1、第九章 DNA的复制和修复,本章重点介绍遗传中心法则和DNA的半保留复制以及逆转录的过程和机理，对DNA的损伤和修复、突变和重组作一般介绍。,返回,思考,DNA是绝大多数生物体遗传信息的载体，继1953年Watson & Crick提出DNA双螺旋结构模型后，1958年，Crick提出了“中心法则”(Central dogma)揭示了遗传信息的传递规律。,遗传信息传递的 中心法则,生物的遗传信息以密码的形式储存在DNA分子上，表现为特定的核苷酸排列顺序。在细胞分裂的过程中，通过DNA复制把亲代细胞所含的遗传信息忠实地传递给两个子代细胞。在子代细胞的生长发育过程中，这些遗传信息通过转录传递给RN
2、A，再由RNA通过翻译转变成相应的蛋白质多肽链上的氨基酸排列顺序，由蛋白质执行各种各样的生物学功能，使后代表现出与亲代相似的遗传特征。后来人们又发现，在宿主细胞中一些RNA病毒能以自己的RNA为模板复制出新的病毒RNA，还有一些RNA病毒能以其RNA为模板合成DNA，称为逆转录这是中心法则的补充。,中心法则总结了生物体内遗传信息的流动规律，揭示遗传的分子基础，不仅使人们对细胞的生长、发育、遗传、变异等生命现象有了更深刻的认识，而且以这方面的理论和技术为基础发展了基因工程，给人类的生产和生活带来了深刻的革命。,DNA通过复制将遗传信息由亲代传递给子代；通过转录和翻译，将遗传信息传递给蛋白质分子，
3、从而决定生物的表现型。DNA的复制、转录和翻译过程就构成了遗传学的中心法则。 在RNA病毒中，其遗传信息贮存在RNA分子中。因此，在这些生物体中，遗传信息的流向是RNA通过复制，将遗传信息由亲代传递给子代，通过反转录将遗传信息传递给DNA，再由DNA通过转录和翻译传递给蛋白质，这种遗传信息的流向就称为反中心法则。,目 录,第一节 DNA的复制（DNA指导下的DNA合成） 第二节 DNA的损伤与修复 第三节 DNA突变 第四节 逆转录作用（RNA指导下的DNA的合成） 第五节 DNA的遗传重组,第一节 DNA的半保留复制,一、概念和实验依据 二、DNA聚合反应有关的酶类 三、DNA的复制的起始点
4、和方式 四、原核细胞DNA的复制过程 五、DNA复制的忠实性 六、真核细胞DNA的复制,DNA的半保留复制的概念,DNA在复制时，两条链解开分别作为模板，在DNA聚合酶的催化下按碱基互补的原则合成两条与模板链互补的新链，以组成新的DNA分子。这样新形成的两个DNA分子与亲代DNA分子的碱基顺序完全一样。由于子代DNA分子中一条链来自亲代，另一条链是新合成的，这种复制方式称为半保留复制。,DNA的半保留复制实验依据,1958年Meselson & stahl用同位素示踪标记加密度梯度离心技术实验,证明了DNA是采取半保留的方式进行复制.,15N DNA,14N- 15N DNA,14N DNA,
5、14N- 15N DNA,复制中的大肠杆菌染色体放射自显影图 (Caims实验),将3H-胸苷标记大肠杆菌DNA，经过近两代的时间，3H-胸苷掺入大肠杆菌DNA 。用溶菌酶把细胞壁消化掉，使完整的大肠杆菌染色体DNA释放出来，放射自显影，得到上图。非复制部分（C）银粒子密度较低，由一股放射性链和一股非放射性链构成。已复制部分站整个染色体的三分之二，其中一条双链（ B ）仅有一股链是标记的，另外一股双链（ A ）的两股链都是标记的，银粒子密度为前二者的两倍。染色体全长约为1100微米。,原核生物DNA聚合反应有关的酶类,（1）DNA聚合酶(DNA polymetases) （2）拓扑异构酶(to
6、poisomerase):兼具内切酶和连接酶活力，能迅速将DNA超螺旋或双螺旋紧张状态变成松驰状态，便于解链。(3） DNA解链酶(DNA helicase) （4）单链结合蛋白(single-strand binding protein,SSB)：结合在解开的DNA单链上，防止重新形成双螺旋。 (5）引物酶(peimase)和引发体(primosome) ：启动RNA引物链的合成。(6）DNA连接酶（DNA ligase）,拓扑异构酶(topoisomerase) 拓扑异构酶可使DNA双链中的一条链切断，松开双螺旋后再将DNA链连接起来，从而避免出现链的缠绕。拓扑异构酶可切断DNA双链，使D
7、NA的超螺旋松解后，再将其连接起来。,大肠杆菌拓朴异构酶的结构,DNA解链酶解链酶或rep蛋白，是用于解开DNA双链的酶蛋白，每解开一对碱基，需消耗两分子ATP。目前发现存在至少存在两种解链酶。,单链DNA结合蛋白单链DNA结合蛋白（single strand binding protein, SSB）又称螺旋反稳蛋白（HDP）。这是一些能够与单链DNA结合的蛋白质因子。其作用为： 使解开双螺旋后的DNA单链能够稳定存在，即稳定单链DNA，便于以其为模板复制子代DNA； 保护单链DNA，避免核酸酶的降解。,DNA聚合酶催化的链延长反应,子链,3,5,模板链,大肠杆菌三种DNA聚合酶比较,DNA
8、 聚合酶,分子量 每个细胞的分子统计数 5-3 聚合酶作用 3-5 核酸外切酶作用 5-3 核酸外切酶作用 转化率,DNA 聚合酶,109，000 400 + + + 1,120，000 100 + + - 0 .05,400，000 10-20 + + - 50,比较项目,DNA 聚合酶,切除引物 修复,修复,复制,功能,1999年发现聚合酶 和，它们涉及DNA的错误倾向修复（errooune repair）,DNA聚合酶的3- 5外切酶水解位点,3,3,5,5,错配碱基,DNA聚合酶5- 3外切酶活力,5- 3核酸外切酶水解位点,单链缺口,5,大肠杆菌DNA聚合酶全酶的结构和功能,延长因子
9、,DNA聚合酶异二聚体,核心酶,校对,引物的结合和识别,促使核心酶二聚化,DNA连接酶连接切口,Mg2+,连接酶,A,T,C,G,P,T,T,P,P,P,A,A,C,C,T,G,A,P,A,C,P,P,P,P,OH,T,G,G,A,T,C,G,P,T,T,P,P,P,A,A,C,C,T,G,A,P,A,C,P,P,P,T,G,G,P,缺口,3,3,5,5,5,5,3,3,模板链,模板链,DNA的双向和单向复制,大肠杆菌复制起点成串排列的重复序列,DNA生物合成过程,一、复制的起始DNA复制的起始阶段，由下列两步构成。（一）预引发：1解旋解链，形成复制叉：由蛋白因子（如dnaB等）识别复制起始点
10、，拓扑异构酶和解链酶使DNA的超螺旋及双螺旋结构解开，碱基间氢键断裂，形成两条单链DNA。单链DNA结合蛋白（SSB）结合在两条单链DNA上，形成复制叉。,2引发体组装：其他蛋白因子以及引物酶一起组装形成引发体。（二）引发：在引物酶的催化下，以DNA为模板，合成一段短的RNA片段，从而获得3端自由羟基（3-OH）。,二、复制的延长 阶段：,（一）聚合子代DNA：由DNA聚合酶催化，以35方向的亲代DNA链为模板，从53方向聚合子代DNA链。在原核生物中，参与DNA复制延长的是DNA聚合酶；而在真核生物中，是DNA聚合酶(延长随从链)和（延长领头链）。,以35方向的亲代DNA链作模板的子代链在复
11、制时基本上是连续进行的，其子代链的聚合方向为53，这一条链被称为前导链(leading strand)。而以53方向的亲代DNA链为模板的子代链在复制时其链的聚合方向与复制叉移动的方向相反，这条链是不连续合成的，称为随后链(lagging strand)。,（二）冈崎片段：由于亲代DNA双链在复制时是逐步解开的，因此，随后链的合成也是一段一段的。DNA在复制时，由随后链先形成的一些短DNA片段称为冈崎片段(Okazaki fragment)。冈崎片段的大小，在原核生物中约为10002000个核苷酸，而在真核生物中约为100个核苷酸。,三、复制的终止 阶段：,（一）去除引物，填补缺口：在原核生物
12、中，由DNA聚合酶来水解去除RNA引物，并由该酶催化延长引物缺口处的DNA，直到剩下最后一个磷酸酯键的缺口。而在真核生物中，RNA引物的去除，由一种特殊的核酸酶来水解，而冈崎片段仍由DNA聚合酶来延长。,（二）连接冈崎片段：在DNA连接酶的催化下，形成最后一个磷酸酯键，将冈崎片段连接起来，形成完整的DNA长链。,原核细胞DNA的半不连续复制过程,复制叉的移动方向,3,5,3,5,复制的起始,DNA链的延长,DNA链终止,聚合酶III核心酶,大肠杆菌复制体结构示意图,聚合酶I,聚合酶III核心酶,滞后链,前导链,解螺旋酶,引物合成酶,RNA引物,引发体,拓扑异构酶II,-夹子,-聚体,-夹子,
13、-复合物,RNA引物,单链结合蛋白（SSB）,大肠杆菌染色体复制的终止,ori,复制叉2,复制叉1,终止复制叉2,终止复制叉1,复制叉1,复制叉2,完成复制,DNA拓扑异构酶,连锁染色体,复制叉处前导链和随后链同时合成的工作模型,复制的忠实性,DNA复制过程是一个高度精确的过程，据估计，大肠杆菌DNA复制5109碱基对仅出现一个误差，保证复制忠实性的原因主要有以下三点:, DNA聚合酶的高度专一性（严格遵循碱基配对原则，但错配率为7 10-6 ）, DNA聚合酶的校对功能（错配碱基被3-5外切酶切除）, 起始时以RNA作为引物,DNA聚合酶的校对功能,DNA聚合酶的校对功能,聚合酶,错配硷基,
14、复制方向,正 确核苷酸,5,5,5,3,3,3,切除错配核苷酸,起始时以RNA作为引物的作用,DNA复制为什么要合成一个RNA引物，而后又把这个引物消除呢？这是保证DNA聚合过程高度精确的又一措施。已知DNA 聚合酶具有35外切酶功能校对复制过程中的核苷酸，也就是说聚合酶在开始形成一个新的磷酸二酯键前，总是检查前一个碱基是否正确，这就决定了它不能从头开始合成。因此先合成一条低忠实性的多核苷酸来开始DNA的合成，并以核糖核苷酸来表示是“暂时”的，当DNA开始聚合以后再以53外切酶的功能切除，以高忠实性的脱氧核苷酸取而代之，确保复制的忠实性。,真核细胞DNA复制的特点, 多个起点复制, 真核生物的
15、DNA聚合酶 端粒（telemere）复制,真核生物的DNA聚合酶,真核生物端粒的形成：端粒（telomere）是指真核生物染色体线性DNA分子末端的结构部分，通常膨大成粒状。其共同的结构特征是由一些富含G、C的短重复序列构成，可重复数十次至数百次。,端粒酶（telomerase）,DNA复制需要引物，但在线形DNA分子末端不可能通过正常的机制在引物被降解后合成相应的片段.如果没有特殊的机制合成末端序列，染色体就会在细胞传代中变得越来越短。这一难题是通过端粒酶的发现才得到了澄清，端粒酶是一种含RNA的蛋白复合物，实质上是一种逆转录酶，它能催化互补于RNA模板的DNA片段的合成，使复制以后的线形
16、DNA分子的末端保持不变。,初步研究表明，人体中生殖细胞的端粒长度保持不变，而体细胞的端粒长度则随个体的老化而逐步缩短。对此的一个推论是：人的生殖细胞具端粒酶的活力，体细胞则否。这一问题的解决无疑会有助于对生命衰老的认识。,端粒酶,线性DNA在复制完成后，其末端由于引物RNA的水解而可能出现缩短。故需要在端粒酶（telomerase）的催化下，进行延长反应。 端粒酶是一种RNA-蛋白质复合体，它可以其RNA为模板，通过逆转录过程对末端DNA链进行延长。,端粒合成的一种模型,整合和杂交,端粒酶(telomerase)的作用机制,真核和原核DNA细胞复制比较,第二节 DNA的损伤与修复,某些物理化
17、学因子，如紫外线、电离辐射和化学诱变剂等，都有引起生物突变和致死的作用，其机理是作用于DNA，造成DNA结构和功能的破坏，称为DNA的损伤. DNA的修复主要有以下类型:,暗修复,四、诱导修复（SOS修复）,一、光裂合酶修复,二、切除修复,三、重组修复,由紫外线、电离辐射、X射线等引起的DNA损伤。其中，X射线和电离辐射常常引起DNA链的断裂，而紫外线常常引起嘧啶二聚体的形成，如TT，TC，CC等二聚体。这些嘧啶二聚体由于形成了共价键连接的环丁烷结构，因而会引起复制障碍。,化学因素：如亚硝酸与亚硝酸盐，可加速C脱氨基生成U，A脱氨基生成I。,DNA紫外线损伤的光裂合酶修复,1、形成嘧啶二聚体,
18、2、光复合酶结合于 损伤部位,3、酶被可见光激活,4、修复后酶被释放,DNA的损伤和切除修复,碱基丢失,碱基缺陷或错配,结构缺陷,切开,核酸内切酶,核酸外切酶,切除,DNA聚合酶,DNA连接酶,AP核酸内切酶,核酸外切酶,切开,切除,修复,连接,糖苷酶,插入酶,碱基取代,DNA的重组修复,胸腺嘧啶二聚体,复制,核酸酶及重组蛋白,修复复制,DNA聚合酶,DNA连接酶,重组,重组修复(recombination repairing)： 这是DNA的复制过程中所采用的一种有差错的修复方式。,SOS修复：这是一种在DNA分子受到较大范围损伤并且使复制受到抑制时出现的修复机制，以SOS借喻细胞处于危急状
19、态。DNA分子受到长片段高密度损伤，使DNA复制过程在损伤部位受到抑制。损伤诱导一种特异性较低的新的DNA聚合酶，以及重组酶等的产生。由这些特异性较低的酶继续催化损伤部位DNA的复制，复制完成后，保留许多错误的碱基，从而造成突变。,SOS反应的机制,未诱导的细胞,靶基因,lexA基因被LexA蛋白质部分阻遏,recA基因被LexA蛋白质部分阻遏,（40个不同的位点被阻遏）,LexA(阻遏物),RecA(辅蛋白酶),第三节 DNA的突变,DNA分子中的核苷酸序列发生突然而稳定的改变，从而导致DNA的复制以及后来的转录和翻译产物随之发生变化，表现出异常的遗传特性，称为DNA的突变。它包括由于DNA
20、损伤和错配得不到修复而引起的突变，以及由于不同DNA分子之间的交换而引起的遗传重组。,二、诱变剂的作用碱基类似物(base analog)碱基修饰剂(base modifier)嵌入染料(intercalation dye) 紫外线(ultraviolet)和电离辐射(ionizing radiation),一、突变的类型碱基对的置换(substitution) 移码突变(framesshift mutation),DNA突变的类型,野生型基因,碱基对的置换(substitution),移码突变 (framesshift mutation),第四节 逆转录作用,一、概念,二、逆转录酶,三、病毒
21、逆转录过程,四、逆转录的生物学意义,扩充了中心法则 有助于对病毒致癌机制的了解 与真核细胞分裂和胚胎发育有关 逆转录酶是分子生物学重要工具酶,三种功能,逆转录过程中cDNA的合成,逆逆转录病毒的生活周期 生活周期,RNA,衣壳,被膜,逆转录酶,转录,转译,整合入宿主细胞染色体DNA,进入细胞,丢失被膜,丢失衣壳,逆转录,RNA,RNA,cDNA,衣壳蛋白,被膜蛋白,逆转录酶,第五节 DNA的遗传重组,DNA分子内或分子间发生遗传信息的重新组合，称为遗传重组(genetic recombination)，或者基因重排(gene rearrangement )。重组产物称为重组体DNA(recombinant DNA)。重组的意义在于，它能迅速地增加群体的遗传多样性；使有利的突变与不利突变分开；通过优化组合积累有意义的遗传信息。此外，重组还参与了许多重要的生物学过程，它为DNA损伤或复制障碍提供修复机制。某些生物的基因表达受基因重组的调节，生物发育过程也受到基因加工的控制。,一、同源重组（homologous recombination ） 二、特异位点重组（site-specific recombination） 三、转座重组（transpositional recombination）,
