1、其研究工程取得重大进展的有如下几个方面：,动物细胞工程技术与植物细胞工程技术的原理基本相同,常用的技术手段,动物细胞培养,核移植,单克隆抗体,动物细胞融合,1细胞及组织培养技术2换核技术 3克隆技术,2.1-动物细胞工程,一、动物细胞培养,动物胚胎或幼龄动物的组织、器官,胰蛋白酶处理分散成单个细胞,10代细胞,原代培养,无限传代,遗传物质改变,遗传物质未改变,为什么要分散成单个细胞,1为什么选用动物胚胎或幼龄个体的器官或组织做动物细胞培养材料？,这些组织或器官上的细胞生命力旺盛，分裂能力强且代数低。,2为什么培养前要将组织细胞分散成单个细胞？,成块组织有接触抑制现象，分散了做成细胞悬浮液利于培
2、养,3动物细胞培养能否像绿色植物组织培养那样最终培养成新个体？,不能，动物细胞培养只能使细胞数目增多，不能发育成新的动物个体（现在条件下无全能性）。,细胞悬浮液,原代培养,细胞株,细胞系,单个细胞,传代培养,10代细胞,40-50代细胞,无限世代,0代细胞,细胞名称,培养代数,培养形式,过程：从动物机体中取出组织 剪碎 加胰蛋白酶 细胞游离 加培养液 将细胞接种到培养瓶内 培养（12天换一次培养液） 细胞贴壁生长 长成单层细胞,原代培养 (primary culture),原代培养,原代培养 ：,从机体内取出的第1代细胞培养到第10代以内的细胞的培养。,传代培养：,将细胞从一个培养瓶转移或移植
3、到另一个培养瓶的培养。或将原代培养细胞分成若干份，接种到若干培养基上，使其继续生长，繁殖。,细胞株,从原代培养细胞群中筛选出的，具有特定性质或标志的细胞群，能传到40-50代。遗传物质没有发生变化。,培养到40-50代后的部分发生突变或转化的细胞，能无限制的繁殖下去。遗传物质发生了变化，带有癌变的特点。或指可连续传代的细胞。,细胞株：,细胞系：,细 胞 悬浮液,10代细胞,50代细胞,无限传代,原代培养,传代培养,细胞株,细胞系,如何界定原代培养和传代培养；细胞株和细胞系？,随细胞增多，细胞就会停止分裂增殖,(遗传物质改变),(人教版),培养的细胞为什么会贴壁生长？,大多数组织细胞不适应悬浮生
4、长，他们必须在固体的表面上生长和分裂。 贴壁生长后随细胞数目的增多，会出现接触性抑制的现象。 要定期要胰蛋白酶处理使细胞从瓶壁脱离，配成悬浮液，分装多瓶再培养,动物组织细胞间隙中含有一定量的弹性纤维等蛋白质，将细胞网络起来形成具有一定弹性和韧性的组织和器官。,用胰蛋白酶处理动物胚胎或幼龄动物的组织、器官？,分解弹性纤维,细胞贴壁,细胞贴壁：细胞培养时，悬液中分散的细胞很快就贴附在瓶壁上，称为细胞贴壁。要求：培养瓶或培养皿的内表面光滑、无毒、易于贴附。 细胞的接触抑制：当贴壁细胞分裂生长到表面相互接触时，细胞就会停止分裂增殖的现象。,动物组织细胞间隙中含有一定量的弹性纤维等蛋白质，将细胞网络起来
5、形成具有一定弹性和韧性的组织和器官（接触抑制现象）。,为什么动物组织细胞要用胰蛋白酶处理？,为什么要定期用胰蛋白酶使细胞从瓶壁上脱离下来？,大多数组织细胞不适应悬浮生长，它们必须在固定的表面上生长和分裂。细胞在培养瓶中贴壁生长，随着细胞越来越多，当贴壁生长的细胞分裂生长到表面相互接触时就停止分裂增长，这种现象叫做接触抑制。需要定期用胰蛋白质酶使细胞从壁上脱下来，传代培养。,胰蛋白酶会消化细胞吗？,胰蛋白酶除了可以消化细胞间的蛋白质外，长时间作用也会消化细胞膜蛋白，对细胞有损伤作用；作用时间太短，细胞不容易脱落，因此必须控制好作用时间。实际应用中的处理：做预实验，摸清效果最好时的胰蛋白酶的用量和
6、作用时间。,动物细胞培养条件：,1、无菌、无毒的环境（添加一定量的抗生素，定期更换培养液） 2、营养 （葡萄糖、氨基酸、无机盐、维生素、动物血清等。） 3、温度和PH36.5+（-）0.5度, 7.2-7.4 4、气体环境：O2和CO2（95%空气和5% CO2 ）,保证细胞顺利的生长增殖,植物细胞和动物细胞培养的比较,获得细胞或 细胞分泌蛋白,细胞的全能性,细胞株、细胞系,植物体,快速繁殖、培育无病毒植株等,葡萄糖、 动物血清,蔗糖、 植物激素,液体培养基,固体培养基,细胞增殖,1、 为何细胞在培养瓶中贴壁生长？ 2、为何要定期用胰蛋白酶使细胞从瓶壁上脱离下来，为何要搅拌？ 3、比较动物和植
7、物组织培养所用的培养基的成分.,细胞有接触抑制的现象,分散成单个细胞便于从培养液中获得营 养，排出代谢废物，利于继续培养,都有糖、氨基酸、促生长因子、无机盐、微量元素等 动物细胞培养液中还需加入动物血清、血浆等天然成分。,为什么对动物细胞进行培养时通常要添加血清？,血清中含有蛋白质、氨基酸、葡萄糖、激素等多种营养； 还含有多种未知的促细胞生长因子、促贴附因子及其他 活性物质，能促进细胞的生长、增殖和贴附。因此， 细胞培养时，一般需添加10%20%的血清。,细胞培养的方式：,1、群体培养： 将含有一定数量细胞的悬液置于培养瓶中，让细胞贴壁生长，汇合后形成均匀的单细胞层。2、克隆培养（细胞克隆）：
8、 把一个细胞从群体中分离出来单独培养，使之繁衍成一个新的细胞群体的技术。 一个细胞克隆中的所有细胞均来源于同一个祖先细胞。,获得的细胞系具有异质性。,获得的细胞系是纯系。,细胞培养中 “危机”出现的原因,干细胞：理论上是指具有无限自我更新能力（有细胞周期）和多方向分化潜能的一类细胞。,按照出现阶段可分为: 胚胎干细胞：取自囊胚的内细胞层，具有全能性即具有分化为几乎全部组织和器官的能力。 成体干细胞：取自成体细胞，如造血干细胞。,按分化能力可分为全能干细胞:如受精卵，胚胎干细胞多能干细胞:如造血干细胞，神经干细胞专能干细胞:如肌肉中的成肌干细胞,受精卵至早期胚细胞,细胞分裂、分化,细胞分裂、分化
9、,代数低,代数高,受精卵,全能干细胞,代数低,代数高,动物胚胎发育的早期，动物细胞在进行细胞分裂的过程中，随着代数的增高，子细胞中有一部分细胞进行了细胞高度分化，分化成了各种组织细胞；一部分细胞进入了休眠期，使其细胞代数停留不变，还有一部分细胞继续进行分裂并分化成代数较高的各种专能干细胞。动物体细胞分裂能力一般为60代，不同生物的体细胞分裂一代所用时间不同。,二、动物细胞培养技术的应用,（2）获得大量自身的皮肤细胞，用于植皮。,（1）生产蛋白生物制品：病毒疫苗、干扰素、单克隆抗体等。,生产病毒疫苗：利用动物细胞培养获得的细胞作为病毒的宿主，培养脱毒的病毒疫苗。 生产蛋白生物制品：利用杂交瘤细胞
10、生产干扰素、单克隆抗体等。,利用贴壁生长和接触抑制原理，为大面积烧伤病人移植取自病人皮肤的健康细胞培养的自身皮肤细胞，避免免疫排斥。,（3）获取干细胞对内脏器官进行修复（专能干细胞的体外培养）,（4）用于检测有毒物质,将培养到细胞株阶段的干细胞，用于器官修复（如心脏功能修复；肝肾功能修复）等。（海军医院曾完成过利用干细胞改善严重心衰病人心脏功能的病例）,根据致畸、致癌物质加入培养液后，导致培养细胞发生染色体变异的细胞占全部培养细胞的百分数，判断某种物质的毒性。,（5）用于生理、病理、药理等方面的研究，为治疗和预防疾病提供理论依据,医学家培养各种正常的或病变的细胞，用于生理、病理、药理方面的研究
11、（观察细胞的形态、结构和代谢方面的变化），为治疗和预防疾病提供理论依据。,（6）成为基因工程的下游工程基因治疗,在基因治疗中，修复后的患者细胞须经过细胞培养增殖成细胞株后，再进行细胞移植。,动物细胞工程的应用：,生产蛋白质生物制品,检测有毒物质,许多致畸、致癌物质加入培养液后，培养细胞会发生染色体结构和数目的变异。根据变异细胞占全部培养细胞的百分数，可以判断某种物质的毒性。,为烧伤病人植皮 如何利用动物细胞培养技术，解决为烧伤病人植皮问题?,利用动物细胞培养技术中细胞的贴壁生长和接触抑制特点，可以用烧伤病人自己的健康皮肤细胞培养出大量的自身薄层皮肤细胞供植皮所需。,用于科学研究：生理、病理、药
12、理,三、动物体细胞核移植技术和克隆动物,1、什么是细胞核移植？2、什么是克隆动物？,为什么用卵母细 胞做受体细胞,用MII期卵母细胞（卵母细胞进入输卵管，并停留在第2次成熟分裂中期，此时染色体都集中在赤道板位置，容易去除染色体，而且此时的细胞才具备受精能力，更容易接收外源染色体）因为细胞质环境适宜。重组需要的因子存在于MII期卵母细胞的胞质中，MII期卵母细胞中成熟促进因子（MPF）活性高，能支持胚胎的全程发育，因此用作受体卵母细胞。,为什么不用动物体 细胞直接培养而用 核移植技术？,动物细胞融合 1. 动物细胞融合过程,诱导,细胞膜穿通,细胞膜连接,细胞融合形成杂种细胞,细胞核,病毒颗粒,细
13、胞核,灭活的病毒颗粒黏附在细胞表面,细胞膜被病毒颗粒穿过,细胞膜连接,动物细胞融合,细胞融合，形成杂种细胞,动物细胞融合与植物细胞杂交的基本原理是什么？,细胞融合的具体步骤是：,细胞膜的流动性,动物细胞融合相当于植物细胞杂交的原生质体融合过程。,先进行膜穿通，再完成细胞质融合，细胞核的融合则是在第一次有丝分裂时完成的。,诱导动物细胞融合与植物细胞杂交的方法共同点,动物细胞融合的常用方法：化学法和灭活的动物病毒,主要用于制备单克隆抗体,获得杂种植株,用 途,物理、化学方法,（同左）,灭活的病毒,物理（离心、振荡、电刺激）,化学（聚乙二醇）,诱导方法,使细胞分散后诱导细胞融合,去除细胞壁后诱导原生
14、质体融合,细胞融合的方法,细胞膜的流动性,细胞膜的流动性,细胞融合的原理,动物细胞融合,植物体细胞杂交,比较项目,比较项目,植物、动物细胞融合的比较,长期以来，为了获得抗体，采用的是把某种抗原反复注射到动物体内，然后从动物血清中分离出所需抗体的方法。用这种方法获得的抗体，不仅产量低，而且抗体的特异性差，纯度低，反应不够灵敏。人们发现，在动物发生免疫反应的过程中，体内的效应B细胞可以产生多达百万种以上的特异性抗体，但是每个效应B细胞只分泌一种化学性质单一、特异性强的抗体。要想获得大量的单一抗体，就必须用单个效应B细胞进行无性繁殖。,（2）从动物血清中分离出的抗体有什么缺点？,（1）什么是抗体？是
15、由什么细胞产生的？,（3）单克隆抗体的概念？,（4）取效应B细胞进行细胞培养能否获得单克隆抗体？,什么是抗体？ 由何种细胞产生？ 主要分布在哪里？ 起何作用？ 什么是单 克隆抗体？,效应B细胞,血清,特异性免疫作用,抗体：机体受抗原刺激后产生的，并且能与该抗原发生特异性结合的具有免疫功能的球蛋白。,用单个B淋巴细胞进行无性增殖（扩增），也就是通过克隆，形成细胞群，这样的细胞群就有可能产生出化学性质单一、特异性强的抗体。,单克隆抗 体,讨论：怎样才能获得单克隆抗体？,提示1：仅用细胞培养技术可行吗？,提示2：我们所学的哪种细胞是可以无限增殖的？,提示3：有什么方法能使B细胞产生抗体的能力和肿瘤细
16、胞无限增殖能力同时具备呢？,设计方案： 一个B淋巴细胞只分泌一种特异性抗体 小鼠骨髓瘤细胞能无限增殖,-化学性质单一、特异性强的抗体。,杂种细胞,单克隆抗 体,实验目的:制备单克隆抗体. 实验原理：B淋巴细胞能产生抗体，骨髓瘤细胞能无限增殖，杂交瘤细胞既能产生抗体又能无限增殖。 实验材料：小白鼠 实验器材：培养皿、针筒等等。 实验过程：如下页,根据阿根廷科学家米尔斯坦和德国科学家柯勒设计的实验方案:,单克隆抗体的制备,单克隆抗体的制备过程：,骨髓瘤细胞？,选出能产生特定抗体的细胞群、继续培养,体外培养,从培养液中获取,单克隆抗体制备过程,抗原？,淋巴细胞？,体内培养,从腹水中提取,单克隆抗体,
17、细胞融合、筛选,杂交瘤细胞,细胞培养,单克隆抗体制备过程,细胞融合、筛选,足够数量的、能产生特定抗体的细胞群,单克隆抗体,诱导其融合的方法有哪些？,为什么选用小鼠骨髓瘤细胞与B细胞融合？,细胞的同源性越近，融合形成的杂种细胞越易成活。继承了双亲细胞的遗传物质，不仅具有B细胞分泌抗体的能力，而且还有无限增殖的本领，因而可以获得大量单克隆抗体。,动物细胞融合与单细胞克隆1、过程：,物理法、化学法,灭活的病毒,仙台病毒 疱疹病毒 新城鸡瘟病毒,筛选,特定的选择性培养基,单克隆抗体,思 考：,（1）为什么用小鼠骨髓瘤细胞与B淋巴细胞融合？,（1）为什么用小鼠骨髓瘤细胞与B淋巴细胞融合？,细胞的同源性越
18、近，融合形成的杂种细胞越易成活。继承了双亲细胞的遗传物质，不仅具有B细胞分泌抗体的能力，而且还有无限增殖的本领，因而可以获得大量单克隆抗体。,（）骨髓瘤细胞是癌细胞吗？,有无限增殖能力的细胞是肿瘤细胞，而具有转移能力的肿瘤细胞，称为癌细胞，所以瘤细胞不能等同于癌细胞。,（）制备过程为何要经过两次筛选？,第一次筛选得到杂交瘤细胞 第二次筛选出特异抗体的细胞群。,(5) 本过程利用了哪些原理？,免疫原理、细胞融合原理、动物细胞培养原理,（）单克隆抗体制备过程中应用哪些细胞 工程技术手段？,细胞融合技术、细胞培养技术。,两次筛选分别有什么目的？,下图为某同学根据杂交瘤技术的方法，设计的生产破伤风杆菌
19、的实验方案,制备单克隆抗体,效应B细胞,抗体,细胞融合,灭活病毒,双亲细胞,分泌抗体,无限增殖,原代,传代,50,如何筛选出杂交瘤细胞？,（1）淋巴细胞合成DNA有D和S两条途径，其中D途径能够被氨基蝶呤阻断。一般不分裂增殖。 （2）骨髓瘤细胞是特殊选择的代谢缺陷型细胞，其DNA合成过程只具有D途径，能被氨基蝶呤阻断。 （3）杂交瘤细胞则即可无限增殖，又具备两条DNA合成途径。,加入了氨基嘌呤的选择培养基,第一次筛选,第二次筛选,HAT培养液 细胞合成DNA有两条途径：一为主要途径，利用糖和氨基酸合成核苷酸，可被氨基蝶呤阻断；二为补救途径，通过磷酸核糖转化酶（HGPRT）或胸腺嘧啶核苷激酶（T
20、K）利用次黄嘌呤、胸腺嘧啶核苷合成核苷酸。骨髓瘤细胞缺乏HGPRT和TK（无补救途径）；B细胞具有HGPRT（有补救途径），但在体外不能长期培养，自然死亡；杂交瘤细胞从B细胞获得HGPRT或TK基因在HAT培养基上生长繁殖。,整个制备过程为何要经过两次筛选?,第一次筛选得到杂交瘤细胞（多种）。 第二次需先在多孔培养板上，在每孔只有一个杂交瘤细胞的情况下开始培养，然后再筛选出继承了双亲遗传物质的杂交瘤细胞，即不仅具有效应B细胞分泌抗体的能力，而且还具有无限增殖的本领，因而可以获得大量单克隆抗体。 由于该细胞群是单个杂交瘤细胞克隆得来的，所以产生的抗体必然是化学性质单一的特异性强的单克隆抗体。这里
21、的单克隆确有单个细胞克隆的含义，只不过克隆的不是B淋巴细胞，而是杂交瘤细胞。,酶解法去壁,纤维素酶,果胶酶,物理法,聚乙二醇(PEG),离心 振动 电刺激,化学法,灭活的病毒,生物法,去壁方法,人工诱导融合的方法,条件,培养基,原理,动物细胞培养的培养液,细胞增殖（有丝分裂）,单细胞克隆,思考题,1、植物组织培养过程将组织分散成单个细胞的吗？,、动物细胞培养过程将组织分散成单个细胞的吗？,、为何动物细胞培养过程将组织分散成单个细胞的呢？,、如何将动物组织分散成单个的细胞呢？,、胰蛋白酶的作用是什么呢？由此可说明细胞间的物质是什么成份？,没有,是,成块的组织细胞靠在一起,彼此限制了细胞的生长和增
22、殖,先用剪刀剪碎,后用蛋白酶处理,胰蛋白酶水解蛋白质,细胞间的成份是蛋白质,思考题,、细胞膜的主要成份是什么？,、胰蛋白酶能将细胞消化掉吗？,、既然胰蛋白酶能将细胞消化掉，那将动物组织分散成单个细胞要注意什么问题呢？,、能够用胃蛋白酶代替胰蛋白酶吗？为什么？,10、动物细胞培养取材时，一般是取胚胎组织或幼龄动物的组织或器官，请解释原因？,蛋白质和磷脂,能,注意时间的控制,不能，因为两的最适PH不同，而正常组织细胞的生存环境与胰蛋白酶的最适PH较接近,胚胎组织或幼龄动物的组织或器官分裂、增殖旺盛,思考题,11、动物细胞培养瓶内表面为何要光滑、无毒？,12、培养瓶中的细胞培养到什么时候就不再分裂、
23、增殖？,13、如此时细胞数量并未达到人们的需求，应该怎样办？,易于培养细胞贴壁，进行生长增殖,当贴壁细胞分裂生长到表面相互接触时，细胞分裂就会停止分裂增殖，这种现象叫接触抑制。,将贴满细胞壁的细胞用胰蛋白酶处理，然后继续增殖。,这样的过程叫做传代培养,思考题,14、如何理解原代培养和传代培养？,15、传代培养的细胞能一直传代下去吗？,16、有些为何能一直传下去吗？,17、动物细胞培养就是为了得到这些细胞吗？,18、人类一般保存的是哪类细胞呢？为什么？,上述过程中，在第一培养瓶中培养就是原代培养，之后转移到其它培养瓶中培养就是传代培养,不都能,发生突变，朝着癌细胞方向发展,不是,保存10代以内的
24、细胞，因为1050部分细胞的细胞核型可能发生变化，有少部分还发生突变向癌细胞方向发展,单克隆抗体的应用,作为诊断试剂 用于治疗疾病和运载药物（制成“生物导弹”）,优点是什么？,单克隆抗体的应用,1、用于临床诊断（利用抗体与抗原的特异性结合）,2、形成“生物导弹”治疗肿瘤,目前世界各国已经研制出数以百计的单克隆抗体。许多缺乏良好诊断手段的传染病、免疫性疾病、血液病、内分泌疾病和遗传病，用单克隆抗体作为诊断手段，是一个必然趋势。另外，用单克隆抗体做体内诊断，借以鉴别和定位体内“病灶”也引起人们的注意，目前，主要用于肿瘤追踪及心肌梗塞的诊断。,单克隆抗体作为载体分子，同抗癌药物相结合，将他们运载到肿
25、瘤部位，杀死癌细胞，这种抗体药物结合物称之为生物导弹。它能定向杀灭癌细胞，避免或减少对正常细胞的伤害，大大减轻了抗癌药物的副作用。,细胞工程,应用的原理和方法,细胞生物学和分子生物学,细胞整体水平或细胞器水平,按照人们的意愿来改变细胞内的遗传物质或获得细胞产品,概念,分类,植物细胞工程,理论基础,细胞的全能性,研究的目的,研究的水平,动物细胞工程,技术分类,细胞融合技术、细胞拆合技术、染色体导入技术、基因转移技术、胚胎移植技术、细胞与组织培养技术,尽管克隆技术有着广泛的应用前景，但离产业化尚有很大距离。因为作为一个新兴的研究领域，克隆技术在理论和技术上都还很不成熟。,资料1：克隆技术存在的问题
26、,在理论上，分化的体细胞克隆对遗传物质重编（细胞核内所有或大部分基因关闭，细胞重新恢复全能性的过程）的机理还不清楚；克隆动物是否会记住供体细胞的年龄，克隆动物的连续后代是否会累积突变基因，以及在克隆过程中细胞质线粒体所起的遗传作用等问题还没有解决。,在实践中，技术尚不成熟，得到的克隆动物具有极大的偶然性和随机性。迄今为止，克隆试验的成功率始终很低。例如在培育“多莉“的实验中，融合了277枚移植核的卵细胞，仅获得了 “多莉”这一只成活羔羊，成功率只有0.36，同时进行的胎儿成纤维细胞和胚胎细胞的克隆实验的成功率也分别只有1.7和1.1。目前，多莉羊的制备还不能重复，更不能肯定克隆多莉羊的方法也适
27、用于其它动物或其它不同组织器官的细胞。克隆动物夭折率高，不少克隆动物天生患有疾病或体形过大。克隆动物没有遗传物质的交流和互补，将会加剧一些遗传疾病的发生。,动物难以克隆的根本原因：,基因表达的调控使得细胞中合成了专一的蛋白质。,一类基因是维持生存的；另一类基因随着组织器官和发育阶段不同而选择性表达。,如：哺乳动物的红细胞只 有少量的线粒体。,（3）完成胚胎发育的必要的环境条件。,（1）具有包含物种完整基因组的细胞核的活细胞；,（2）能有调控细胞核发育的细胞质物质；,克隆所要的实际条件：,克隆所要的理论条件：,细胞的全能性。,四、其它生物工程技术,（一）胚胎移植技术（试管婴儿）,实践意义： (1
28、)提高良种母畜的繁殖力；(2)使母畜一次生胎；(3)进行胚胎性别选择；(4)减少精液消耗；(5)冻存良种胚胎；(6)试管婴儿：可以解除人的某些不孕症。,（二）胚胎分割移植技术,代孕母牛,1、过程,早期胚胎,胚胎 移植,母体子宫,发育,多个幼体,2、特点,属于无性生殖，后代具备一个亲本的遗传物质,3、应用,加快优良种畜的繁殖速度等,切割,多个细胞,早期胚胎,利用胚胎干细胞具有全能性的特点,细胞拆合技术：也称为细胞核（包括细胞器）移植技术。 是将细胞核和细胞质用某种方法拆开，然后再把分离的不同细胞的细胞核（细胞器）和胞质体重新组合成一个新细胞。,胚胎移植技术,电脉冲刺激，动物细胞培养技术,2、克隆
29、羊多莉有几个母亲？,3、多莉羊是雄还是雌？主要性状像谁？,4、其性状遗传是否符合孟德尔遗传规律？,（三）核移植技术-克隆,1.核移植技术涉及到几种生物技术？,例：下列关于细胞工程的叙述中，错误的是 A植物细胞融合必须先制备原生质体 B试管婴儿技术包括人工受精和胚胎移植两方面 C经细胞核移植培育出的新个体只具有一个亲本的遗传性状 D用于培养的植物器官或组织属于外植体,失分陷阱 没有认识到生物的遗传中核遗传和质遗传共同作用的结果，同时对各种细胞工程的具体过程不了解，对有关的术语不理解，都是失分主要原因。,多莉羊诞生的意义：已经分化的动物体细胞核，仍然具有全能性，在合适的条件下，就可以发育成新的个体
30、。,克隆的意义与应用,1.加速家畜遗传改良进程，促进优良畜群繁育,体细胞核移植技术的应用前景,优良家畜体细胞核,2.保 护 濒 危 物 种,去核卵 母细胞,核移植重构胚,细胞核,濒危动物细胞核,3.异 种 器 官 移 植,可移植器官短缺,克隆过程,4.生 产 药 用 蛋 白,克隆过程,5.培 育 各 种 疾 病 动 物 模 型,应用核移植技术可以培育基因完全一致的实验动物模型 ，为遗传学，病理学研究提供良好的实验材料。,1、核移植成功率低,2、克隆动物异常 胎儿或新生儿死亡率极高（死亡率90%死亡）。 余下的10%中的一半不能活到成年。 极少数能全程发育的个体也表现为超重、呼吸系统疾病等异常表
31、型。 个别表型正常者也存在有免疫缺陷、关节炎或肾、脑畸形等问题,导致克隆动物后期死亡。,目前存在的问题,五、需要归纳总结的几个问题,1.克隆技术及种类,是指从一个共同的祖先，通过无性繁殖的方法产生出来的一群遗传特性相同的DNA分子、细胞或个体，是一种人工诱导的无性繁殖方式。,个体水平克隆：克隆羊多利,分子水平克隆：PCR技术,细胞水平克隆：动物细胞培养（单克隆体）,2.培养基的异同点,分子水平克隆（PCR技术）：DNA的复制；RNA的复制；同一基因的多次表达等。,细胞水平克隆：动物细胞培养（单克隆体）；愈伤组织的不断增殖等。,个体水平克隆：克隆羊多利。,3.对细胞处理的总结,解离液：破坏细胞间
32、质，杀死细胞并使细胞分离，用于有丝 分裂实验。 纤维素酶和果胶酶：用于制备活的原生质体进行植物细胞杂交。 胰蛋白酶：水解动物组织细胞间隙中含有的弹性纤维等蛋白质，使动物组织细胞彼此分离，用于动物细胞培养。 CaCl2溶液：增加受体微生物细胞壁的通透性，用于基因工程中目的基因的导入。,4.三项生物工程技术的比较,5.动物细胞培养、植物细胞培养的比较,6.植物体细胞杂交与动物细胞融合的比较,克隆技术的发展,1、微生物克隆,2、遗传工程克隆,3、个体水平上的克隆,.20世纪50年代，美国 两栖动物的鱼类细胞核移植技术。,.20世纪80年代以来，世界各国 应用胚胎细胞克隆技术，克隆出羊、牛、 鼠、兔、
33、猴等动物。,.1997年苏格兰罗斯林研究所 完成首例体细胞克隆动物克隆羊“多利”,7、关于组织培养的六个问题,(3) 再分化的诱导过程：先诱导生芽，再诱导生根。,（1）为什么在避光条件下培养愈伤组织？对于植物组织培养来说，光照条件非常重要，包括光照强度、时间和波长。但在愈伤组织的诱导阶段往往要暗培养，而在分化再生的过程中一定要有光照。愈伤组织诱导阶段的暗培养有利于细胞的脱分化产生愈伤组织，如果在光照条件下容易分化产生维管等组织，不利于产生大量的愈伤组织。,(6)染色体数目的变化:因组织培养过程主要通过细胞有丝分裂过程来完成的,因此其细胞中的染色体数与本物种的染色体数相同。,（5）植物组织培养过
34、程中细胞代谢特点的转变：即由自养型转变成异养型，再由异养型转变成自养型（叶绿体的有无），进而说明了细胞中含有本物种全部遗传物质。,(4)愈伤组织再分化成芽的方式主要有不定芽方式和胚状体方式两种。教材中介绍的为不定芽方式；胚状体方式需要在愈伤组织形成后，对其进行分散处理成单个细胞，再诱导其进行细胞分裂和细胞分化，形成具有胚芽、胚轴、胚根的胚状体，进而发育成完整植株。,已知细胞合成DNA有D和S两条途径，其中D途径能被 氨基嘌呤阻断。人淋巴细胞中有这两种DNA的合成途径，但一般不分裂增殖。鼠骨髓瘤细胞中尽 管没有S途径，但能不断分裂增殖。将这两种细胞在试管中混合，加聚乙二醇促融，获得杂种细胞。请答
35、：（1）试管中除融合的杂种细胞外，还有_ _种融合细胞。 （2）设计一种方法（不考虑机械方法），从培养液中分离出杂种细胞，并说明原理。方法：_。 原理：_。,培养液中加入氨基嘌呤，收集增殖的细胞,加入氨基嘌呤后，使D合成途径阻断，仅有D合成途径的骨髓瘤细胞及其彼此融合的细胞就不能增殖， 但人淋巴细胞和骨髓瘤细胞融合后的杂种细胞中可以利用淋巴细胞中的S途径合成DNA而增殖,2,（3）将分离出的杂种细胞在不同条件下继续培养， 获得A、B、C三细胞株。各细胞株内含有的人染色体 如下表（“”有，“”无），测定各细胞株中人体所 具有的五种酶的活性。结果是：B株有a酶活性； A、B、C株均有b酶活性；A、B株有c酶活性； C株有d酶活性；A、B、C株均无e酶活性。若人 基因的作用不受鼠基因影响，则支配a、b、c、d和e酶 合成的基因依次位于人的第_ 号染色体上。,6 1 2 7 8,
