1、科学家们是咋整的捏？,有48只46周大的小白鼠（BALB/C）要遭殃了！,动物实验,帮我照顾好我七舅老爷,将小白鼠饲养在消毒过的笼子里，为给它们的食物和水都消过毒。 在注射后的15min，1h，6h，10h和24h后取出一定量的组织（肝脏、肾脏、脾脏、脑组织等）。 将取出的组织分成两份。一份冷藏在组织培养基中以待用5-Br-4-Cl-3-吲哚- D-吡喃型半乳糖苷（X-gal）染色；另一半保存在液氮中以待-半乳糖苷酶的酶活分析和蛋白质杂交的定性鉴定。,TAT- -半乳糖苷酶融合蛋白的纯化,TAT- -半乳糖苷酶融合蛋白是将-半乳糖苷酶的基因插入到编码TAT-血球凝集素蛋白的质粒中，再转导进细菌
2、【BL21（DE3）LysS】后得到的。将转导后的细菌在Luria-Bertani培养基中培养一整夜。将500ml培养液中的菌体沉淀物加入到20ml冷藏后的磷酸盐缓冲溶液中，使之重新形成悬浊液，再转移到含有20mM的咪唑和多种蛋白酶抑制剂的10ml冷藏过的磷酸盐缓冲溶液中。用超声波降解细菌3次，每次15秒。将溶解物离心30min（4C ，15000rpm）后，将上清液和10ml nickel-nitrilotriacetic acid agarose matrix混匀后装入Econo-column。先用50ml含有20mM咪唑的磷酸盐缓冲溶液洗涤层析柱后，再用5ml含有咪唑（100mM，250
3、mM，500mM，1000mM，5M）和蛋白酶抑制剂混合物的磷酸盐缓冲溶液洗提。用凝胶染色确定流出液含有-半乳糖苷酶后，用Centricon Plus-20PL Centrifugal Filter Device 浓缩流出液，再在G25 Sephadex mediam上用PD-10使之脱盐，摇匀后，用含有蛋白酶抑制,剂混合物的磷酸盐缓冲溶液洗提一次。以标准牛血清蛋白（0.5mg/ml10mg/ml）为参照，将最终的洗提液电泳来确定最终的蛋白浓度。,注意：使用前，将TAT- -半乳糖苷酶融合蛋白在4 C 下保存，并加入牛血清蛋白，防止沉降。,X-gal着色,将取出的组织（心、肝、脾、肺、肾、肠、
4、脑）在低温恒温器内切成1215m 的小段，用戊二醛浸泡并保存15min。漂洗后用磷酸盐缓冲液浸洗3次。用一支PAP-pen（免疫组化笔）在组织周围画圈（主要是为了避免液体的流失，具体的原理不知道）。用x-gal染色后，将组织在37 C 培养16h。 用磷酸盐缓冲溶液清洗组织的切面两次。 将组织用0.1%Sirius Red F3B溶液复染。 在光学显微镜下观察组织切面。,-半乳糖苷酶活力的分析,将一块68mm3的组织用300l报告基因裂解缓冲液溶解后，离心10min（ 4C ，13000g）。上清液的蛋白浓度用Bradford分析法分析。 在96孔板上，将100 l的样品与100 l的pH7.
5、3的溶液（含有200mM磷酸钠，2mM氯化镁，100mM -巯基乙醇，1.33mg/ml -D-吡喃型半乳糖苷）混合后，在37 C 下保存一小时。 根据样品在420nm的光吸收度与纯酶的标准吸收曲线的差异，确定样品中蛋白的浓度。 背景吸收的消除：将未被实验的小鼠的组织的提取物在420nm下测定吸光度。,蛋白质杂交分析,在磷酸盐缓冲溶液中，将收集到的小鼠组织超声波降解。 组织溶出物离心30min（ 4C ，20000rpm）。 用Bio-Rad protein分析法确定上清液中的蛋白浓度。,将上清液与等体积的Laemmli样品缓冲液（0.25MTris-HCl，pH6.6，20%的-巯基乙醇，4
6、%的SDS）混合均匀。 加热到100 C ，保持3min。 将加热后的液体离心5min（15000rpm）以除去不溶性物质，将上清液转移到SDS-聚丙烯酰胺凝胶上电泳。 将蛋白质转移到硝酸纤维素膜上。 For immunostaining, the following primary antibody were used: rabbit anti-galactosidase (1/1200); The secondary antibodies ：horseradish peroxidase-conjugated goat-anti-rabbit IgG。 -半乳糖苷酶的定量测定由光密度扫描仪完
7、成。,Bio-Rad protein分析法,-半乳糖苷酶 蛋白动力学的分析,高剂量（500g ）和低剂量（100g ）的-半乳糖苷酶 融合蛋白以四种不同的方式（portal vein，i.v.，i.p.，oral）进入小鼠的体内后，在小鼠各组织的-半乳糖苷酶 的浓度出现峰值之后的线性衰减阶段，估计不同的小鼠组织内的-半乳糖苷酶 活性的半衰期。,结果他们发现了什么呢？,一般人我不告诉他.,服用TAT-半乳糖苷酶融合蛋白后， -半乳糖苷酶的分配,为了检测每只小鼠内的组织分配及其动力学机制，实验者使单剂量（100 g 或500 g ）的TAT-半乳糖苷酶融合蛋白通过四种方式（ portal vein
8、，i.v.，i.p.，oral ）进入小鼠体内。一定时间以后（15min，1h，6h，10h，24h），从小鼠的器官（肝、脾、肺、肾、肠、脑）提出组织，用来分析-半乳糖苷酶的活性。,将500 g TAT-半乳糖苷酶融合蛋白注入小鼠体内15min后，检测各组织得到的结果：,X-gal染色后的蓝色程度是与时间相关的。,500 g TAT-半乳糖苷酶融合蛋白注入小鼠体内15min后，在显微镜下得到的样品分析结果。 放大倍数为10倍。,从前一张的图，我们可以看出-半乳糖苷酶在各器官的活性：,500 g TAT-半乳糖苷酶融合蛋白注入小鼠体内1h后，在显微镜下得到的样品分析结果。 放大倍数为10倍。,从
9、前一张的图，我们可以看出-半乳糖苷酶在各器官的活性：,TAT- -半乳糖苷酶活性的定量分析,注意纵坐标分度的不同！,肝脏：portal vein注射后15min出现峰值（67mU/mg），分别是i.v.，i.p.和oral三种方法的6.8倍，15倍和233倍。1h后portal vein的值分别是其他三种的13.5倍，23.7倍和96倍。6h后portal vein的值在肝脏仍然可以检测到，是i.v.和i.p.的10.7倍和15.5倍。 肾脏： portal vein注射后15min出现峰值（10.3mU/mg），分别是i.v.，i.p.和oral三种方法的1.5倍，1.8倍和27.2倍。 肺
10、部：portal vein注射后1h出现峰值，分别是i.v.，i.p.和oral三种方法的2.6倍，2.2倍和4.9倍。 脾脏： portal vein注射后15min出现峰值（5.5mU/mg），分别是i.v.和i.p. 两种方法的1.4倍和1.3倍。 脑部：所有器官中最低的,对于portal vein和 i.p.两种途径：肝脏的-半乳糖苷酶活性比其他组织中的高得多。（at 15min，1h和6h以后） 对于i.v.途径：肝脏的-半乳糖苷酶活性高于其他组织（at 15min）。15min之后，肾脏中的-半乳糖苷酶活性高于其他组织。 对于oral途径:肠中的-半乳糖苷酶活性高于其他组织（at 1h）。,
