DNA的复制和修复.doc

1、第十三章 DNA 的复制和修复生物体的遗传信息储存在 DNA 中，并通过 DNA 的复制由亲代传给子代。在子代的生长发育中遗传信息自 DNA 转录给 RNA，然后翻译成蛋白质以执行各种生命功能，使后代表现出与亲代相似的遗传性状。1958 年，F.Crick 提出中心法则：（1）以原 DNA 分子为模板，合成出相同 DNA 分子的过程。（2）以某一段 DNA 分子为模板，合成出与其序列对应的 RNA 分子的过程。（3）以 mRNA 为模板，根据三联密码规则，合成对应蛋白质的过程。中心法则揭示了生物体内遗传信息的传递方向。图DNA 生物合成有两种方式：DNA 复制和反转录DNA 体内复制涉及：原核

2、、真核生物的染色体、细菌质粒（环状，双链） 、真核细胞器DNA（线粒体、叶绿体） 、病毒（双链，环状）DNA 的体外复制：分子克隆。第一节 DNA 的复制一、 DNA 半保留复制1953 年，Watson 和 Crick 在提出 DNA 双螺旋结构模型时就推测 DNA 可能按照半保留机制进行自我复制。P321 图 191 Watson 和 Crick 提出的 DNA 双螺旋复制模型在复制过程中，首先亲代双链解开，然后每条链作为模板，在其上合成互补的子代链，结果新形成的两个子代 DNA 与亲代 DNA 分子的碱基顺序完全一样，而且每个子代 DNA 分子中有一条链完全来自亲代 DNA，另一条是新合

3、成的。1958 年，Meselson 和 Stahl 用 15N 标记 E.coli. DNA，证明了 DNA 的复制是半保留复制。P322 图 19-2 DNA 的半保留复制。1963 年，Cairns 用放射自显影法，在显微镜下首次观察到完整的正在复制的 E. coli. 染色体DNA。P323 图 19-33H-脱氧胸苷标记 E.coli. DNA ，经过将近两代时间，用溶菌酶消化细胞壁，将 E.coli. DNA转至膜上，干燥，压感光胶片， 3H 放出 粒子，还原银，在光学显微镜下观察。用这种方法证明了大肠杆菌染色体 DNA 是一个环状分子，并以半保留的形式进行复制。DNA 的半保留复

4、制可以说明 DNA 在代谢上的稳定性。经过多代复制，DNA 的多核苷酸链仍可以保持完整，并存在于后代而不被分解掉。二、 复制起点、单位和方向DNA 的复制是在起始阶段进行控制的，一旦复制起始，它就会继续下去直到整个复制子完成复制。1、 复制起点复制起点是以一条链为模板起始 DNA 合成的一段序列。有时，两条链的复制起点并不总是在同一点上（如 D 环复制） 。在一个完整的细胞周期中，每一个复制起点只使用一次，完成一次复制过程。多数生物的复制起点，都是 DNA 呼吸作用强烈（甲醛变性实验）的区段，即经常开放的区段，富含 A.T。环状 DNA 复制起点的确定方法P325 图 19-6复制起点的克隆和

5、功能分析重组质粒转化法大肠杆菌的复制起点 oriC 区 1Kb 的重组质粒在转化子中的复制行为与其染色体一样，受到严密控制，每个细胞只有 1-2 个拷贝，用核酸外切酶缩短 oriC 克隆片段的大小，最后得到 245bp 的基本功能区，携带它的质粒依然能够自我复制，拷贝数可以增加到 20 以上，这说明发动复制的序列在 245bp 的基本功能区，而决定拷贝数的序列在基本功能区之外和 1Kb 之间。鼠伤寒沙门氏菌的起点位于一段 296bp 的 DNA 片段上，与大肠杆菌的复制起始区有 86%同源性，而且有些亲缘关系较远的细菌，其复制起点在大肠杆菌中亦能起作用。因此，复制起始区的结构可能是很保守的。起

6、始序列含有一系列对称的反向重复和某些短的成簇的保守序列。2、 复制单位复制子(Replicon)：Genome 能独立进行复制的单位，每个复制子都含有一个复制起点。原核生物的染色体和质粒、真核生物的细胞器 DNA 都是环状双链分子，它们都是单复制子，都在一个固定的起点开始复制，复制方向大多数是双向的，少数是单向复制。多数是对称复制，少数是不对称复制（一条链复制后才进行另一条链的复制） 。环状 DNA 的复制眼象 ，称 形复制。真核生物的染色体 DNA 是线形双链分子，含有许多复制起点，因此是多复制子，每个复制子约有 100-200Kbp。人体细胞平均每个染色体含有 1000 个复制子。病毒 D

7、NA 多种多样，环状或线形，双链或单链，但都是单复制子。3、 复制方向定点起始，复制方向大多数是双向的（等速进行或异速进行） ，形成两个复制叉，少数是单向复制，形成一个复制叉。用放射自显影实验判断 DNA 的复制方向及速度低放射性 3H-脱氧胸苷 高放射性 3H-脱氧胸苷a. 单向b. 双向等速 三种结果图形c. 双向异速E.coli.的一个温度敏感株，在 42时，能使 DNA 在完成复制后，不再开始新的复制过程，而在25时 复制功又能能恢复。4、 DNA 的几种复制方式（1） 、 直线双向复制单点，双向，T7多点，双向，真核染色体 DNA（2） 、 型复制：环状双链 DNA，单向或双向（E

8、.coli.）（3） 、 滚环复制：环状单链 DNA，x174（4） 、 D 环复制：线粒体、叶绿体 DNA（5） 、 多复制叉复制：第一轮复制尚未完成，复制起点就开始第二轮的复制。在 E.coli.富营 养时，可采取多复制叉复制方式。E.coli. DNA 的复制最快可达 50Kb/min，完全复制需 40min，富营养时，20min 分裂。而真核染色体要 6-8 小时。三、 与 DNA 复制有关的酶及蛋白质因子目前已发现 30 多种酶及蛋白质因子参与 DNA 复制（一） DNA 的聚合反应和聚合酶DNA 生物合成 5， 3 ， ，化学合成 3， 5 ，1、 DNA 聚合反应必备的条件 DN

9、A 聚合酶 DNA 模板(反转录时用 RNA 模板)引物 (DNA、RNA 或蛋白质) 4 种 dNTP Mg 2+2、 聚合反应过程及特点总反应式：n1dATP DNA pol . dAMPn2dGTP +DNA dGMP DNA+（n1+n2+n3+n4）PPin3dCTP Mg2+ dCMPn4dTTP dTMPP329 图 19-10 P330 图 19-11在链的延长过程中，链的游离 3， -羟基，对进入的脱氧核糖核苷三磷酸 磷原子发生亲核攻击，生成 3， .5， -磷酸二酯键，并脱下焦磷酸。DNA 聚合酶的反应特点： 以 4 种 dNTP 为底物 反应需要接受模板的指导，不能催化游

10、离的 dNTP 的聚合。 反应需有引物 3， -羟基存在 链生长方向 5， 3 ， 产物 DNA 的性质与模板相同3、 由 DNA 聚合酶催化的几种 DNA 聚合类型P331 图 19-12 （1） 发荚环结构：加入单链 DNA 作为模板和引物，3 羟基端回折成引物链。（2） 末端延伸聚合：加入双链 DNA 作为模板和引物，3末端突出作为模板。（3） 分枝型和切口平移型聚合：加入双链 DNA，聚合发生在切口或末端单链区。（4） 环形聚合：加入带引物的环形 DNA 作为模板。4、 E.coli DNA 聚合酶（1） 、 E.coli. DNA pol.I（Kornberg 酶，400 copy/

11、cell）单体酶，分子量 109Kd，含一个 Zn2+，每个细胞中含 400 个 DNA pol.催化活性：5， 3 ， 聚合活性3， 5 ， 外切活性5， 3 ， 外切活性用蛋白水解酶将 DNA pol.部分水解可得：大片段（Klenow ） ，75Kd ，活性：5 ， 3 ， 聚合活性、 3， 5 ， 外切活性。小片段，36Kd，活性：5 ， 3 ， 外切活性（只作用于双链 DNA 的碱基配对部分，切除修复） 。Klenow 片段的用途：a 补齐 DNA 3， 隐缩未端b. 标记 DNA 片段未端ccDNA 合成第二链 dd DNA 测序（2） 、 E.coli. DNA Pol.（100

12、 copy/cell）单体酶，分子量 120Kd催化活性：5 ， 3 ， 聚合(活性很低)3， 5 ， 外切可能在 DNA 的修复中起某中作用。（3） 、 E.coli.DNA pol.（复制酶，10-20 copy/cell）寡聚酶，全酶由 10 种共 22 个亚基组成，、 和 三种亚基组成核心酶。P334 表 10-3DNA pol.是合成新链 DNA 主要的酶，又称复制酶 (Replicase)Pol.的 5， 3， 外切酶活性只作用于单链 DNA。P334 表 19-2 E.coli 三种 DNA 聚合酶的性质比较DNA 聚合酶有 6 个结合位点 模板 DNA 结合位点 引物结合位点

13、引物 3， -OH 位点、反应位点 底物 dNTP 结合位点 5 ， 3 ， 外切位点(pol.没有) 3 ， 5 ， 外切位点(校正)5、 真核生物 DNA 聚合酶P334 表 19-4 真核生物 DNA 聚合酶真核 DNA 聚合酶一般不具备外切活力，可能由另外的酶在 DNA 复制中起校正功能。 DNA 聚合酶 ，多亚基，功能与 E.coli. pol.类似，是真核 DNA 复制酶。 DNA 聚合酶 ，主要在 DNA 损伤的修复中起作用。 DNA 聚合酶 ，从线粒体得到，可能与线粒体 DNA 的复制有关。 DNA 聚合酶 ，特点：有 3， 5 ， 外切活力。（二） 引物酶或 RNA 聚合酶（

14、引发酶）细胞内，DNA 的复制需要引物（DNA 或 RNA） ，引物酶或 RNA 聚合酶可合成 6-10 个碱基的 RNA 引物。DNA 复制为什么要用 RNA 引物？（为什么 DNA 聚合酶要用引物，RNA 聚合酶不需要引物？）P338从模板复制最初几个核酸时，碱基堆集力和氢键都较弱，易发生错配新复制的最初几个核苷酸，没有与模板形成稳定双链，DNA 聚合酶的 5，3 ，校对功能难发挥作用。（三） 解螺旋酶大肠杆菌的解螺旋酶、与 rep 蛋白共同作用，将 DNA 两条链解开。解螺旋酶 I、II、III 沿着模板链的 53方向随着复制叉的前进而移动，而 rep 蛋白则在另一条模板链上沿 35方向

15、移动。（四） DNA 旋转酶属 DNA 拓扑异构酶，可引入负超螺旋，消除复制叉前进时带来的扭曲张力。拓扑异构酶分两类：I 和 II，广泛存在于原核生物和真核生物。拓扑异构酶 I 使 DNA 的一条链发生断裂和再连接，反应无须供给能量，主要集中在活性转录区，与转录有关。拓扑异构酶使 DNA 的两条链同时断裂和再连接，当它引入超螺旋时需要由 ATP 供给能量。分布在染色质骨架蛋白和核基质部，与复制有关。（五） 单链 DNA 结合蛋白（SSB ）复制叉上的解螺旋酶，沿双链 DNA 前进，产生单链区，大量的单链 DNA 结合蛋白与单链区结合，阻止复性和保护单链 DNA 不被核酸酶降解。（六） DNA

16、连接酶（ligase ）连接双链 DNA 上的切口。大肠杆菌连接酶只能在模板上连接 DNA 缺口。T 4DNA ligase 即可连接粘性末端的 DNA，又可连接平齐末端的双链 DNA。E.coli.和其它细菌的 DNA ligase 以 NAD 为能源，动物细胞和噬菌体 DNA ligase 以 ATP 为能源。（七） DNA 复制的拓扑结构P338-339四、 DNA 的半不连续复制P336 图 19-15 DNA 的半不连续复制DNA 聚合酶催化的方向是 5， 3 ， 。前导链：滞后链：1968 年，发现冈崎片段。长度：细菌：1Kb-2Kb，相当于一个顺反子的大小。真核：100-200b

17、p，约等于一个核小体 DNA 的长度。五、 DNA 复制过程（E.coli.）P342 图 19-17 大肠杆菌的复制体结构示意图1、 复制的起始引发：当 DNA 的双螺旋解开后，合成 RNA 引物的过程。引发体：引物合成酶与各种蛋白质因子（dnaB、dnaC、n、nnI）构成的复合体，负责RNA 引物的合成。引发体沿着模板链 53方向移动（与冈崎片段合成的方向正好相反，而与复制叉移动的方向相同） ，移到一定位置上即可引发 RNA 引物的合成。E.coli.DNA 复制原点 ori C，由 245bp 组成，三组 13bp 重复序列（近 5， 端处） ，四组 9 bp 重复序列（另一端处） 。

18、图大肠杆菌复制原点起始复制所需蛋白质：DNaA 在原点处打开双螺旋DNaB 使 DNA 解旋DNaC DNaB 结合在原点所需Hu 刺激起始引物酶（DNaG） 合成 RNA 引物SSB 结合单链 DNARNA 聚合酶 促进 DNaA 活性旋转酶 松驰 DNA 扭曲应力20 个 DnaA 结合在四组 9bp 重复区，形成起始复合物， DNA 环绕此复合物。三组 13bp 重复区依次变性，产生开放型复合物。DnaB（在 DnaC 协助下）与开放复合物结合，进一步解链。2、 DNA 链的延长反应前导链只需要一个 RNA 引物，后随链的每一个冈崎片段都需要一个 RNA 引物，链的延长反应由 DNA p

19、ol.催化。复制体：在 DNA 合成的生长点（既复制叉上）分布着许多与复制有关的酶和辅助因子，它们在 DNA 的模板链形成离散的复合物，彼此配合进行高度精确的复制，称为复制体。复制体沿着复制叉方向前进就合成 DNA。3、 RNA 引物的切除及缺口补齐DNA pol的 5， 3 ， 外切活力，切除 RNA 引物。DNApol的 5， 3 ， 合成活性补齐缺口。4、 DNA 切口的连接DNA ligase，动物、真核由 ATP 供能，原核由 NAD 供能。5、 DNA 合成的终止环状 DNA、线性 DNA，复制叉相遇即终止。 小结： DNA 解螺旋酶解开双链 DNA。 SSB 结合于 DNA 单链

20、。 DNA 旋转酶引入负超螺旋，消除复制叉前进时带来的扭曲张力。 DNA 引物酶(在引发体中)合成 RNA 引物。 DNA pol.在两条新生链上合成 DNA。 DNA pol切除 RNA 引物，并补上 DNA。 DNA ligase 连接一个冈崎片段。DNA 复制过程中，聚合酶对 dTTP 和 dUTP 的分辨能力高,有少量 dUTP 掺入 DNA 链中，此时，U- 糖苷酶、 AP 内切酶、DNA pol、DNA ligase 共同作用，切除尿嘧啶，接上正确的碱基。六、 真核生物 DNA 的复制 P3431、 复制起点和单位真核生物染色体 DNA 是多复制子，有多个复制起点，可以多点起始，分

21、段进行复制。每个复制子大多在 100-200bp 之间，比细菌染色体 DNA（单复制子）小得多。试验证据：5-氟脱氧胞苷标记真核生物 DNA 复制叉移动的速度此原核的慢，如哺乳动物复制叉移动的速度每分钟 1-3Kb，细菌每分钟 5Kb。真核生物染色体全部复制完成前，起点不再从新开始复制。而在快速生长的原核生物中，起点可以连续发动复制。真核生物在快速生长时，可采用更多的复制起点同时复制。如黑腹果蝇，早期胚胎细胞中相邻复制起点的平均距离为 7.9kb，而在培养的成体细胞中，平均距离为 40kb，成体细胞只利用一部分复制起点。2、 复制过程中组蛋白的装配核小体的结构（200bp 左右）在真核生物的复

22、制子上，亲代染色体的核小体被逐个打开，组蛋白以完整的八聚体形式直接转移到子代 DNA 的前导链上，新合成的组蛋白与后随链组装成核小体。因此，DNA 的复制是半保留的，而组蛋白则是全保留的。试验证据：环己酮亚胺抑制组蛋白合成，电子显微镜下观察3、 真核生物 DNA 复制的终止端粒：一段 DNA 序列与蛋白质形成的一种复合体，是真核细胞染色体末端所特有的结构。功能：保证线性 DNA 的完整复制保护染色体末端决定细胞寿命，胚系细胞含端粒酶，体细胞不表达端粒酶。端粒（telomeres ）分布于线性真核染色体未端。酵母端粒约 100bp 的重复序列，形式为：5， （TxGy ）n3 ， (AxCy)

23、n， x 和 y 一般为 14。端粒末端的重复序列，通过端粒酶（telomerase ）将其加到染色体末端。端粒酶含有 RNA 和蛋白质（起 DNA 聚合酶的作用）两种组分， RNA 分子约 159b，含有多个 CyAx 重复序列，RNA 分子用作端粒 TxGy 链合成的模板。端粒酶是一种反转录酶，它只合成与酶自身的 RNA 模板互补的 DNA 片段。人类体细胞的端粒长度，随个体年龄增加而逐渐缩短。细胞每分裂一次，端粒缩短 50-200bp，短至 1-4Kbp 时，细胞就停止分裂。若能重建端粒，则细胞可以永远分裂。恶性肿瘤细胞端酶表达多。杂交图聚合图转位再杂交图进一步聚合图非标准 GG 配对图

24、七、 DNA 复制的调控八、 DNA 复制的真实性杨岐生P144生物体 DNA 复制具有高度真实性，复制 107-1011 碱基对,只有一个错误碱基。碱基对的自由能通常在 4-13KJ/mol，这样的自由能相当于平均参入 100 个核苷酸就可能出现一次错配，仅靠 Watson-Crick 双螺旋的碱基配对原则，突变率将高达 10-2 。1、 DNA 聚合酶对碱基的选择作用酶的被动论：不同的核苷酸在聚合位点停留时间不同，正确的 dNTP 能长时间停留，而参与聚合。DNA 聚合酶能依照模板的核苷酸，选择正确的 dNTP 掺入引物末端。酶积极参与理论：DNA 聚合酶对正确与错误的核苷酸，不仅亲和性不

25、同，而且将它们插入DNA 引物端的速度也不同。动力学校正阅读：在新的磷酸二酯键未形成时，dNTP 结合在酶与模板引物复合物的聚合位点上，DNA 聚合酶能识别正确与错误的 dNTP。DNA 聚合酶对底物的识别作用，DNA 聚合酶有两种底物，一种是 DNA 模板引物，另一种是 dNTP。DNA 聚合酶先识别 DNA 模板和引物的 3， 未端，再识别底物 dNTP，是一种有序的识别过程。2、 3， 5 ， 外切活性的校正阅读E. coli. DNA pol.和 pol.有 3， 5 ， 外切活性，可删除错误插入的核苷酸。缺失 3， 5 ， 外切活性的 E. coli. DNA pol.，催化 DNA

26、 合成时，出现错误的几率增高 5-50倍。因此，3 ， 5 ， 外切活性可以使 DNA 复制的真实性，提高 1-2 个数量级。图3、 影响 DNA 合成真实性的因素高浓度 NMP(如 3， -AMP, 5， -GMP)NMP 竞争酶的 dNTP 结合位点，抑制 3， 5 ， 外切活性。某一种 dNTP 浓度银高,可使引物 3， 末端离开外切活性中心。dNTP 一般与二价阳离子结合成活化形式，Mg 2+为主要的二价阳离子。当用其它二价阳离子（如 Mn2+）代替 Mg2+时，会改变酶的主体结构，影响聚合活性和 3， 3 ， 外切活性。4、 为什么用 RNA 引物从模板复制最初几个核酸时，碱基堆集力

27、和氢键都较弱，易发生错配新复制的最初几个核苷酸，没有与模板形成稳定双链，DNA 聚合酶的 5， 3 ， 校对功能难发挥作用。第二节 DNA 的损伤及修复DNA 的损伤， 罗纪盛P428一些物理化学因子如紫外线、电离辐射和化学诱变剂均可引起 DNA 损伤，破坏其结构与功能。然而在一定条件下，生物机体能使这种损伤得到修复。紫外线可使 DNA 分子中同一条链上两个相邻的胸腺嘧啶碱基之间形成二聚体（TT） ，两个 T以共价键形成环丁烷结构。CT、CC 间也可形成少量二聚体（ CT、CC） ，使复制、转录受阻。P346 图 19-22细胞内具有一系列起修复作用的酶系统，可以除去 DNA 上的损伤，恢复

28、DNA 的双螺旋结构。目前已知有 4 种酶修复系统：光复活、切除修复、重组修复、SOS 反应诱导的修复，后三种不需要光，又称为暗修复。一、 光复活1949 年已发现光复活现象，可见光（最有效 400nm）可激活光复活酶，此酶能分解由于紫外线形成的嘧啶二聚体。高等哺乳动物没有此酶。P347 图 19-23 紫外线损伤的光复活过程A 形成嘧啶二聚体 B. 光复合酶结合于损伤部位 C 酶被可见光激活 D. 修复后释放酶二、 切除修复P348 图 19-24 DNA 损伤的切除修复过程在一系列酶的作用下，将 DNA 分子中受损伤部分切除，并以完整的那一条链为模板，合成出切去部分，DNA 恢复正常结构。

29、I、结构缺陷的修复：（1）核酸内切酶识别 DNA 损伤部位，在其附近将其切开。（2）核酸外切酶切除损伤的 DNA。（3）DNA 聚合酶修复。（4）DNA 连接酶连接。图II、无嘌呤无嘧啶碱基缺陷或错配脱碱基（N- 糖苷酶）：甲基磺酸甲酯可使鸟嘌呤第 7 位氮原子烷基化，活化 糖苷键，造成脱嘌呤作用；酸也能使 DNA 脱嘌呤。DNA 复制时，DNA 聚合酶对 dTTP 和 dUTP 分辨力不高，有少量 dUTP 掺入 DNA 链。细胞中的尿嘧啶-N- 糖苷酶可以切掉尿嘧啶。腺嘌呤脱氨形成次黄嘌呤时也可以被次黄嘌呤-N- 糖苷酶切掉次黄嘌呤。对于无嘌呤无嘧啶的损伤有两种修复方法：（1） AP 核酸

30、内切酶切开，核酸外切酶切除，DNA 聚合酶修复，DNA 连接酶连接。（2） 插入酶插入正确碱基三、 重组修复P349 图 1925 重组修复的过程切除修复发生在 DNA 复制之前，而当 DNA 发动复制时尚未修复的损伤部位，可以先复制，再重组修复。在重组修复过程中，DNA 链的损伤并未除去。重组修复至少需要 4 种酶组分。重组基因 recA 编码一种分子量为 40000 的蛋白质，它具有交换 DNA 链的活力。RecA 蛋白被认为在 DNA 重组和重组修复中均起关键作用。recB、recC 基因分别编码核酸外切酶 V 的两个亚基。此外，修复合成还需要 DNA 聚合酶和连接酶。四、 诱导修复和应

31、急反应（SOS 反应）诱导修复是细胞 DNA 受到严重损伤或 DNA 复制系统受到抑制的紧急情况下，为求得生存而出现的一系列诱导性修复。SOS 反应诱导的修复系统包括避免差错的修复（无差错修复）和倾向差错的修复。避免差错的修复：SOS 反应能诱导光复活切除修复和重组修复中某些关键酶和蛋白质的产生，从而加强光复活切除修复和重组修复的能力，这属于避免差错的修复。倾向差错的修复：SOS 反应还能诱导产生缺乏校对功能的 DNA 聚合酶，它能在 DNA 损伤部位进行复制而避免了死亡，可是却带来了高的突变率，这属于倾向差错的修复。SOS 反应是由 RecA 蛋白和 LexA 阻遏物相互作用引起的。 Rec

32、A 蛋白不仅在同源重组中起重要作用，而且它也是 SOS 反应的最初发动因子。在有单链 DNA 和 ATP 存在时，RecA 蛋白被激活而表现出蛋白水解酶的活力，它能分解 噬菌体的阻遏蛋白和 LexA 蛋白。LexA 蛋白（22Kd）许多基因的阻遏物，当它被 RecA 的蛋白水解酶分解后就可以使一系列基因得到表达其中包括紫外线损伤的修复基因 uvrA、uvrB、uvrC（分别编码核酸内切酶的亚基）以及 recA 和lexA 基因本身，还有单链结合蛋白基因 ssb，与 噬菌体 DNA 整合有关的基因 himA、与诱变作用有关的基因 umuDC，与细胞分裂有关的基因 sulA，ruv，和 lon，以

33、及一些功能不清楚的基因dinA，B ，D，F 等。SOS 反应广泛存在于原核生物和真核生物，它是生物在极为不利的环境中求得生存的一种基本功能。然而癌变有可能也是通过 SOS 反应造成的，因为能引起 SOS 反应的作用剂通常都具有致癌作用，如 X-射线，紫外线，烷化剂，黄曲霉素等，而某些不能致癌的诱变剂并不引起 SOS 反应，如 5-溴尿嘧啶。目前，有关致癌物的一些简便检测方法就是根据 SOS 反应原理而设计的，既测定细菌的 SOS 反应。第三节 RNA 指导的 DNA 合成（反转录）反转录（reverse transcription）：以 RNA 为模板，合成 DNA。与通常转录过程中遗传信息

34、流从 DNA 到 RNA 的方向相反。1970 年，Temin 和 Baltimore 分别从致癌 RNA 病毒（劳氏肉瘤病毒和鼠白血病病毒）中发现发反转录酶。致癌 RNA 病毒是一大类能引起鸟类、哺乳类等动物白血病、肉瘤以及其它肿瘤的病毒。这类病毒侵染细胞后并不引起细胞死亡，却可以使细胞发生恶性转化。经过改造后可以作为基因治疗的载体。放线菌素 D（抑制以 DNA 为模板的反应，复制和转录）能抑制致癌 RNA 病毒的复制，可见致癌 RNA 病毒的复制过程必然涉及 DNA。Bader 用嘌呤霉素（puromycin）来抑制静止细胞蛋白质的合成，发现这种细胞仍能感染劳氏肉瘤病毒（RSV） ，证实反

35、转录酶是由反转录病毒带入细胞的，而不是感染后在宿主细胞中新合成的。一、 反转录酶由一个 亚基和一个 亚基组成，含有 Zn2+，具有三种酶活力。（1）RNA 指导的 DNA 聚合酶活力（以 RNA 为模板，合成一条互补的 DNA，形成 RNADNA 杂种分子） 。（2）RNase H 酶活力，水解 RNADNA 杂种分子中的 RNA，可沿 35 和 53 两个方向起外切酶作用。（3）DNA 指导的 DNA 聚合酶活力。模板：RNA 或 DNA以自身病毒类型的 RNA 为模板时，该酶的反转录活力最大，但是带有适当引物的任何种类的 RNA 都能作为合成 DNA 的模板。引物：RNA 或 DNA底物：

36、dNTP二价阳离子：Mg 2+或 Mn2+真核 mRNA3端有 polyA，加入 oligo dT 后，可以作为反转录酶的模板，合成 cDNA。二、 病毒 RNA 的反转录过程所有已知的致癌 RNA 病毒都含有反转录酶，因此被称为反转录病毒（retrovirus） ，反转录病毒的复制需要经过一个 DNA 中间体（前病毒） 。1、 反转录病毒的基因组结构P353 图 19-27（1） 反转录病毒基因组通常由两条相同的（+）RNA 链组成。5端附近区域以氢键结合在一起，全长 7-10Kb。（2） 每一条 RNA 链的两端具有相同的序列，形成正向重复序列。（3） 5端有帽子结构，3端有 polyA，

37、与真核 mRNA 相似。（4） 5端带有 1 分子的宿主 tRNA，作为反转录时的引物。某些鸟类反转录病毒携带的是 tRNAtrp，鼠类是 tRNApro2、 反转录过程。当致癌 RNA 病毒侵染宿主细胞时，病毒 RNA 及反转录酶一起进入宿主细胞，病毒自身带入的反转录酶使 RNA 反转录成双链 DNA。（1） 以病毒（+）RNA 为模板，合成互补的（-）DNA。（2） 切除 RNADNA 杂种分子中的 RNA。（3） 以（-）DNA 链为模板，合成（+ ）DNA 链，最后形成两端带有 LTR（长末端重复序列）的双链 DNA。反转录病毒只有整合到宿主染色体 DNA 后才能被转录，转录产物经拼接

38、可以产生不同的病毒 mRNA。LTR（长末端重复序列）对前病毒 DNA 整合到宿主染色体 DNA 以及整合后的转录均起着重要作用。反转录病毒合成的过程：图缺口的模板（基因组）RNA，在 U3 旁生成一个正链 DNA 的合成 RNA 的引物，而其余的模板RNA 被降解。正链 DNA 合成开始，复制。图3、 反转录病毒的生活周期P354 图 19-29（1） 病毒粒子侵染细胞，病毒 RNA 和反转录酶一起进入细胞。（2） RNA 被反转录成双链 DNA（前病毒） ，环化，进入细胞核。（3） 反转录病毒的 DNA 整合到宿主染色体 DNA 中。（4） 前病毒 DNA 进行复制，转录出功能基因、基因组

39、 RNA 和病毒蛋白。（5） 基因组 RNA 和病毒蛋白在胞质中组装成新病毒粒子，转移到质膜，通过出芽方式释放新病毒粒子。三、 反转录的生物学意义。1反转录酶存在于所有致癌 RNA 病毒中，它的存在与 RNA 病毒引起细胞恶性转化有关。2艾滋病毒（AIDS）人类免疫缺陷病毒（HIV） ，也是一种反转录病毒，主要感染 T4 淋巴细胞和 B 淋巴细胞。病毒粒子直径 100nm，球状，粒子外包被两层脂质质膜，膜上有糖蛋白（ gp120、gp41） ，另有两层衣壳蛋白 p24、p18。HIV 基因组由两条单链正链 RNA 组成，每个链长 9.7kb，RNA 5， 端有帽子结构，3端有PolyA，链上结

40、合有反转录酶。3乙肝病毒大蛋白、中蛋白、主蛋白（表面抗原） 核心抗原 双链环状 DNA 乙肝病毒与反转录病毒的区别：P355 4、真核生物正常细胞内也存在反转录过程真核生物的谈色体基因组中存在为数众多的逆假基因和逆基因。逆假基因：无启动子和内含子，但有 polyA 的残基，推测是由 mRNA 反转录后整合到基因组中去的。逆基因：具有启动子和转录功能，无内含子。可能是由于 mRNA 反转录后刚好整合到启动子的下游处，或者是带启动子的 RNA 序列反转录后整合到基因组中第四节 DNA 合成技术一、 cDNA 合成1、 cDNA 文库的构建cDNA：以 mRNA 为模板，用反转录酶合成第一链，去除

41、mRNA，合成的第二链。cDNA 文库是获得真核结构基因的最好方法，成熟的 mRNA 无内含子。（1） 、 真核 mRNA 的分离纯化特点：含量少，不均一，表达具有发育阶段性和组织特异性。总 RNA： rRNA 8085%mRNA 15%tRNA 及其它小分子 RNA 1015%不均一：在 15%的 mRNA 中，有 1000030000 种 mRNA。分离、纯化：用 Oligo dT 纤维素柱（亲和层析法） ，加入总 RNA，高盐洗脱，先流出非 mRNA，降低盐浓度，加入 Oligo dA 竞争，可洗出 mRNA 混合物。免疫法可分离特定的 mRNA。（2） 、 cDNA 合成（反转录酶）A

42、. 自身引物法（S1 核酸酶降解法）图Oligo(dT)15-18 个核苷酸mRNA5端序列有丢失。B. 取代合成法（较常用）图Oliyo（dT）与 mRNA3端 AAA 杂交作为引物，合成第一条 DNA 链。RNaseH 在 mRNA 上产生多个切口。DNA pol.切口平移，DNA ligase 连接，合成出第二条 DNA 链。T4DNA pol.切去端头的 RNA-DNA 杂交链。C. 引物合成法可以合成全长 cDNA，mRNA 的 5端不丢失。图（3） 、 cDNA 与载体连接（4） 、 重组体的转化（5） 、 扩增、保存2、 获取特定 mRNA 的 cDNA（1）免疫法分离特定的 m

43、RNA（2）PCR 法二、 PCR 技术（聚合酶链式反应）Polymerase chain Reaction以目的基因或 DNA 片段为模板，在引物介导及 Taq DNA 聚合酶催化下，在体外用核苷酸大量合成目的基因或 DNA 片段。它能快速、专一地扩增所希望得到的目的基因或 DNA 片段。1、 反应物（1）模板单、双链 DNA 或 cDNA 都可以作为 PCR 的模板，若以 RNA 为起始材料，则须经反转录，获得第一条 cDNA 后才能用于 PCR。（2）Taq DNA 聚合酶DNA 聚合酶是进行 PCR 扩增的关键，从水生栖热菌（Thermus aquaticns VT-1）分离出来。Taq DNA 聚合酶有很好的热稳定性，92.5处理 130min，仍保留 50%的酶活性，在 74活性最高，错误掺入核苷酸的比率为 1/7500。（3）引物引物是决定 PCR 结果的关键，它由寡核苷酸组成，15-30 个 b（4）核苷酸 dNTPdNTP 的浓度 50-200umul/L。（5）镁离子 Mg2+2、 PCR 原理图变性 95 复性 55 延伸 72