1、 1粮油检测 粮食中玉米赤霉烯酮的测定 超高效液相色谱方法行业标准制定编制说明玉米赤霉烯酮 (Zearalenone) 又称F-2毒素，主要由木贼镰刀菌（ Fusarium.equiseti）、尖孢镰刀菌（Fusarium.oxysporum）、禾谷镰刀菌 (Fusarium.graminearum)、三线镰刀菌（Fusarium.trcinctum）、茄病镰刀菌（ Fusarium.solani）、串珠镰刀菌（ Fusarium. moniliforme）等产生。ZEN是一种生殖系统毒素（雌性激素），有强烈的致畸作用,被国际癌症研究中心归类为3类致癌物,主要污染小麦、大麦、水稻、玉米、小米和
2、燕麦等谷物。面粉、啤酒等农产品加工品中也常能检测到该毒素的存在。阿根廷报道新收获玉米的含量在未检出到83 mg/kg 之间, 储存玉米的含量在未检出到17 mg/kg之间。我国小麦和玉米中也经常发生玉米赤霉烯酮的污染，危害消费者健康。研究表明：我国成人通过玉米制品暴露ZEN 的量超过每日允许限量（TDI），部分儿童通过玉米制品暴露ZEN 的量也超过了TDI。我国食品安全国家标准 GB2761-2011 食品中真菌毒素限量中规定谷物及其制品中玉米赤霉烯酮限量为60 g/kg。目前报道用于检测玉米赤霉烯酮的分析方法有酶联免疫法、免疫胶体金试纸法、气相色谱质谱联用法、高效液相色谱法、液相色谱质谱联用
3、法、多不对称波形离子迁移谱质谱、间接竞争免疫分辨荧光免疫分析、薄层色谱法等。薄层色谱法由于操作复杂，目前应用较少；胶体金和酶联免疫方法用于快速筛查;普通液相色谱方法目前应用较多，但分析速度较慢，耗费溶剂较多，成本增加；液质联用仪检测需要高端的质谱仪。当前急需建立一种更加灵敏、高效、低溶剂量的玉米赤霉烯酮微量快速定量方法。为了满足当前我国粮食绿色检测、监测定量分析的需要，通过查阅文献，根据范德米特(van Deemeter)方程理论，结合免疫亲和净化手段，基于UPLC分离技术，建立了一种进样量小、分离度高、快速准确、环保的玉米赤霉烯酮定量分析方法。本标准项目的研究有助于提高粮食样品检测、监测效率
4、，降低成本，保护环境，保障从业人员健康安全。本标准对后续标准制定，以及粮食污染黄曲霉毒素的相关科研、标准制定起到较好的指导、参考、促进作用。1 工作简况1.1 任务来源及起草单位根据 2012 年粮油行业标准制定计划的要求，由国家粮食局科学研究院负责粮油检测 粮食中玉米赤霉烯酮的测定 超高效液相色谱方法起草工作，该方法也是国家 863 项目“粮食产后生物性危害物快速检验监测技术” （项目编号 2012AA101609）的研究内容之一。 起草单位成立的标准2起草组负责进行本标准的各项工作。1.2 标准研制主要工作过程（1）根据该标准的特点，2012 年 5 月-2012 年 7 月，查询了国内外
5、资料，对相关检测机构、粮库、粮食加工企业进行了调研，并召开了第一次讨论会，确定了标准制订方案和工作计划。（2）2012 年 8 月-2012 年 12 月，在国家粮食局科学研究院实验室进行标准的研制工作，主要包括方法的建立，方法灵敏度测试，方法的线性范围确定，方法的回收率研究等。（3）2013 年 1 月-3 月，编写了 粮油检测 粮食中玉米赤霉烯酮的测定 超高效液相色谱方法标准草案，并召开了第二次讨论会。（4）2013 年 4 月-9 月，在不同厂家的快速液相色谱上进行方法的验证。（5）2013 年 10 月-11 月，标准草案的函件征询意见。（6）2015 年 3 月-2015 年 7 月
6、，行业验证。(7)2015 年 8 月-至今，标准文本修改 ,形成送审稿。2 标准的编制原则和标准的主要内容2.1 标准编制原则本标准是根据 GB/T1.1-2009标准化工作导则第 1 部分：标准的结构与编写规则 、GB/T20001.4-2009标准编写规则第 4 部分：化学分析方法的规定进行编制的。2.2 确定标准主要内容2.2.1 标准的适用范围本标准规定了采用免疫亲和柱净化快速高效液相色谱法测定谷物及其制品中玉米赤霉烯酮的条件和详细分析步骤。本标准适用于小麦、玉米、稻谷等粮食及其制品中玉米赤霉烯酮的测定。本标准方法玉米赤霉烯酮检出限为 10 g /kg。2.2.2 标准研制的总体思路
7、2.2.2.1 仪器与试剂快速高效液相色谱仪：配备荧光检测器和数据处理系统。色谱柱：C 18 柱（50 mm3 mm，1.7m,或相当者） 。免疫亲和柱；玻璃纤维滤纸；0.22 m 有机滤膜；固相萃取装置；电子分析天平；高速旋转粉碎机；高速均质器；多功能振荡器；氮吹仪。玉米赤霉烯酮标准品，甲醇、乙腈（色谱纯） ，超纯水。其它试剂和材料见标准送审稿。32.2.2.2 检测波长的选择实验过程中采用流动相作为背景溶液，用荧光检测器对玉米赤霉烯酮标准液在 190600 nm 进行扫描（见图 1） 。结果表明，玉米赤霉烯酮最佳激发波长为 305 nm，最佳发射波长为 460 nm。2.850 取270.
8、 305.EU0.0.20.40.60.81.01.取25.260.270.280.290.30.310.320.30.340.图 1 玉米赤霉烯酮激发波长扫描谱图Fig. 1 FLR Excitation spectrum of ZEN2.84 取 45.8EU0.2.30.4.50.6.70.取3940.10.42.03.04.50.46.07.048.图 2 玉米赤霉烯酮发射波长扫描谱图Fig. 2 FLR Emission spectrum of ZEN4图 3 玉米赤霉烯酮的色谱图Fig.3 Chromatogram of ZEN2.2.2.3 流动相的优化根据以上条件，以乙腈+水+
9、 甲醇，按体积比 46：46：8 混合，流速不同时，峰的保留体积基本相同，表明在 2m 色谱柱填料下，流速对柱效影响小，最佳流速范围宽。结果见表 1。表 1 ZEN 的保留体积Table 1 Retention volume of ZEN流速 Flow rate 0.1ml/min 0.15ml/min 0.2ml/min 标准偏差 STD 相对标准偏差 RSD （% ）保留体积Retention volume（ mL）0.47 0.47 0.48 0.006 1.3流动相经优化后，以保留时间约 3.131 min 处计算，测 1 个样品消耗的甲醇量为：0.2 mL/min（流速）3.131
10、min（保留时间）0.4（有机溶剂配比） =0.250 mL。据检索国内外相关文献报道，采用普通液相色谱方法消耗有机溶剂的量为 1.4410.6 mL（见表 4） ，与之相比，本方法的有机溶剂用量是文献报道方法的 1/6-1/50，流动相的消耗量少，更环保。2.2.2.4 方法的线性范围与检出限在上述色谱条件下，用玉米赤霉烯酮的系列标准溶液按选定的色谱条件测定，以 UPLC 测得的峰面积为纵坐标（y） ，相应的质量（pg）为横坐标（x）绘制标准曲线，根据 3 倍信噪比的峰响应值，得出此方法检出限，根据 10 倍信噪比，得出线性范围的下限，结果见表 2。表 2 玉米赤霉烯酮的线性回归方程及检出限
11、Table 2 Regression equations and detection limits of mycotoxins线性范围 Linear range(pg) 线性方程 Linear equation 相关系数(R 2) 检出限 LOD(pg)10.0500.0 y=2.696023102x-1.413788103 0.9999 5现有国家标准、行业标准和国内外有关文献报道，采用普通液相色谱方法的检出限在5602000 pg（见表 5） ，与之比较，本方法的灵敏度至少提高了 12 倍。此外，灵敏度的提高，意味着用来进样分析的玉米赤霉烯酮可以更少，在净化阶段能够使用柱容量更小的免疫亲和
12、柱。传统HPLC 方法，由于灵敏度相对较低，需要柱容量较高的免疫亲和柱，要求填充更多的玉米赤霉烯酮抗体，增加了分析成本，本方法允许使用容量更低的免疫亲和柱，从而也可降低检测成本。考虑到不同厂家仪器差异和不同实验室的差异,确定方法检测限为 10 g /kg.2.2.2.5 方法的精密度与回收率将添加 ZEN 的小麦、玉米样品按照本方法进行检测。添加量为 100 ng/g 的同一批样品重复测7 天，每天测 7 次，做方法精密度实验，日内精密度为 2.7%，日间精密度为 6.9%，具有较好的精密度。添加 ZEN 的小麦、玉米样品，每个浓度做 5 个平行样检测，测方法回收率，结果见表 3。对小麦和玉米
13、加标样品的考察结果显示，本方法的回收率 83-112%。表 3 回收率实验结果Table 3 Recoveries of spiked samples with different ZEN concentrations样品 Sample添加量 Spiked w(ng/g)平均值 Average value w(ng/g)回收率范围 Rang recovery R/%小麦 Wheat 20/50/100 18.5/44.2/102 85102玉米 Corn 20/50/100 18.2/48.2/112 83112综合来看，本方法的灵敏度比其它高效液相色谱方法高，消耗的有机溶剂少，样品提取方法、
14、回收率方面与其它高效液相色谱方法相当，具体情况见表 5.2.2.2.6 实际样品的分析应用建立的方法分析了部分玉米样品中的 ZEN，结果表明，部分样品有污染，污染的样品及其含量见下表，检测结果显示部分样品玉米赤霉烯酮超过国家食品安全限量，需加强监测防控。样品色谱图见图 4。表 4 玉米样品 ZEN 检测结果Table 4 ZEN of corn samples样品号 1 2 3 4 5 6含量（ g/kg） 36.1 34.7 236.7 126.6 50.0 86.1图 4 玉米赤霉烯酮污染玉米样品的色谱图6Fig.4 Chromatograms of ZEN in contaminated
15、 sample of corn 2.2.2.7 方法的验证本方法经北京市粮油食品检验所、黑龙江国家粮食质量监测中心、吉林国家粮食质量监测中心、河南国家粮食质量监测中心、湖南国家粮食质量监测中心、国家粮食局科学研究院检测中心等 6 家实验室验证。采用两种谷物及其制品（小麦、玉米）进行方法精密度实验。全部数据采用科克伦和格拉布斯（Grubbs）法检验，剔除离群值，根据情况处理歧离值后，计算谷物及其制品中玉米赤霉烯酮的总体平均值（m） ，重复性限（ r）和再现性限（R） ，其中，小麦、玉米中玉米赤霉烯酮不同水平采取 6 家样品检测值进行统计，这些结果均符合食品法典委员会程序手册 （第二十版）中关于联
16、合验证中 HorRat 在 2 之内的规定。表 5 实验室间联合验证统计结果玉米 小麦参数水平 1 水平 2 水平 3 水平 1实验室数目 6 6 6 6参加统计实验室数目 6 6 6 6离群实验室数目 0 0 0 0平均值，m（mg/kg） 22.952 81.340 276.909 116.495重复性标准偏差，Sr（mg/kg ）1.088 3.280 3.727 2.167 重复性限，r（mg/kg） 3.079 9.283 10.548 6.133 再现性标准偏差，SR（mg/kg）4.114 6.294 19.816 9.376 再现性限，R（mg/kg ） 11.642 17.8
17、12 56.080 26.534 HorRat 值 1.81 0.94 1.05 1.03 3 采用国际标准和国外先进标准的情况，以及与国际、国外同类标准水平的对比，或者与测试的国外样品、样机的有关数据对比情况本方法的检测灵敏度与普通 HPLC 方法相比，至少提高了 12 倍；消耗有机溶剂少，具有较高的精密度、回收率；检测时间短，从提取、净化到色谱分离，整个分析流程耗时不足 45 min。实际样品检测表明，本方法能够满足对样品快速、高通量、低溶剂的检测要求及粮食安全限量的要求。表 6 快速高效液相色谱方法与其他液相色谱方法的性能比较Table 6 Comparison of the UPLC
18、method and other HPLC methods reported recently in 7literature No. 基质 Matrix提取净化Extraction/clear-up流动相/保留时间 Mobile phase/retention time灵敏度Sensitivity (pg)回收率RecoveryR/%Reference1小麦、玉米免疫亲和柱，甲醇/水（8/2, v/v）0.15 mL/min 乙腈/水/甲醇(46/46/8,v/v/v),2.73.1 minLOD=5 85102; 83112 -2小麦、玉米免疫亲和柱，乙腈/水（9/1，v/v）1 mL/mi
19、n 乙腈/水/甲醇(46/46/8,v/v/v),3.39 minLOD=200 73.798.2 203 玉米免疫亲和柱，乙腈/水（9/1，v/v）1.0 mL/min, 乙腈/水(50/50, v/v)，11min 89110 214 大麦 QuEChERS，甲醇1mL/min，乙腈/水/甲醇(46/46/8,v/v/v), 12.113 minLOD=1248pg 8391.5 225粮食及其制品免疫亲和柱，乙腈/水（9/1，v/v）1mL/min，乙腈/水/甲醇(46/46/8,v/v/v), 7.04 minLOD=4002000 70100 236 玉米免疫亲和柱，乙腈/水（9/1
20、，v/v）1mL/min，乙腈/水/甲醇(46/46/8,v/v/v), 6.5minLOD=480 9399.5 247 谷物免疫亲和柱，乙腈/水（9/1，v/v）1 mL/min 乙腈/水/甲醇(46/46/8,v/v/v),3.4 min LOD=400 258 小麦 乙腈/水(84/16, v/v)1mL/min, 乙腈/水(40:60, v/v),21.5 min LOD=1200 84.3% 269 谷物免疫亲和柱，乙腈/水 (90/10, v/v)1.0 mL/min, 乙腈/水(50/50, v/v)，12.2 min LOD=60 66.4-96.1% 2710 玉米SPE，
21、乙腈/NaCl 水溶液(8/2,v/v) 1mL/min,甲醇/水6535(v/v) ，14.97 minLOD=400 78.2-89.6% 2811 粮食SPE，乙腈-NaCl 溶液(90/10, v/v)1mL/min,甲醇与水(7/3,v/v)，15.14 min LOD=100 80.4-88.5 2912小麦、玉米MIP 固相萃取柱，乙腈-水(75/25，v/v)0.2 mL/min,甲醇/水(60/40, v/v)，12min / 82-90 3013 小麦加速溶剂萃取（ASE）,甲醇/乙腈（50/50,v/v）1.0mL/min, 乙腈/甲醇 /水 (10 /55 /35, v
22、/v/v)，15min/ 94-104 314 与有关的现行法律、法规和强制性国家标准、行业标准的关系本标准颁布实施后，针对粮食中玉米赤霉烯酮的测定，符合现行的法律法规和强制性（国家、行业、地方）标准要求。85 重大分歧意见的处理经过和依据无。6 按照标准化法的有关规定，提出强制性标准或推荐性标准的建议建议将本标准列为推荐性行业标准。 7 废止现行有关标准的建议无8 其他应予说明的事项标准采用了快速高效液相色谱仪Acquity UPLC（美国Waters公司） ，荧光检测器（FLD，美国Waters公司）和岛津公司的快速高效液相色谱仪LC-30A二元高压梯度系统进行了适应性研究，方法在这两种仪
23、器上结果符合要求。9 参考文献1 Caldwell, R. W., Tuite, J., Stob, M. et al. Zearalenone Production by Fusarium Species. Appl Microbiol, 1970, 20(1): 3134. 2 Stob, M., Baldwin, R. S., Tuite, J. et al. Isolation of an anabolic, uterotrophic compound from corn infected with Gibberella zeae. Nature 1962, (196): 1318.3
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