1、实时荧光定量PCR原理及应用,上海吉泰生物科技有限公司,张达威,主要内容,荧光定量PCR原理荧光定量PCR方法与应用,荧光定量PCR定义,在PCR反应体系中，加入荧光集团，利用荧光信号的累积对PCR反应过程实时监控，最终对初始模板进行定量。,传统PCR定量与实时定量PCR,传统的PCR定量是一种终点法的检测： 动态范围受限检测重现性极差 实时定量PCR依靠荧光信号的扩增进行检测：灵敏度高重复性 好动态范围宽高通量,Gel-based quantification,11,500 counts / 5200 counts = 2.2 fold difference,Real-time quanti
2、fication,Ct 18 and Ct 22, 2(4 Ct shift) = 16 fold difference,重复性好 精确度高 误差小,传统PCR与实时定量PCR,阈值threshold ：在荧光信号指数扩增阶段，在扩增曲线任意位置上人为设定的一个值，一般我们将荧光阈值的缺省设置是 3-15 个循环的荧光信号的标准偏差的10 倍。 CT=cycle threshold即阈值循环数：荧光信号达到阈值设定值时PCR所经历的循环数。,阈值与CT值,C(t)值与阈值,荧光定量PCR原理,起始模板浓度的对数与C(t)值成反比,如何定量,绘制标准曲线所测样本C(t)值定量,标 准 曲 线,通
3、过已知起始拷贝数的标准品作出的标准曲线，根据样品的Ct值，依据 Log起始拷贝量与Ct的线性关系，就可以计算出样品中所含的模板量,荧光定量PCR方法,荧光染料法荧光探针法,SYBR Green I TaqMan Molecular Beacons,DNA binding,Probe based detection,染料和探针,SYBR Green: 最大吸收波长约为 497nm ，发射波长最大约为 520nm 染料只与双链DNA小沟结合，单链不结合 游离时荧光信号非常低，结合后荧光信号强度增强1000倍不能区分引物二聚体，单链二级结构，非特异性产物 需要做熔解曲线分析产物的单一性,SYBR g
4、reen 是一个很好的初级化学试剂，价格上存在优势，在试验验证和问题分析上非常有用。,SYBR Green法作用机理,熔解曲线分析,单一峰，无非特异性产物，定量准确,有杂峰，有非特异性产物，定量不准确,特点：特异性高：只有引物和探针都和同一模板结合时才能检测 完全实时监测：一分子荧光信号对应一条DNA链的产生 多通道检测：可以在一次反应中同时检测多个不同目的基因序列,Taqman探针法,Taqman探针：是与目的序列互补的 寡聚核苷酸，5端标记荧光报告集团， 3端标记荧光淬灭集团，探针完整时 不发出荧光，水解后发出荧光。,Taqman 三通道实验,Daniel Candotti - Cambr
5、idge, UK,绝对定量相对定量SNP分析,实时定量PCR应用,应用之一：病原体检测与定量,绝对定量（检测起始模板数的精确拷贝数病原体的多少） 标准品（如质粒）：做系列梯度稀释 待测样本 阴性对照（NTC）,应用之一：病原体检测与定量,1,4,3,2,应用之一：病原体检测与定量,应用之二：基因表达差异分析,相对定量：基因表达量上升或者表达被抑止的倍数 两种样品：Calibrator（对照，如正常组织） 与Sample（待测样品） 两个基因：目的基因与看家基因,应用之二：基因表达差异分析,Calibrator,Gene of Interest 目的基因, Ct1,应用之二：基因表达差异分析,基
6、因表达差异2 /2, Ct1, Ct2,2, Ct1 - Ct2,应用之二：基因表达差异分析,RNA抽提,RT,定量PCR,cDNA产物,系列稀释,两个基因的扩增效率,应用之二：基因表达差异分析,1,2,3,4,应用之二：基因表达差异分析,两条探针分别针对不同等位基因,A,C,G,T,A,C,G,T,应用之三：SNP分析,应用之三：SNP分析,FAM,TET,FAM,TET,1,2,应用之三：SNP分析,2,1,Thank you！,选择吉泰，选择成功！,试验设计与优化,PCR是精确性很高的实验，实验前我们需要完整的实验设计方案，而且实验条件对结果影响也很大。 PCR扩增效率：保证实验的精确性
7、和重复性。 影响扩增效率的因素：扩增子长度；扩增子GC含量；扩增子、引物、探针二级结构；PCR各组分反应浓度；模板浓度。,引物设计原则,扩增片段100-200bp 引物长度18-30bp，Tm在58-62之间，上下游引物Tm值不超过2 GC含量在30-80%，避免出现多个重复碱基，3端不为G或C。 避免引物内二级结构，引物间二聚体出现。 跨外显子设计引物，消除基因组DNA扩增,探针设计原则,Taqman探针长度25-32bp，Tm在68-72之间，确保比引物的Tm值大5-10 GC含量在30-80%，避免出现多个重复碱基 5端不能为G，G能淬灭荧光信号 Taqman探针要靠近上游引物，最好只有
8、一个碱基距离。 避免探针与引物间形成二级结构 SNP位点应设计在探针中间位置,实时PCR体系优化,基本参数的优化 MgCl2的浓度，DNA：2-5mM;mRNA：4-8mM。 模板浓度，系列稀释梯度模板，CP在15-30之间。而CP值的确定经验上是SYBRGreen荧光信号是本底的2倍，杂交探针荧光强度是本底的0.3倍。,使用SYBRGreen测定DNA的优化 MgCl2的浓度，2-4mM 模板浓度，DNA：50ng-5pg；质粒：106拷贝 引物浓度，0.3uM 退火浓度，比计算出的Tm小5,使用SYBRGreen进行一步法RT-PCR的条件优化 MgCl2的浓度，4-8mM 模板浓度，总R
9、NA或mRNA：1pg-1ug,杂交探针测定DNA MgCl2的浓度，不要超过2mM 探针浓度，0.2uM,杂交探针进行实施定量RT-PCR MgCl2的浓度，4-8mM之间 探针浓度，0.2uM 模板浓度设置， 1pg-1ug的总RNA或是mRNA,荧光定量PCR仪的硬件条件,激发光源,热循环加热、制冷,检测设备,荧光定量PCR仪应满足的要求,光源的光谱范围宽广，能激发不同的荧光染料 能分开不同荧光素的激发光与发射光波长 能检测的灵敏度与动态检测范围 准确的温度控制和良好的孔间温度均一性.,Stratagene 公司成立于1984年,致力于发展生命科学领域的创新产品与科技. 总部位于美国 La Jolla, California .在欧洲与日本设有分公司.2007年被Agilent公司收购，成为Agilent公司旗下品牌。,Stratagene 公司简介,Mx3000P 整体设计,仪器优势,石英卤钨灯的激发光源：超长的激发光范围350-750nm 多通道设计，滤光片可灵活定制 卓越的孔间均一性和温度控制，72时+0.25 光学扫描设计: 避免边缘效应；光电倍增管增加检测的灵敏度 内置芯片，具有断电保护功能 人性化的软件，实时监测，直观易用，功能强大,开放的平台，选择你心仪的试剂与耗材 完善的售后支持，您的满意是我们最大的目标,
