PCR引物设计软件介绍

1、常用的引物设计软件,Oligo 6 （引物评价）* Primer Premier （自动搜索）* Vector NTI Suit Dnasis Omiga Dnastar Primer3 （在线服务）*,Primer Premier 5.0 的使用技巧简介,主要功能: 1、即引物设计 2、限制性内切酶位点分析 3、DNA 基元(motif)查找 4、同源性分析,简并引物设计,根据氨基酸序列来设计引物DNA引物 Premier Primer 5提供了8种生物遗传密码使用的偏好选择 1、纤毛虫大核（Ciliate Macronuclear） 2、无脊椎动物线粒体（Invertebrate Mitochondrion） 3、支原体（Mycoplasma） 4、植物线粒体（Plant Mitochondrion） 5、原。

2、长江师范学院生命科学系,生化与分子生物学实验（二）,实验三 基因序列查找及PCR引物设计,陈发波,一、实验目的,1、掌握PCR扩增原理； 2、学会在NCBI网站上查找相关生物信息； 3、学会利用Primer5软件设计引物,二、聚合酶链式反应（PCR）,聚合酶链式反应（Polymerase Chain Reaction，PCR）:,是利用DNA片段旁侧两个短的单链引物，在体外快速扩增特异DNA片段的技术。,PCR基本原理,反应材料,模板DNA,引物对 按照与扩增区段两端序列彼此互补的原则设计；,DNA聚合酶：耐高温 Taq DNA polymerase、Pfu DNA polymerase,dNTP,缓冲液溶液 Mg2+, Tris。

3、1使用 Oligo 6 和 Primer Premier 5.0 等软件设计 PCR 引物张新宇（中国医科院肿瘤研究所，北京 100021）电子邮件: zhangxypubem.cicams.ac.cn 在当今分子生物学研究中，PCR 技术已成为使用最多，最广泛的技术之一。而引物设计是 PCR 技术中至关重要的一环。在 PCR 扩增以前，一般模板序列已被全部或部分确定。要想扩增出理想的目的片断，一般都得通过正确设计 PCR 引物。也有的人不经过设计直接取模板序列的两个片段作为引物，这样很可能导致实验失败，如扩增出多条带（引发错配所致） ，不出目的带或出目的带很弱（引物引发效率低下） 。

4、逆转录-实时荧光定量PCR（RT-）qRT-PCR,（RT-）qRT-PCR （Reverse transcription） quantitative real time PCRRT-PCR Reverse transcription-PCR Real-time PCR,样品处理,细菌样品 收集1-5*109细菌，置于液氮 研磨，加入1mL Trizon，混匀，高温（55）细胞样品 收集1-5*107细胞，加入1mL Trizol，混匀，进行RNA提取或者放置于-80冰箱动物样品 取50-100mg组织（新鲜或-70及液氮中保存的组织均可）置1.5 mL离心管中，加入1ml Trizol充分匀浆。,RNA提取及反转录,将处理好的样品置于室温，静置5 min 加入0.2mL氯仿，振荡15s，静置5 min 4离心。

5、荧光定量PCR,引物要求： （1）设计的时候尽量靠近基因的3端，这样能最大限度地保证扩增效率 （2）尽量跨越内含子，这样可以保证检测有无基因组污染 （3）两条引物的Tm值不要相差太大 （4）产物长度保证在80200bp之间，最长300 bp。 （5）避开保守区域,荧光定量PCR引物设计（SYBRGreen）,1. NCBI Primer blast,Novobio Proprietary & Confidential,NCBI 设计引物网址： http:/www.ncbi.nlm.nih.gov/tools/primer-blast/,Primer blast,Novobio Proprietary & Confidential,输入基因号或FASTA序列,定义引物的范围 （举例：针对长3k的基因，若。

6、PCR引物设计及测序结果分析,Content,聚合酶链式反应（PCR） 的技术原理及结果分析 PCR引物设计原理及相关软件的使用（ Primer Premier 5.0 ） 测序结果分析,一 . PCR的技术原理及结果分析,聚合酶链式反应(polymerase chain reaction,PCR)，是一种在体外快速扩增特定基因或DNA序列的方法，故又称为基因的体外扩增法。PCR不仅可以用于基因的分离、克隆和核苷酸序列分析，还可以用于突变体和重组体的构建，基因表达调控的研究，基因多态性的分析，遗传病和传染病的诊断，肿瘤机制的探索，法医鉴定等诸多方面。,PCR技术原理,以拟扩增的DNA分子。

7、PCR引物设计方法和原理,一、引物设计的目的,获得目标片段 DNA测序 基因克隆 体外转录 突变 探针设计 分子标记,二、引物设计的类型,引物设计的步骤,下载DNA模板或蛋白质序列 进行同源比较，找到保守同源序列 设计引物,四、PCR引物设计的原则,引物长度（primer length）: 18-27 bp GC钳(GC clamp: 引物3端出现3 个以上的连续碱基，如GGG 或CCC，也会使错误引发机率增加 3末端碱基（3End Sequence）: Tm 值(melting temperature) ：5260 GC 含量（composition） ：40-60%,四、PCR引物设计的原则,G 值是指DNA 双链形成所需的自由能(internal s。

8、锦州压学院学报 2004 Dec25(6)J Jinzhou Med College -uu。 43 利用软件Primer Premier 50进行 PCR引物设计的研究 任亮，朱宝芹，张轶博，王海燕，李尘远，苏玉虹，巴彩凤 (锦州医学院辽宁省高校分子细胞生物学与新药开发重点实验室，辽宁锦州121001) 【摘要】目的运用Primer Premier 50软件设计PCR引物，并且检验所设计引物的PCR扩增效率和特异性。方 法运用Primer Premier 50软件设计l6对猪和犬的PCR扩增引物，通过PCR扩增后进行琼脂糖凝胶电泳检测 实验结果。结果在所设计的l6对引物中有8对PCR扩增特异性好且效率高，成功率50。但是，。

9、PCR引物设计,引物设计是PCR 技术中至关重要的一环。使用不合适的PCR 引物容易导致实验失败：表现为扩增出目的带之外的多条带（如形成引物二聚体带），不出带或出带很弱，等等。现在PCR 引物设计大都通过计算机软件进行。可以直接提交模板序列到特定网页，得到设计好的引物，也可以在本地计算机上运行引物设计专业软件。,具体因素,如引物长度（primer length），产物长度（product length），序列Tm 值(melting temperature)，引物与模板形成双链的内部稳定性(internal stability, 用G 值反映)，形成引物二聚体(primer dimer)及发夹结构（d。

10、PCR引物设计及相关软件使用,主要内容,背景 PCR引物设计原则 常用PCR引物设计软件 Primer Premier 5.0 介绍 Oligo 6.22 介绍 在线Primer3 介绍,PCR,聚合酶链反应(Polymerase Chain Reaction ,PCR)是80年代中期发展起来的体外核酸扩增技术。它具有特异、敏感、产率高、快速、简便、重复性好、易自动化等突出优点；能在一个试管内将所要研究的目的基因或某一DNA片段于数小时内扩增至十万乃至百万倍,使肉眼能直接观察和判断；可从一根毛发、一滴血、甚至一个细胞中扩增出足量的DNA供分析研究和检测鉴定。,PCR引物设计,引物设计是PCR 技术中至。

11、PCR引物设计及相关软件使用 主要内容 背景 PCR引物设计原则 常用 PCR引物设计软件 Primer Premier 5.0 介绍 Oligo 6.22 介绍 在线 Primer3 介绍 PCR 聚合酶链反应 (Polymerase Chain Reaction ,PCR)是 80年代中期发展起来的体外核酸扩增技术。它具有特异、敏感、产率高、快速、简便、重复性好、易自动化等突出优点；能在一个试管内将所要研究的目的基因或某一 DNA片段于数小时内扩增至十万乃至百万倍 ,使肉眼能直接观察和判断；可从一根毛发、一滴血、甚至一个细胞中扩增出足量的 DNA供分析研究和检测鉴定。 PCR引物设计 引物设计是 PCR 。

12、PCR引物设计及相关软件使用,主要内容,PCR介绍 引物设计原理 引物设计的优化原则 Primer Premier 5.0 介绍 举例说明引物的设计,PCR介绍,1、什么是PCR2、PCR的组成3、如何提高PCR成功率（定量，对照）,引物设计原理,引物设计的目的是为了找到一对合适的核苷酸片段，使其能有效地扩增模板DNA序列。引物设计总体上包含三个程序：序列下载，同源性比较，引物设计筛选 。,引物设计的原则,1、引物长度大多数应用的最短引物长度为18个核苷酸。如果期待的产物长度等于或小于500 bp，选用短的(1618)的引物；若产物长5 kb，则用24个核苷酸的引物。有。

13、引 物 设 计,引物 引物的重要性 引物设计的原则 引物与PCR 引物设计软件 如何使用Primer Premier 5.0 引物同源性分析,引物（primers),引物是人工合成的两段寡核苷酸序列，一个引物与感兴趣区域一端的一条DNA模板链互补，另一个引物与感兴趣区域另一端的另一条DNA模板链互补。,3,3,5,5,Sense primer,Antisense primer,引物的重要性,在整个PCR体系中, 引物占有十分重要的地位。PCR的特异性要求引物与靶DNA特异结合，不与其他非目的DNA结合，PCR的灵敏性要求DNA聚合酶能对引物进行有效的延伸，可见引物设计好坏与PCR结果密切相关。,引物设计。

14、PCR引物设计原理,PCR反应一般由三个步骤组成： 模板的热变性； 引物复性到单链模板上； 热稳定DNA聚合酶催化的延伸,变性,在应用 Taq DNA 聚合酶进行 PCR 时，变性温度在94-95下进行，这也是Taq DNA聚合酶进行30个或30个以上PCR循环而活力不受到过多损失时能耐受的最高温度。 有时把变性时间设计为 5min，以便大分子模板 DNA 彻底变性的概率。 对于 GC 含量为 55% 或更低的线性 DNA 模板，推荐 PCR 的变性条件是 94-95 变性45s。,复性温度（退火温度）至关重要！ 退火温度太高，引物不能与模板很好地复性，扩增效率会非常低； 退火温度太低。

15、PCR引物设计软件primer Premier 5.0 应用简介,温州医学院附属第一医院检验科 陶志华,一. 引物设计的基本原则,引物长度（primer length） 产物长度（product length） 序列Tm值 (melting temperature) G值(internal stability) 引物二聚体及发夹结构 （duplex formation and hairpin） 。

16、生物信息学软件介绍,基因芯片相关软件序列分析软件RNA二级结构软件蛋白质二级结构软件限制酶切位点软件质粒绘图软件引物分析软件凝胶分析软件生物显微分析软件数据统计类软件文献管理软件,2,常用生物信息学软件,管理实验室数据及文献资料,查阅实验相关文献，对所研究课题的最新进展有一个基本的了解，从而确定自己的实验策略，同时，方便实验室结果的储存、管理和申报工作。常用软件：EndNote(可以在线查找Internet上的各种文献数据库，将查找到的资料保存入本地数据库，并自动生成格式化的参考文献清单插入各种文字处理软件）Reference M。

17、PCR引物设计及相关软件使用,主要内容,背景 PCR引物设计原则 常用PCR引物设计软件 Primer Premier 5.0 介绍 Oligo 6.22 介绍 在线Primer3 介绍,PCR,聚合酶链反应(Polymerase Chain Reaction ,PCR)是80年代中期发展起来的体外核酸扩增技术。它具有特异、敏感、产率高、快速、简便、重复性好、易自动化等突出优点；能在一个试管内将所要研究的目的基因或某一DNA片段于数小时内扩增至十万乃至百万倍,使肉眼能直接观察和判断；可从一根毛发、一滴血、甚至一个细胞中扩增出足量的DNA供分析研究和检测鉴定。,PCR引物设计,引物设计是PCR 技术中至。

18、,实时PCR引物、探针设计,及软件使用,厦门大学分子诊断教育部工程研究中心,引物的重要性,上游引物 聚合酶,DNA模板,dNTPs下游引物,PCR反应的效率和特异性取决于两个方,面：,引物与模板的特异结合多聚酶对引物的有效延伸,引物的设计对于PCR 反应极为重要!,特异靶序列非特异靶序列,特异杂交非特异杂交,分子信标分子信标,探针的重要性,引物、探针设计,查找基因序列序列分析引物、探针设计特异性验证,GenBankClustalXPrimer Premier 5.0TM Utility v1.3mfoldBLAST,例:根据大肠杆菌rfbE基因序列，,设计引物和探针,1.检索大肠杆菌rfbE的基因序列Na。

19、PCR引物设计软件 primer Premier 5.0 应用简介,温州医学院附属第一医院检验科 陶志华,一. 引物设计的基本原则,引物长度（primer length） 产物长度（product length） 序列Tm值 (melting temperature) G值(internal stability) 引物二聚体及发夹结构（duplex formation and hairpin） 错误引发位点（false priming site） 引物及产物GC含量（composition）,1. 引物的长度,一般为15-30bp，常用的是18-27bp，但不能大于38，因为过长会导致其延伸温度大于74，即Taq酶的最适温度,2. 引物3端的序列,引物3端的碱基一般不用A，因为A在错误引发位。