1、第34章 DNA的复制和修复,一、DNA复制,（一）DNA的半保留复制 亲代DNA分子每一条链各自作为模板，合 成一条互补链，新合成的两条链中一条是旧链，一条为新链。 1958年Matthew Messelson and Franklin Stahl 用令人信服的实验证明了DNA的半保留复制机制（15N标记实验） 半保留复制的意义何在？,DNA复制模型,DNA半保留复制,P407,15N,14N,（二）复制的起点和方式,1、复制子：基因组能独立进行复制的单位称复制子。 每个复制子都有控制复制起始的起点和复制终止的终点。大肠杆菌复制有一个固定的起点，向两个方向进行复制叉。真核生物DNA是线性双链
2、分子，含多个复制起点，是多复制子。2、DNA复制的几种方式：形原核生物直线双向形真核生物滚环式噬菌体X174D型线粒体,大肠杆菌DNA的复制 复制眼形成形结构,DNA复制方式,P411图34-8,形双向,直线双向形,滚动环,D环,起点,起点,噬菌体X174： 共价闭环（复制型）,（二）DNA聚合反应的有关酶,1、DNA聚合反应和聚合酶 DNA聚合酶：首先在大肠杆菌发现。 DNA聚合酶是DNA合成中起主要作用的酶，催化总反应：(dNMP)n + dNTP (dNMP)n+1 + ppi DNA 延伸的DNA DNA聚合酶反应特点： （1）以四种dNTP为底物； （2）反应需要接受模板指导； （3
3、）需有引物3-OH存有（引物链）； （4）要求有镁离子存在； （5）DNA链的生长方向为5 3； （6）产物DNA与模板互补。,DNA的模板链和生长链,亲电攻击,2、大肠杆菌DNA聚合酶,有5种，后两种1999年才发现。 （1）DNA聚合酶I (DNA Polymerase I、Pol I)DNA聚合酶催化DNA合成的共同特点DNA聚合酶I具有 5 3聚合活性（低）3 5外切酶活性(校阅作用)5 3外切酶活性（RNA引物，嘧啶二聚体的切除） （2）DNA聚合酶II (DNA Polymerase II Pol II)DNA聚合酶II具有 5 3聚合活性（低）3 5外切酶活性(校阅作用)*修复酶
4、,DNA 聚合酶I的35和5 3的外切酶活性,DNA聚合酶I一条多肽上的三种酶活性,（3）DNA聚合酶III (DNA Polymerase Pol III)DNA聚合酶III具有 5 3聚合活性（高）3 5外切酶活性(校阅作用)*其催化DNA的合成速度与生长速度一致，是真正的，主要的DNA复制酶。 （4）DNA聚合酶IV和V：DNA严重损伤时诱导产生，涉及DNA错误倾向复制。,三种DNA聚合酶的比较,P416表34-2,大肠杆菌DNA聚合酶III的构成,全酶由10种亚基组成： 、 含有锌原子 ：53聚合活性 ：3 5核酸外切酶活性，具有保真作用 ：起组建核心酶作用 核心酶： ：促使核心酶二聚
5、化作用 ：两个亚基形成滑动夹子，提高酶的持续合成能力 （）：帮助夹住DNA，称夹子装置器,大肠杆菌PolIII全酶的结构示意图(V型),聚合活性,校对功能,组建核心酶,每两个亚基形成滑动夹子， 提高酶的持续合成能力,亚基与模板的结合,亚基形成一个围绕DNA的环状钳,3、DNA 连接酶,DNA聚合酶只能延长，不能连接； DNA连接酶具有连接切口及粘性末 端或平端功能 能量来源：原核：NAD真核：ATP,（四）冈崎片段和DNA半不连续复制1、前导链 (Leading Strand)后随链 (Lagging Strand)2、冈崎片段：约1000-2000个Nt （原核）100-200（真核） 3、
6、半不连续复制:DNA复制时，一条链是连续的，另一条是不连续的，其先合成一些冈崎片段，然后再连接起来构成大的DNA片段，称为半不连续复制。 引物？（一小段RNA，引物合成酶）,（五）DNA复制的拓扑性质 1、拓扑异构酶 (Topoisomerase) TopoI型：使DNA的一条链发生断裂和再连接。TopoII型：能使DNA两条链同时断裂和再连接。可引入负超螺旋，消除复制叉前进进带来的扭曲张力，从而促进双链解开。需ATP。TopoIII型：与I型相似，功能相似。 2、解螺旋酶 (Helicase)：将DNA双链解开。 3、SSB蛋白(Single Strand Binding Protein)：
7、稳定DNA解开的单链，阻止复性和保护单链部分不被核酸酶降解。,（六）DNA复制的过程（原核） 大肠杆菌染色体复制的三个过程: 起始 延伸 终止 1、起始（1）大肠杆菌复制起点核苷酸序列特征：起始点称为ori C,由245个bp构成，关键在于两组短的重复：三个13 bp和四个9 bp（2）DnaA蛋白是复制起始的关键蛋白：四个9bp序列为其结合位点，约20-40 个DnaA结合于此，DNA缠于其上，形成起始复合物。P422图34-21（3） DnaB在DnaC蛋白帮助下结合于解链区，沿5 3方向移动，解开DNA双螺旋，解链还需拓扑异构酶II和SSB帮助。 DnaB 还能活化引物合成酶。,大肠杆菌
8、复制起点的核苷酸序列特征,13bp,9bp,2、延伸：两条链合成均由DNA聚合酶III催化。（1）前导链合成：先由DnaG（引物合成酶）合成一段RNA引物（10-60Nt），然后与复制叉同步，一直连续合成。（2）后随链合成：需不断合成冈崎片段的RNA引物，DNA聚合酶III不断与模板脱开，然后在新的位置又与模板结合。引发体（Primosome)：解螺旋酶，引物合成酶（DnaG ），RNA引物。 3、终止：复制在终止区停止，该区含多个约22bp的终止子。,DNA复制叉上的蛋白质（酶）,大肠杆菌复制体结构示意图,SSB,RNA引物,解螺旋酶,冈崎片段,引物合成酶,前导链上DNA聚合酶,滞后链上DN
9、A聚合酶,大肠杆菌复制体结构示意图,（七）真核生物DNA的复制,1、真核生物有多个复制起点。2、复制速度比原核慢，基因组比原核生大。 但多个复制起点分段复制。3、5种DNA聚合酶：分别为聚合酶：， ，和。复制由DNA聚合酶， 共同完成， 其中 有引物合成能力， 具有校正功能。 DNA聚合酶相当于原核的DNA聚合酶I，具 有修复功能。 P425表34-5 *具有端粒酶合成DNA端粒结构,二、DNA损伤修复,DNA损伤原因： 1、化学诱变因素烷化剂、亚硝酸、嵌入剂 2、物理诱变因素电离辐射(UV、X射线、射线) ； 链断裂、交联、环打开 3、紫外照射引起嘧啶二聚体的形成 修复机制：1、错配修复 ：
10、甲基化作用，核酸内、外切酶2、直接修复：光复活(光照射激活光复活酶)3、切除修复：（1）通过N-糖苷酶：识别并切除错误碱基（2）通过核酸酶切除酶：识别切除错误核苷酸片段4、重组修复5、SOS修复,（一）错配修复,1、DNA在复制过程中发生错配的新合成链可被纠正，存在着错配修复系统区分新旧链。2、Dam甲基化酶可使GATC序列中腺嘌呤N6位甲基化，复制后DNA在短期内（数分钟）为半甲基化的GATC，一旦发现错配碱基，即将未甲基化的链切去，并进行修复合成。3、参与错配修复的蛋白约12种多，有，核酸内切酶，核酸外切酶，解螺旋酶，SSB等。4、切除的链可长达1000个核苷酸以上，直至切去错配碱基。*甲
11、基化作用，核酸内、外切酶,甲基化与错配修复（正常情况）,甲基化指导的错配修复,MutS和MutL结合于错配 碱基部位，沿DNA双链 移动，遇到GATC序列停 止。MutH结合于MutS和MutL 复合体上，在未甲基化链 GATC位点5或3端切开。由核酸外切酶切去错配碱 基。,甲基化指导的错配修复,切开位置在错配碱基5侧,切开位置在错配 碱基3侧,（二）直接修复,1、紫外线照射使DNA分子中同一条链相邻间T和T之间形成二聚体（TT）（见下一张）（其它嘧啶二聚体少），影响双螺旋结构，阻碍复制和转录。2、其修复作用：（1）光修复：可见光照射，激活光复合酶进行修复作用（高等哺乳类无此酶）。（2）暗修复
12、：高等动物：切除含嘧啶二聚体的核酸链，然后修复。*光照射激活光复活酶,UV照射形成嘧啶（TT最常见）二聚体,光修复,（三）切除修复（复制前）,1、切除修复：指在一系列酶的作用下，将DNA分子中受损部分切除，并以完整的那条链为模板，填补缺口，使DNA恢复正常结构。2、损伤形式： UMP的渗入 AP位点的产生烷化剂修饰碱基 嘧啶二聚体产生 3、切除修复过程 由核酸内切酶在损伤部位一侧切开切口，再由核酸外切酶将损伤位点附近DNA切除，由DNA聚合酶I（真核为DNA聚合酶E）修复和连接酶连接。,核苷酸切除酶,核苷酸片段损伤,DNA聚合酶I,（四）重组修复（复制后修复）,1、先复制，后修复。 2、复制时
13、跳过损伤部位，子代链在该部位留下缺口。 3、遗传信息有缺损的DNA子链通过遗传重组加以弥补，即从同源DNA母链上将相应核苷酸序列片段移至子链缺口处，然后再合成补上母链空缺，称为重组修复。P430图34-30,（五）SOS修复（应急反应）,1、SOS反应是细胞DNA受到损伤或复制系统受抑制情况下，为求生存而出现的应急效应。 2、SOS反应诱导的修复系统包括：（1）避免差错的修复：即诱导切除修复和重组修复中某些关键的酶和蛋白产生，加强修复能力。（2）易产生差错修复：即诱导产生缺乏校对的DNA聚合酶IV和V，其缺乏3核酸外切酶校对功能，于是DNA链损伤部位即使出现不配对碱基，复制继续进行，增加了错配
14、存在机会。 3、SOS反应导致两个结果：DNA修复和物种变异。这时变异好或坏将会被自然选择。,三、DNA突变,（一）突变的类型 1、碱基对的置换 转换：两种嘌呤或两种嘧啶之间的互换 颠换：嘌呤和嘧啶之间的互换 错义突变：三联体密码子发生突变导致蛋白质中原氨基酸被另一氨基酸代替 无义突变：氨基酸密码子变为终止密码子，导致翻译提前结束 同义突变：三联体密码子虽发生突变，但氨基酸不变 2、移码突变 由于一个或多个非三倍数的核苷酸对插入或缺失，使编码区该位点后的三联体密码子阅读框架改变，导致后面的氨基酸发生变化,（二）诱变剂的作用 自发突变：自然条件下发生突变。 诱变：在物理化学因子作用下碱基发生变化
15、。 1、碱基类似物：均引起转换 5-溴尿嘧啶（BU）：T的类似物，酮式时与A配对；烯醇式时与G配对，引起A-T与G-C的转变 2-氨基嘌呤（AP）：A类似物，正常状态与T配对，亚氨基状态与C配对,2、碱基的修饰剂 亚硝酸 羟胺 烷化剂 3、嵌入染料 吖啶橙 溴化乙锭 插入DNA碱基对之间，导致新合成的链发生核苷酸插入或缺失，造成移码突变 4、紫外线和电离辐射,习题,岗崎片段 复制体 复制叉 半保留复制 暗修复 有意义链 1958年Meselson和Stahl利用15N标记大肠杆菌DNA的实验首先证明了下哪一种机制？（D） A DNA能被复制 B DNA基因可转录为mRNA C DNA基因可表达
16、为蛋白质 D DNA的半保留复制机制 E DNA的全保留复制机制 *DNA复制的延长过程中，会有下列现象 ABC A 生成磷酸二酯键 B生成岗崎片段 C 合成RNA引物 D 核糖体聚合 下列关于原核生物与真核生物DNA复制中错误叙述是： C A 两者都需要RNA引物 B 两者都要合成岗崎片段 C 两者都有许多同时复制的起始点 D 两者的合成方向都是53 E 两者的复制都是半不连续的,习题,端粒酶是属于： B A 限制性内切酶 B DNA聚合酶 C RNA聚合酶 D 肽基转移酶 *DNA复制酶系中的多功能酶有： C, D A. 真核细胞DNA聚和酶 B. 真核细胞DNA聚和酶r C. 原核细胞D
17、NA聚和酶I D. 原核细胞DNA聚和酶3 *有关冈崎片段下列描写哪项是对的？（C D ） A是因为DNA复制速度太快而产生 B由于复制中有缠绕打结而生成 C每个岗崎片段约含1000-2000个核苷酸 D在滞后链中产生 E复制完成后，岗崎片段被水解 在DNA损伤切除修复中，有关酶的作用顺序是：(B ) A DNA连接酶- DNA聚合酶-核酸内切酶-外切核酸酶 B 核酸内切酶-外切核酸酶- DNA聚合酶- DNA连接酶 C DNA聚合酶- DNA连接酶-外切核酸酶-核酸内切酶 D 核酸内切酶- DNA聚合酶- DNA连接酶-外切核酸酶 E DNA连接酶-核酸内切酶- DNA聚合酶-外切核酸酶,习
18、题,复制中，一个岗崎片段延长至第二个片段引物前方，引物被水解后（ B ） P419 A、两片段间出现待连接缺口 B、引物原占据的位置留下缺口 C、向两个方向双向复制至中点汇合 D、剩下即DNA链的5-磷酸和3-OH末端 1、在E.coli细胞和真核细胞中都是由DNA聚合酶切除RNA引物。 2、原核细胞的每一条染色体只有一个复制起点，而真核细胞的每一条染色体有多个复制起点。() 3、双链DNA经过一次复制形成的子代DNA分子中，有些不含亲代核苷酸链。（） 4、引物是指DNA复制时所需要的一小段RNA，催化引物合成的引物酶是一种特殊的DNA聚合酶。 （） #如果大肠杆菌的DNA长度为1100m，复制一代大约需要40分钟通过一个复制叉完成，求复制体的链增长速度和DNA螺旋的旋转速度是多少（以每分钟的转数表示）？,习题,#组织培养产生的哺乳动物细胞系的细胞中，每个DNA长1.2m，这些细胞生长周期中的S期(DNA合成期)长达5小时，如果这种细胞DNA延长的速度与大肠杆菌相同，即16m/min，那么染色体复制时需要有多少复制叉同时运转？1、DNA复制的精确性是通过怎样的机制实现的？ 2、简述参加原核（以大肠杆菌为例）DNA复制过程中所需要的主要蛋白质及其酶类。 3、比较原核生物与真核生物DNA复制的有哪些异同点？复制起点，酶，端粒合成,
