1、 中华ICS 67.060B 20中 华 人 民 共 和 国 粮 食 行 业 标 准LS/T2013粮油检验 粮食游离氨基酸总量的测定Inspection of Grain and Oils-The Method for Determination of Free Amino Acids Content in Grains（征求意见稿）-发布 -实施中华人民共和国国家质量监督检验检疫总局中国国家标准化管理委员会 发布LS/T 2013I前 言本标准由国家粮食局首次提出。本标准由全国粮油标准化技术委员会归口。本标准主要起草单位：国家粮食局科学研究院本标准主要起草人：李兴军，陆晖，姜平，张东LS/
2、T 20132粮食检验 粮食游离氨基酸总量的测定1 范围本标准适用于小麦、玉米、糙米、大豆等粮食及其加工产品中游离氨基酸总量的测定。2 规范性引用文件下列标准中的条款通过本标准的引用而成为本标准的条款。凡是注日期的引用文件，其随后所有的修改单（不包括勘误的内容）或修订版均不适用于本标准，然而，鼓励根据本标准达成协议的各方研究可使用这些文件的最新版本。凡是不注日期的引用文件，其最新版本适用于本标准。GB/T 5497-85 粮食、油料检验 水分测定法3 原理采用无氨蒸馏水提取粮食中的游离 -氨基酸。加入水合茚三酮，在高温条件下，与游离 -氨基酸中的氨基反应，产生二酮茚-二酮茚胺等蓝紫色化合物，在
3、一定范围内，其颜色的深浅与游离氨基酸的含量成正比。用分光光度计，在波长 570 nm 下，测定反应产物的吸光值，计算游离氨基酸的含量。4 仪器设备4.1 电子天平：感量为 0.001 g、0.00001 g；4.2 容量瓶：100 mL、1L；4.3 超声波清洗器；4.4 10 mL 具螺旋盖的玻璃刻度试管；4.5 不锈钢试管架，3 排 30 孔；4.6 移液枪，200 L、1 mL、5 mL；4.7 涡旋仪；4.8 电热恒温水浴锅。4.9 紫外可见分光光度计；4.10 砻谷机；4.11 旋风磨： 带 40 目筛；4.12 离心管：50 mL，若干；4.13 小型高速冷冻离心机；4.14 通风
4、橱。4.15 震荡摇床；4.16 研钵：直径 8 cm；4.17 定量滤纸；5 试剂本标准所用水均为重蒸馏水，除特殊规定外，所用试剂均为分析纯。5.1 无氨蒸馏水；5.2 异丙醇；5.3 水合茚三酮，C 9H4O3H2O；5.4 95%乙醇；5.5 硼氢化钠（NaBH 4）；5.6 乙酸钠，CHCOONa3H 2O，分子量 136.08；5.7 冰乙酸；LS/T 201335.8 L-亮氨酸，含量 98.5%以上；5.9 10%异丙醇水溶液：10 mL 异丙醇（5.2）溶于蒸馏水（5.1），并定容至 100 mL。5.10 抗坏血酸；5.11 己烷；5.12 3%茚三酮试剂：称取 3 g 水合
5、茚三酮（5.3），用 95%乙醇（5.4）溶解，移入 100 mL 容量瓶（4.2），定容至刻度，贮于棕色瓶中，保存在 4 冰箱。茚三酮试剂保存时间如超过 1 个月，可加入0.02% NaBH4（ 5.5）。5.13 乙酸-乙酸钠缓冲液（pH 5.4）：称取 360 g 乙酸钠（ 5.6），溶于约 300 mL 无氨蒸馏水（5.1）中，加入 66.67 mL 冰乙酸（5.7）后，用无氨蒸馏水（5.1）定容至 1 L，置于超声波清洗机（4.3），超声10 min，除去气泡。5.14 标准氨基酸溶液（1 mol/mL 或 14 g氨基态氮）：精确称取在 80下烘干的亮氨酸（5.8）13.1 mg，
6、溶于 10%异丙醇水溶液（5.9）中，移入 100 mL 容量瓶（4.2）中，用 10%异丙醇水溶液（5.9）定容至刻度，摇匀，置于冰箱中保存。5.15 0.1%抗坏血酸：称取 50 mg 抗坏血酸（5.10），溶于 50 mL 无氨蒸馏水（5.1）中，随时用随时配。6 操作步骤6.1 标准曲线的制作：取 10 mL 带螺旋盖的玻璃刻度试管（4.4）12 支，分成两组置于试管架（4.5）上，编号，按表 1 用移液枪（4.6）加入各种试剂，拧上盖子。试管在涡旋仪（4.7）上混匀后，连同试管架（4.5）置于 85水浴锅（4.8）中，加热 12 min 取出，放在冷水中迅速冷却后，立即于每管中加入
7、95%乙醇（5.4）5 mL，拧上盖子，将试管放在涡旋仪（4.7）上剧烈混匀，使加热时形成的红色产物被空气中的氧所氧化而褪色，此时溶液呈蓝紫色。定容至 10 mL 后，在紫外可见分光度计（4.9）上于 570 nm 波长下测其吸光值，以空白管为参比。以标准氨基酸浓度为横坐标，吸光值为纵坐标，绘制标准曲线，求出直线方程。表 1 标准曲线制作编号 1 2 3 4 5 61 mol/mL 标准亮氨酸溶液（mL）0 0.1 0.2 0.3 0.4 0.5无氨蒸馏水（mL）0.5 0.4 0.3 0.2 0.1 0.0醋酸缓冲液（mL）0.5 0.5 0.5 0.5 0.5 0.53%茚三酮溶液（mL）
8、0.5 0.5 0.5 0.5 0.5 0.50.1%抗坏血酸（L）50 50 50 50 50 50每管氨基酸浓度（mol）0 0.2 0.4 0.6 0.8 1.06.2 样品制备：谷物、油料及其加工产品在旋风磨（4.10）磨成粉后，称取谷物 1.0 g 粉样，或大豆0.5g 粉样于 50 mL 塑料离心管（4.11）中，加入 15 mL 己烷（5.1），拧上盖子，充分涡旋。在常温下，放置在震荡摇床（4.13）中震荡 3 h。对含油量高的大豆样品可用己烷（5.11）浸泡过夜脱脂。在冷冻离心机（4.14）4 、 6000 转/min (rpm)下，离心 10 min，吸走己烷（5.11）层，
9、沉淀放在通风橱（4.15）中，挥发除掉己烷（5.11）。转入研钵（4.16）中，用 5.0 mL 无氨蒸馏水（5.1）分两次洗涤离心管（4.12），一并转入研钵（4.16）中，在室温下充分研磨，再用 5.0 mL 无氨蒸馏水（5.1）分两次洗涤研钵（4.16）并转入离心管（4.12）中， 在 4 低温冷冻离心机（4.14）于 6000 LS/T 20134rpm 下，离心 10 min，上清液为游离氨基酸提取液。含油量高的大豆样品离心后的上清液含有悬浮物，可用定量滤纸（4.17）进行过滤。6.3 游离氨基酸测定：吸取 0.5 mL 样品提取液于 10 mL 带塞刻度试管（4.4）中，依次加入无
10、氨蒸馏水（5.1）0.5 mL、乙酸-乙酸钠缓冲液 （5.13）0.5 mL、3% 茚三酮（5.14）0.5 mL、0.1%抗坏血酸（5.15）0.05 mL，混匀，拧上盖子。置于 85水浴中反应 12 min，冷却后于每管中加入 95%乙醇（5.4）5 mL，拧上盖子，将试管放在涡旋仪（4.7）上剧烈混匀，定容至 10 mL，在紫外可见分光光度计（4.9）570 nm 波长下测其吸光值。茚三酮与氨基酸反应所生成的颜色在 1.5 h 内保持稳定，稀释后应尽快进行比色测定。根据吸光值查标准曲线（或用回归方程计算），即可求出提取液中氨基酸的浓度。6.4 样品含水率测定：按照GB/T 5497-85
11、的方法进行测定。7 计算游离氨基酸含量(g 氨基态氮/g 干重) )1(4MWVC式中：C-由标准曲线查得 0.5 mL 试样中氨基酸的微摩尔数（mol ）；V-样品提取液经稀释后的总体积（mL ）；14-氮的摩尔质量（g/mol）W-样品质量（g）；M-样品含水率（% 湿基）。8 精密度在重复条件下，两次独立试验测定结果的绝对差值不应超过算术平均值的 20%。即采用下列公式计算精密度。精密度（ %） =|测试值 平均 值 |平均 值 1009 测试报告测试报告应详细说明：包括鉴定样品所必需的全部信息；与测试相关的测定方法； 采用的测定方法；所使用的主要仪器设备；本标准中未规定的或可能影响实验
12、结果的任何操作；测试结果。LS/T 20135钢 质 海 船 入 级 规 范中华人民共和国粮食行业标准粮油检验 粮食游离氨基酸总量的测定编 制 说 明（征求意见稿）国家粮食局科学研究院2013 年 7 月LS/T 201361任务来源受全国粮油标准化技术委员会粮食及制品技术工作组的委托，国家粮食局科学研究院承担了 2012 年粮食行业标准粮食游离氨基酸总量的测定 The method for determination of free amino acids content in grains 制定任务。目前，已完成了该粮食行业标准的征求意见稿。2. 项目的目的和意义氨基酸是组成蛋白质的基本单
13、位，也是蛋白质的分解产物。种子内氨基酸是贮藏型的，或是合成的产物，或是蛋白质分解后的产物，是种子内氮代谢动态变化的指标之一。Fox 和 Mulvihill 1981 年在“小麦、面粉及面包中的酶”综述中指出，优质小麦面粉包含有 -淀粉酶、-淀粉酶、蛋白酶、脂肪酶、脂氧合酶、多酚氧化酶、过氧化物酶、过氧化氢酶、植酸酶等 1，这些酶在小麦及产品处理技术上有重要意义。大多这些酶在不发芽的小麦中以低水平存在，完整籽粒的小麦含水率低，使得小麦和面粉储藏期间这些酶失活，当加入水后它们就被活化。它们对面粉、面包及其他加工品的功能和营养属性方面起重要作用。一旦小麦发芽，上述大多数酶浓度增加，它们的活性也改变了
14、面粉的功能特性，对烘焙不利。Preston 2采用琼脂糖-苯丙氨酸（Sepharose- phenylalanine）纯化了发芽和不发芽小麦的蛋白酶。当血红素（Hemoglobin）作为外切蛋白酶底物，偶氮酪蛋白（Azocasein）作为内切蛋白酶底物，不发芽小麦含有一个尖峰的内切蛋白酶活性，而外切蛋白酶活性是一个宽的、带肩的峰。发芽小麦则具有外切蛋白酶活性通常类似的洗脱峰，但内切蛋白酶活性显著增加，能够分辨为 2 个峰，二者洗脱体积不同于不发芽小麦。他把发芽小麦内切和外切蛋白酶活性纯化了 1020 倍。另外，面粉的乙酸提取物，能够从面粉本身蛋白和血红素底物产生游离氨基酸和 68 个氨基酸的多
15、肽，表明存在外切蛋白酶和内切蛋白酶活性 3。上述这些结果表明，小麦籽粒及面粉中存在的蛋白酶(包括外切和内切酶)、肽酶是游离氨基酸形成的可能原因。于是我们提出，粮食中游离氨基酸总量可以作为蛋白质营养品质评价的重要指标之一。在小麦萌动（发芽）时，蛋白酶活性增加了 17 倍，对面粉的烘焙品质具有重要影响5。小麦外切蛋白酶活性，以血红素为底物进行活性测定，它随发芽变化很小。而内切蛋白酶活性，以偶氮酪蛋白为底物进行测定活性，它在发芽状况下贡献蛋白酶活性增加的大部分 6。磺基水杨酸可溶氮的显著增加，是由于游离氨基酸，而不是肽，表明不发芽小麦存在的外切蛋白酶数量足以水解发芽小麦产生的内切蛋白酶作用释放的肽。
16、LS/T 20137由于我国收购的谷物、大豆种类类型及品种多而复杂，干燥或入仓过程易产生不完善粒、裂纹及破碎粒，储藏过程存在水分迁移现象（如冬夏季节分别在小麦仓芯顶部和底部水分升高了 2%） ，而且储存时间较发达国家时间长，所以有必要分析外切蛋白酶降解谷物和油料种子贮藏蛋白产生的游离氨基酸含量，并以建立的标准方法进行检测，以反映原粮及制品中贮藏蛋白的变化。测定粮食中游离氨基酸含量，对分析粮食收购、储藏、运输及加工过程氮代谢变化、营养状况等有重要意义。国内外尚缺乏粮食及加工品中游离氨基酸总量测定标准方法。本标准研究建立了小麦粉及加工品中游离氨基酸总量的测定方法，并对其他谷物和大豆的粗粉及加工品游
17、离氨基酸总量进行分析，以期对我国粮食营养品质的评价提供参考。4. 标准的编制原则和标准的主要内容4.1. 标准编制原则本标准遵循 GB/T 1.1-2009标准化工作导则 第 1 部分：标准的结构和编写规则 、GB/T 20000.2-2001标准化工作指南第二部分：采用国际标准的规则 、GB/T20001.4-2001标准编写规则 第 4 部分：化学分析方法 的编写规则及 GB/T 6379.1-2004 测量方法与结果的准确度 第 2 部分：确定标准测量方法重复性与再现性的基本方法 ，根据我国实情和检测技术发展状况，建立此方法标准。4.2. 确定粮食行业标准主要内容本标准的主要内容有：范围
18、、规范性引用文件、术语和定义、原理、试剂与溶液、仪器设备、分析步骤、结果计算、测定精度、测试报告10项。本方法标准采用比色方法进行粮食游离氨基酸总量测定。5. 标准主要技术内容确立的论据和主要验证试验的分析5.1 确立标准主要内容及依据5.1.1原理粮食籽粒等植物性组织中含有一定量的游离氨基酸，采用无氨蒸馏水提取后可以采用比色方法进行其总含量测定。原理是，游离氨基酸的氨基可与水合茚三酮反应，能够产生二酮茚-二酮茚胺等蓝紫色化合物，在一定范围内，其颜色的深浅与游离氨基酸的含量成正比。据此，可采用分光光度计，在波长 570 nm 下，测定反应产物的消光值。根据标准曲线计算出未知样品中氨基酸的总量。
19、LS/T 20138-氨基酸与水合茚三酮的反应分两步进行。首先，-氨基酸脱氨、脱羧被氧化，产生醛、氨、CO 2（以气泡溢出），水合茚三酮被还原。接着，氧化型和还原型的水合茚三酮与氨反应生成二酮茚-二酮茚胺的取代盐等蓝紫色化合物。 OOHORCHCOHN2+ OOHORCHOCO2NH3+OOH+ OOHNH3+ ONO3H2OO +二-二二(-1,3)现在已知这种蓝紫色化合物不只一种物质，而是几种有色物质，但是各种氨基酸与茚三酮反应均可生成紫色的双-1,3-二酮茚：此反应的特点是：茚三酮是使氨基酸和多肽显色的重要试剂。当茚三酮在弱酸性条件下和 -氨基酸反应，此反应为一切 -氨基酸所共有，反应灵
20、敏，因而本法是氨基酸定量测定应用最广泛的方法之一。脯氨酸和羟脯氨酸与茚三酮反应生成黄色化合物最大吸收值的波长在 44O nm。多肽和蛋白质虽然具有茚三酮反应，但肽链越大灵敏度也越来越差，故不宜作定量测定多肽和蛋白质之用。在多肽合成中常用来检验有无自由氨基的肽类存在。5.1.2 标准曲线以亮氨酸为标样，采用本方法标准所作的标准曲线如图 1。表 1 标准曲线制作1 2 3 4 5 61mol/ml标准亮氨酸溶液 0 0.1 0.2 0.3 0.4 0.5LS/T 20139（mL）无氨蒸馏水（mL） 0.5 0.4 0.3 0.2 0.1 0乙酸-乙酸钠缓冲液（mL） 0.5 0.5 0.5 0.
21、5 0.5 0.53%茚三酮（mL） 0.5 0.5 0.5 0.5 0.5 0.50.1%抗坏血酸（ul） 50 50 50 50 50 50混匀后，在水浴锅加热 12 min，迅速冷却后，加入 95%乙醇 5 mL，剧烈震荡摇匀，然后定容至 10 mL， 570 nm 下测定吸光度。y = 0.9939x + 0.0037R2 = 0.999800.20.40.60.811.20 0.2 0.4 0.6 0.8 1 1.2亮 氨 酸 浓 度 （ umol/ml）D570图 1 以亮氨酸所作的标准曲线5.2 比色法测定粮食中游离氨基酸的主要依据5.2.1 游离氨基酸数量可以反映种子储藏蛋白的
22、品质种子内氨基酸是贮藏型的，或是合成的产物，或是蛋白质分解后的产物，测定谷物和油料种子游离氨基酸含量，以反映其贮藏蛋白质随收获后干燥、储藏、流通及加工处理技术的变化。游离氨基酸总量测定结果以氨基态氮表示。氨基态氮是指氨基酸中所含氮的总量。氨基酸态氮就是以氨基酸形式存在的氮，它的含量与氨基酸的含量成正比。5.2.2 水溶性储藏蛋白对粮食游离氨基酸总量测定影响很小清蛋白占种子总储藏蛋白的百分数为，小麦 9%，玉米 1425%，水稻 5%，豌豆40%。我们测定的稻米中水溶性蛋白质含量 56 mg/g fw, 新收获小麦中水溶性蛋白质含量 414 mg/g fw，收获后储藏半年的小麦水溶性蛋白质含量
23、78 mg/gfw。这些谷物水溶性蛋白质在弱酸的醋酸缓冲液中不发生水解。况且，粮食粗粉水提取液在 90加热LS/T 20131012min，糙米和玉米水溶性蛋白质发生变性，考马氏亮蓝染色方法测定的可溶性蛋白质含量减少，但是小麦粉和大豆粉水提取液 90加热 12min,前后可溶性蛋白含量不受影响（表 2） 。这是由于粮食水溶性蛋白质中性 pH 很稳定，在碱性高 pH 才发生水解。即说明在游离氨基酸茚三酮反应测定体系中，粮食储藏蛋白质中的水溶性蛋白质不参与茚三酮反应，主要是其分子量较大，如稻谷清蛋白分子量范围为 10200 KDa。表 2 粮食水提取液中蛋白含量及 90加热 12min 后蛋白质含
24、量水溶性蛋白含量（mg/ml）水提取液 90加热 12min小麦粉 1.200.10 1.090.03糙米粉 0.500.03 0.100.01玉米粉 0.550.03 0.220.01大豆粉 16.860.83 14.681.10表 3 水提取液蛋白酶解后游离氨基酸含量（ug 氮/ml）水提取液 处理 处理小麦 22.651.13 20.120.79 69.511.93糙米 10.440.37 10.090.34 29.261.59大米 2.820.09 4.202.78 15.710.45玉米 15.710.06 15.232.49 37.320.28大豆 151.309.92 142.5
25、53.23 396.4019.84注：直接测定上清液中的氨基酸含量；0.5mL 上清液+0.5mL 蛋白酶缓冲液，37 1h 后，测定其氨基酸含量； 为在基础上加入 10uL 内切外切蛋白酶，371h 后，测定其氨基酸含量。从表 3 看出，不同粮食水提取液含有一定量的游离氨基酸，加入具有内切和外切活性的蛋白酶后，水溶性清蛋白被水解产生氨基酸，溶液中总氨基酸含量显著升高 34 倍。5.2.3 粮食游离氨基酸含量测定中最佳反应温度确定LS/T 20131100.10.20.30.40.575 80 85 90 95 10小 麦 粉糙 米 粉大 米 粉玉 米 粉大 豆 粉OD温 度注：不同粮种茚三酮
26、反应体系中稀释倍数不同.图 2 粮食游离氨基酸总量采用茚三酮反应体系中最佳反应温度的确定从图 2 看出，在 75100范围内，粮食水提取物中游离氨基酸均能够与茚三酮发生反应，显示蓝紫色。从 75到 85，D 570吸光值显著最佳，之后增加缓慢；采用亮氨酸制作标准曲线，发现在 90以上温度，吸光度与亮氨酸浓度之间呈现抛物线关系。因此本研究采用 85为最佳反应温度。5.2.4 最佳反应时间确定00.10.20.30.40.50 510152025D570D570反 应 时 间 (min)A00.10.20.30.40.50 510152025D570D570反 应 时 间 (min)BA 茚三酮反
27、应后立即测定 OD 值 B 茚三酮反应后放置 2h 测定 OD 值图 4 茚三酮反应最佳反应时间确定LS/T 201312以小麦水提取液为样品，确定茚三酮反应最佳时间。从图 4 看出，从 5 min 到 15 min，D 570显著增加，从 15 min 到 20min，D 570增加缓慢。我们以 12 min 为最佳反应时间。5.2.5 茚三酮反应产物稳定性确定00.050.10.150.20.250.30.350 2 4 6小 麦 粉糙 米 粉玉 米 粉大 豆 粉D570放 置 时 间 （ h）注：不同粮种反应液稀释倍数不同图 5 茚三酮反应产物稳定性从图 5 看出，茚三酮反应后放置 5
28、小时，反应产物很稳定。根据文献，我们建议在茚三酮反应后 1.5 小时内完成测定。5.3 粮食游离氨基酸总量测定及其对粮食储藏与加工的指导意义5.3.1小麦及加工品中游离氨基酸含量表 4 小麦粗粉中总游离氨基酸含量LS/T 201313编号 品种 类型 产地收获年份含水率（%湿）总游离氨基酸（g 氨基态氮/g 干重）1农大白麦5177 软白冬麦 北京 2007 8.74 324.1012.512 陇原 2 号 硬白冬麦 陕西 2007 7.99 227.5931.993 内蒙古春 硬红春麦 内蒙古 2007 8.76 454.7812.034 黑龙江春 硬红春麦 黑龙江 2007 8.25 30
29、6.6824.155 河北永清 硬红冬麦 河北 2007 8.47 352.5826.956 赵庄 2 号 软红冬麦 北京 2008 8.74 268.763.967 南段 硬白冬麦 山东 2008 9.81 243.268.908 矮抗 58 硬白冬麦 河南 2008 8.81 249.6414.079 周麦 16混合白冬麦 河南 2008 8.83 256.9333.1810 济麦 16 硬白冬麦 山东 2008 11.17 208.3322.1511 翼麦 20 白冬麦 河北 2010 9.75 341.6523.3412 绵麦 37混合-软白冬麦 四川 2011 8.13 206.15
30、48.9113 良麦 2 号混合-软白冬麦 四川 2011 8.42 263.6619.3114 良麦 3 号混合-软白冬麦 四川 2011 8.21 224.915.2515 蜀麦 482混合红冬麦 四川 2011 8.40 249.5722.5216 川农 16混合红冬麦 四川 2011 8.52 247.788.1917 蜀麦 375混合-软红冬麦 四川 2011 7.99 235.1227.01注：测定时间是 2012 年 6 月份；游离氨基酸总量以平均值标准差。植物材料中游离氨基酸测定的一个关键之处是，必须在沸水浴中加热 6。在本试验中，从表 4 看出，小麦籽粒磨粉制备的粗粉中，含有
31、显著量的游离氨基酸。随着储藏年限的增加，小麦籽粒中游离氨基酸含量呈现增加趋向。LS/T 201314表 5 小麦加工品中总游离氨基酸含量编号 类型 产地 取样时间含水率（%湿）总游离氨基酸（g 氨基态氮/g干重）1 A 淀粉 河南 2012 年 7 月 8.25 14.316.082 B 淀粉 河南 2012 年 7 月 13.21 34.4217.283 B 淀粉 河南 2012 年 10 月 12.21 29.7814.854 谷朊粉 河南 2012 年 7 月 5.82 134.865.555B 淀粉酸性蛋白酶解产物 河南 2012 年 7 月 13.0179.885.206B 淀粉中性
32、蛋白酶解产物 河南 2012 年 7 月 13.01180.344.517 古船饺子粉 2012 年 11 月 11.17 183.8714.328 百姓自发粉 2012 年 11 月 10.82 212.909.80注：测定时间为 2012 年 12 月；游离氨基酸总量以平均值标准偏差。从表 5 看出，商品小麦淀粉样品中也含有一定量的游离氨基酸，谷朊粉中的游离氨基酸含量显著低于常温保存小麦磨粉样品的游离氨基酸含量。商品小麦面粉提取谷朊粉、淀粉后剩余的 B 淀粉样品，仍然含有一定量的蛋白质，通过不同 pH 值的蛋白酶类进行降解，产生大量的游离氨基酸。饺子粉和自发粉中含有的游离氨基酸水平与小麦籽
33、粒的相当。5.3.2萌动小麦游离氨基酸总量显著升高小麦收获前穗上发芽，在我国长江流域的山谷小麦产区、东北春小麦产区及华北、西北的冬小麦产区，时有发生。不正常年份，我国小麦的穗发芽，面积能够达到24.91百万公顷，占我国小麦种植面积的83 7。闫长生等 7采用收获时种子发芽率和面粉降落数值法于20002002年评价了我国小麦主产区1950年以来主要推广的781品种（系）的穗发芽抗性，发现穗发芽抗性20世纪90年代育成的品种与80年代的相近，但是明显弱于5070年代育成的品种。一个重要原因是进入80年代，出粉率高的白麦品种受到偏爱，白麦抗穗发芽能力不如红麦。研究表明， 90克小麦中如果有一粒小麦严
34、重发芽，就严重地影响测定的样品降落数值和糊化值（amylograph）。小麦样品中若存在几粒严重发芽的麦粒，就导致整个小麦样品被拒绝收购，尽管该小麦样品具有良好的磨粉和烘焙特性。因此建立快速有效的芽麦检测方法，选育抗穗发芽的小麦品种，是粮食工作者的重要目标之一。本研究发现，萌动小麦游离氨基酸总量显著增加。表 6 萌动小麦游离氨基酸总量变化LS/T 201315不萌动小麦 萌动小麦水分 游离氨基态氮 水分 游离氨基态氮品种编号类型 产地 收获时间 发芽率%（%） （g/g 干重） （%） （g/g 干重）1 硬白冬 山东2008 年 7月 88.73.1 10.39 215.852.01 10.
35、61 397.9124.822 软红冬 北京2008 年 6月 93.30.6 10.65 232.459.46 12.08 317.6414.213 硬冬 河南2008 年 6月 95.53.5 10.79 199.829.91 10.99 255.677.954 软白冬 北京2008 年 7月 74.05.7 10.44 275.8613.36 13.10 390.0312.775 硬冬 河南2008 年 6月 88.04.4 10.18 204.394.27 10.51 298.7217.246 硬红春 内蒙2008 年 7月 67.01.1 8.70 207.731.86 10.95
36、346.8411.65a 注：含水率以湿基表示，发芽率于 2013 年 5 月在 20测定；游离氨基酸总量测定时间 2013 年 5 月，游离氨基酸总量以平均值标准偏差。从表 6 看出，6 个小麦品种萌动后，游离氨基酸总量均显著增加。结合内切和外切蛋白酶水解试验，我们认为，小麦萌动后，内切蛋白酶解产生显著量的游离氨基酸。5.3.3发芽糙米中游离氨基酸总量显著增加与精米比较，糙米含有较多的营养成分，如膳食纤维、植酸、维生素 E 和 B、- 氨基丁酸(GABA) 。存在米糠层和胚芽的这些营养成分，在糙米抛光或碾制成精米期间被除去。消费者不喜欢糙米，在于其外观深色、质地硬，需要在高压锅蒸煮，而且米糠
37、层易酸败导致米饭苦味，因此糙米仅作为发酵或食品加工的原料。1994 年日本 Saikusa 等人发现当糙米在 40水中浸泡 824 小时，GABA 显著增加。膳食中 GABA 摄取增加，可以降低血压，改善睡眠，抑制与更年期相关的自主失调，甚至抑制肝脏细胞坏死。发芽糙米1995 年进入日本市场，它深受人们欢迎，于是出现了许多发芽糙米生产企业。在蒸煮之前稍微冲洗发芽糙米产品，在普通米饭锅蒸煮发芽糙米，蒸熟的米饭柔软、易咀嚼。发芽糙米还可作为原料生产多种食品，如发芽糙米球、汤、面团坚果、小甜饼、米汉堡等。我国对发芽糙米的研究起步较晚，近十多年对发芽糙米及相关制品的研究给予了高度重视。本研究发现，发芽
38、糙米游离氨基酸总量显著增加。表 7 发芽糙米中游离氨基酸总量LS/T 201316糙米 发芽糙米品种编号类型 产地 收获时间含水率（%）游离氨基酸（g 氨基态氮/g 干重）含水率（%）游离氨基酸（g 氨基态氮/g 干重）1 粳稻 吉林 2011 年 10月13.92 114.116.51 19.14 358.1320.332 粳稻 常熟 2011 年 9 月 14.71 88.840.72 14.71 633.0574.093 粳稻 南京 2011 年 11月14.75 114.516.46 17.14 298.7517.414 糯稻 重庆 2010 年 9 月 9.13 171.4214.0
39、2 16.29 401.1318.365 糯稻 重庆 2010 年 9 月 12.31 128.692 21.02 357.5921.18注：含水率以湿基表示；测定时间是 2013 年 5 月，游离氨基酸总量以平均值标准偏差。利用种子萌发原理能有效改善糙米中营养成分。从表 7 看出，发芽糙米中游离氨基酸总量显著增加。5.3.4大豆和玉米中游离氨基酸总量测定表 8 大豆样品中游离氨基酸总量大豆品种 收获年份 含水率（%湿）游离氨基酸（g 氨基态氮/gdw）中黄 37 北京 2008 6.43 914.0313.25商水县 1 号 河南 2010 6.60 845.1527.26商水县 2 号 河
40、南 2010 6.65 902.5310.98中黄 35 北京 2008 6.50 862.0913.74吉林大豆 吉林 2010 7.27 946.9668.3黑大豆 吉林 2011 7.43 834.8612.13十月黄（迟豆子） 重庆 2009 8.20 906.9214.76七月黄（早豆） 重庆 2010 8.56 854.0352.67注：测定时间是 2012 年 7 月，游离氨基酸总量以平均值标准偏差。大豆游离氨基酸含量高于小麦和大米等谷物。对于脱水的大豆籽粒样品，在含水率接近的情况下，大豆品种之间游离氨基酸总量差异不显著（表 8） 。同时测定了不同含水率的玉米游离氨基酸含量。在含
41、水率接近的情况下，玉米品种之间游离氨基酸总量差异不显著（表 9） 。LS/T 201317表 9 玉米样品中游离氨基酸总量玉米品种及样品类型 产地 收获年份 含水率（%湿）游离氨基酸（g 氨基态氮/gdw）朝阳小马牙 白玉米 辽宁 2010 6.24 190.0318.50大马牙 白玉米 河北 2010 6.92 255.0518.84朝阳大马牙 白玉米 辽宁 2010 7.22 196.948.87京单 28 号 黄玉米 北京 2010 7.62 299.805.56承玉 6 号 白玉米 河北 2010 7.78 290.136.02黑龙江 TTC 黄玉米 黑龙江 2007 7.91 280
42、.925.81黑龙江 338 黄玉米 黑龙江 2007 8.67 255.282.37山阳黄玉米 黄白 河北 2008 9.16 262.399.88东泉 811 黄玉米 山西 2008 10.92 265.9216.16和家园 白玉米 - 2010 12.48 110.7012.14黄玉米样品 1 黄玉米 山西 2007 13.56 250.2343.72农大 108 黄玉米 北京 2010 13.80 174.386.95奇玉 16 黄玉米 - 2010 13.92 151.342.83黄元 10 号 黄玉米 - 2010 15.05 215.745.45龙江 338 高水分 黄玉米 黑龙
43、江 2007 24.67 459.2333.43注：测定时间是 2012 年 7 月，游离氨基酸总量以平均值标准偏差。从上述试验分析看出，游离氨基酸含量可以作为芽麦检测、发芽糙米营养、谷物和油料种子储藏流通过程中品质变化的参考指标。5.4 方法可靠性的验证本标准验证人员来自 3 个外单位和本实验室。本实验室 1 名工作人员、1 名硕士生、2 名大四本科生独立按照方法标准草案进行试验。整个试验按照二因素随机区组设计，二因素分别是测试者、粮食品种。数据分析采用生物统计软件 SSPS 的单因素方差分析比较平均值。7 位分析者对每个样品平行测定 3 次，5 个品种共计 105 个数据。每个分析者测定的
44、样品均值如表 10，同时给出了 7 位分析者的测定平均值。表 10 三家验证单位和本实验室共计 7位分析者测定的游离氨基酸含量LS/T 201318（g 氨基氮/g 干重）A（本实验室） B（本实验室） C（本实验室） D（本实验室）大米 67.974.88 68.241.11 82.220.96 72.521.35糙米 136.138.25 118.351.13 147.282.05 124.294.75玉米 198.458.78 185.491.69 207.996.33 173.234.59小麦粉 235.9410.8 210.415.53 238.288.76 223.453.93大豆
45、 1429.2962.53 1363.9425.00 1358.1966.86 1266.9347.26E（验证单位 1） F（验证单位2） G（验证单位 3） 平均值大米 87.215.35 80.611.13 69.871.19 75.527.33糙米 155.987.81 148.962.82 149.662.64 140.0914.22玉米 178.809.41 214.943.43 228.797.75 198.2420.3小麦粉 231.1412.60 255.522.90 261.096.77 236.5517.56大豆 1370.2050.79 1387.0711.99 148
46、2.5662.63 1379.7466.6注：测定时间是 2014 年 24 月份，游离氨基酸总量以平均值标准偏差（SD） 。5.4.1 粮食品种之间游离氨基酸含量差异分析表11-A1 粮食种类之间游离氨基酸含量平均值描述样本数 平均 标准偏差 标准误 平均值95% 置信区间 最小值 最大值下限 上限 大米 21 75.51944 7.729541 1.686724 72.00099 79.03788 63.126 92.528糙米 21 140.096 14.117 3.0806 133.6702 146.5222 117.536 163.735玉米 21 208.652 34.504 7.
47、5293 192.9466 224.3583 169.386 266.902小麦 21 226.133 12.218 2.6663 220.5711 231.69458 206.219 250.610大豆 21 1379.741 97.518 21.2801 1335.3516 1424.1306 1139.432 1544.199总量 105 407.636 493.251 48.1364 312.1795 503.0921 63.126 1544.199表11-A2粮食种类之间游离氨基酸含量差异方差分析结果平方和 df 均方 F值 显著性组之间 (结合) 25187236.406 4 62
48、96809.101 2834.226 .000线性项 对比 15246467.304 1 15246467.304 6862.514 .000偏差 9940769.102 3 3313589.701 1491.464 .000组内 222170.291 100 2221.703 总体 25409406.697 104 表 11-A3 方差均质性分析Levene 统计学 df1 df2 显著性14.339 4 100 .000LS/T 201319表11-A4 粮食种类之间游离氨基酸含量差异性多重比较（邓肯LSD方法）(I) 种类 (J) 种类平均值差异 (I-J) 标准误显著性 95% 置信区间下限 上限大米 糙米 -64.57676(*) 14.546159 .000 -93.43592 -35.71759玉米 -133.13303(*) 14.546159 .000 -161.99220 -104.27387小麦 -150.61343(*) 14.546159 .000 -179.47259 -121.75426大豆 -1304.22167(*) 14.546159 .000 -1333.08084
