1、PCR引物设计软件 primer Premier 5.0 应用简介,温州医学院附属第一医院检验科 陶志华,一. 引物设计的基本原则,引物长度（primer length） 产物长度（product length） 序列Tm值 (melting temperature) G值(internal stability) 引物二聚体及发夹结构（duplex formation and hairpin） 错误引发位点（false priming site） 引物及产物GC含量（composition）,1. 引物的长度,一般为15-30bp，常用的是18-27bp，但不能大于38，因为过长会导致其延伸温
2、度大于74，即Taq酶的最适温度,2. 引物3端的序列,引物3端的碱基一般不用A，因为A在错误引发位点的引发效率相对比较高引物间3端的互补、二聚体或发夹结构也可能导致PCR反应失败,3. 引物的GC含量,一般为40-60%，过高或过低都不利于引发反应。上下游引物的GC含量不能相差太大。,4. 引物所对应模板序列的Tm值,最好在72左右,5. G值(自由能) ，,反映了引物与模板结合的强弱程度。一般情况下，引物的G值最好呈正弦曲线形状，即5端和中间G值较高，而3端G值相对较低,6. 引物二聚体及发夹结构的能量,一般不要超过4.5，否则容易产生引物二聚体带而且会降低引物浓度从而导致PCR正常反应不能进行,二. Primer Premier 5.0 引物设计软件简介,Primer Premier 5.0用途：,引物分析评价功能； 引物的自动搜索功能,Premier的主要功能：,
