。,1.荧光原理：SYBR Green 2.定量原理：（1）介绍三个概念：扩增曲线、荧光阈值、Ct值（2）定量原理：绝对定量（标准曲线）、相对定量（2-Ct）（3）融解曲线,非特异性荧光标

2、记：1、SYBR Green 结合于双链DNA小沟之间，只有和双链DNA结合后才发荧光。（在变性过程中无荧光，在复性及延伸过程中发出荧光）,RT-qPCR 原理-荧光原理,特异性荧光标记：1、TaqMan 水解型杂交探针。5端标记有报告基团R，3端标记有荧光淬灭基团 Q。探针完整，R所发射的荧光能量被Q基团吸收，无荧光。Taq酶有 53外切核酸酶活性，可水解探针R与Q分开，发出荧光。2、Molecular Beacon 分子信标。标记荧光的发夹探针，环与目标序列互补，茎由互补配对序列组成。变性过程：产生非特异性荧光；延伸过程：不产生荧光；退火过程：产生特异性荧光，检测荧光信号。3、Amplis

3、ensor 双链信号引物，进行半巢式扩增；随着PCR循环的重复进行，信号引物的双链结构被破坏，其中一条链参与到产物的合成中，荧光消失，产物量与荧光成反比。,Logo,RT-qPCR 原理-定量原理,1,扩增曲线图： 横坐标：扩增循环数（Cycle）纵坐标：荧光强度 每个循环进行一次荧光信号的收集,Ct值的定义：PCR扩增过程中，扩增产物的荧光信号达到设定的阈值时所经过的扩增循环次数。Ct值极具重现性。分析定量时多取15-35较好。,荧光信号阈值 （threshold ）：前15个循环信号作为荧光本底信号（baseline），即样本的荧光背景值和阴性对照的荧光值。荧光域值的缺省设置是315个循环

4、的荧光信号的标准偏差的10倍。,Logo,RT-qPCR 原理-定量原理,1,理想的PCR反应：X=X0*2n 非理想的PCR反应：X=X0 (1+Ex)nn： 扩增反应的循环次数X： 第n次循环后的产物量X0：初始模板量Ex：扩增效率,log X0= - log(1+Ex) *Ct+ log X Log浓度与循环数呈线性关系，根据样品扩增达到域值的循环数即Ct值就可计算出样品中所含的模板量.,1.绝对定量,Logo,RT-qPCR 原理-绝对定量,1,模板DNA量越多，荧光达到域值的循环数越少，即Ct值越小Log浓度与循环数呈线性关系，通过已知起始拷贝数的标准品可作出标准曲线，根据样品Ct值

5、，就可以计算出样品中所含的模板量,1.绝对定量,Logo,RT-qPCR 原理-绝对定量,1,R2为相关系数：R20.99时，认为两数值之间相关性好。 E为扩增效率：一般认为在90%-110%之间数据可用。,Logo,RT-qPCR 原理-相对定量,1,2.相对定量,结果表示病人的目的基因的表达是对照组目的基因表达的多少倍。,RT-qPCR 原理-融解曲线,Tm值：DNA解链一半时的温度,将温度与荧光强度的变化求导。(-dI/dT),融解曲线为单一峰，无非特异性荧光，定量准确。 溶解峰反映反应中扩增到的产物的量。,前面杂峰较多时可能原因为样品未混匀。,RT-qPCR 步骤-SYBR Green

6、法,1.准备物品：检测样本、内参、引物、荧光染料、八连管、移液枪、Realplex软件 2.将样本等稍许离心 3.加样（可将所有共同物质加入同一管中，混匀后分散入其他管中）反应体系：ddH2O 10L染料 8L引物上下游各0.5L样本 1L 4.将八连管标记后离心至无壁挂液体 5.将其置入Realplex仪中，设置程序：95 15s95 15s57 30s74 30s45循环，END后右键设置“insert-melting curve”，后绿色运行 6、反应结束后将数据导出，分析数据。,反应体系的建立及优化: SYBR Green 使用浓度:太高抑制Taq酶活性，太低，荧光信号太弱，不易检测 Primer：引物的特异性高，否则扩增有杂带，定量不准 MgCl2（多聚酶的激活剂）浓度:可以降低到1.5mM,以减少非特异性产物 反应Buffer体系的优化 反应温度和时间参数:由酶和引物决定 其他与常规PCR相同,RT-qPCR 步骤-SYBR Green法,Thank you,