1、1 饲 料 及 饲 料 原 料 中 玉 米 赤 霉 烯 酮 的 快 速 筛 查 胶 体 金 快 速 定量 法 江西省地方标准编制说明一、标准制定意义（一）介绍玉米赤霉烯酮(Zearalenone，ZEN)为一种白色结晶，又称 F-2 毒素，是由禾谷镰刀菌等菌种产生的有毒代谢产物。1962 年 Stob 等首先从发霉的玉米中分离得到了该毒素，命名为玉米赤霉烯酮；1966 年 Urry 首次阐明了该毒素的结构，并将此结构命名为 F-2 毒素，后又被改称为 ZEN。ZEN 为白色晶体，分子式 C18H22O5，化学名为 6-(10-羟基-6 氧基-1- 碳烯基)- 雷琐酸-内酯6-(10-hydro
2、xy-6-OXO-trans-1-undeceny)-resorcylicacid lactone ，熔点164165，紫外线光谱最大吸收为 236nm、274nm 和 316nm。红外线光谱最大吸收为970nm，其甲醇溶液在 254nm 短紫外光照射下呈明亮的绿 -蓝色荧光。ZEN 不溶于水，溶于碱性水溶液、乙醚、苯、氯仿、乙酸乙酯、甲醇及乙醇等。在植物体内，ZEN 主要代谢产生 -玉米赤霉烯醇(-Zearalenol，a-ZOL)。在动物及人体内，除了可以代谢产生 -ZOL外，ZEN 还可代谢产生 -玉米赤霉烯醇(-zearalenol ，-ZOL)，-ZOL 和 -ZOL 又可以相互转化
3、并进一步代谢产生 -玉米赤霉醇(zeranol，-zearalanol，ZAL)及 -玉米赤霉醇(Taleranol，-Zearalanol，TAL)，而 ZAL、TAL 以及玉米赤霉醇(zearalanone ，ZAN)又可相互转化。ZEN 主要污染玉米、高粱、小麦、大麦等粮谷类作物及其制品。Toshitsugu 对 19 个国家和地区的谷物、食品及饲料中所含的 ZEN 进行了调查发现，包括中国、阿根廷、加拿大、波兰及也门等众多国家和地区的样品均有不同程度的污染。借助被污染的乳制品、肉制品等动物源性食品，ZEN 及其代谢产物可以进入人体，给人类的健康造成威胁。ZEN 对动物及人类危害主要表现
4、在影响和破坏生长发育及生殖系统方面，人畜误食含有该毒素的食物后，会引起雌性激素中毒症，造成生殖系统的严重损伤。此外，ZEN 及其衍生物对肝脏系统、免疫系统均有很大的危害，并且有引发肿瘤的可能性。Schoental R 在进行致癌试验时发现，试验组大鼠出现由致癌剂处理而诱发的肿瘤；此外，试验组和对照组大鼠还发生了乳腺纤维瘤、腺瘤、腺癌、垂体腺癌、睾丸间质肿瘤以及子宫纤维瘤等。在其他致癌试验中也有类似情况发生，这些肿瘤所涉及的器官表明，它们可能与动物饲料中的雌激素物质有关。因此认为，它们是由污染饲料的 ZEN 或其代谢产物引起的。（二）背景据联合国粮农组织（FAO）统计，全世界每年谷物产量的 25
5、%受到真菌毒素不同程度的污染。随着饲料工业的快速发展，近年来，中国的饲料也受到霉菌污染的严重挑战。自2006 年以来，玉米等饲料原料价格普遍上涨，致使很多饲料企业及养殖户使用低质饲料原料，加上近年来气候的变化，华北、东北地区降雨量增加，进一步加重了饲料原料中真菌毒素的污染。而由于饲料原料和配合饲料中多种真菌毒素同时存在，在食用油等产品及牛奶中真菌毒素污染也比较严重。在世界许多地方，目前真菌毒素已构成重要的食品安全问题。2真菌毒素对人类和动物健康可产生严重的影响，这一认识导致了许多国家在近几十年来制定了诸多有关食品和饲料中真菌毒素的法规，以保护人类的健康，并保障生产者和贸易商的经济利益。随着全球
6、经济一体化的进程，类似真菌毒素等涉及安全卫生项目的限量标准，越来越多地被利用为贸易保护主义中非关税壁垒的重要手段。因此，为了保证食品安全，保障消费者的健康，为了打破国外的技术壁垒，同时在合理有利的前提下，更多地树立我国的技术性壁垒，开展饲料中真菌毒素的检测并建立标准方法是有效的方法之一。目前国内应用标准检测方法大多为仪器方法，所需仪器设备昂贵，不利于进行广泛推广，并且限制了很多检测单位高效、广泛地开展检测工作。建立符合中国国情的快速检测方法标准，具有检测快速、简便、灵敏、成本低等优点，为打开市场并占领市场提供了先决条件。（三）限量标准、检测方法及研究现状1、限量标准目前大多数国家对食品、谷物、
7、饲料中的玉米赤霉烯酮含量都有十分严格的规定。例如澳大利亚规定谷物中玉米赤霉烯酮的含量不能超过 0.05mg/kg；意大利规定在谷物和谷类产品中玉米赤霉烯酮的含量不能超过 0.1mg/kg；而在法国，植物油和谷类当中玉米赤霉烯酮的含量必须低于 0.2mg/kg。中国则规定饲料、玉米中的玉米赤霉烯酮含量不得超过500g/kg。表 1 我国饲料中的玉米赤霉烯酮限量标准产品名称 限量/(g/kg)配合饲料、玉米 5002、检测方法及研究现状玉米赤霉烯酮的分析测定一般采用薄层色谱法(TLC)、酶联吸附免疫法(ELISA)和高效液相色谱法(HPLC)。TLC 法繁琐费时，且灵敏度、特异性较差，提取过程中所
8、需有机溶剂品种多且量大，易污染环境，对人体有较大危害。而 ELISA 法测定结果受试剂盒差异、实验温度、仪器灵敏度等条件影响较大，重复性差，假阳性率高，难以达到相关技术要求。常规的 HPLC 法虽然比 TLC 灵敏度高，但由于样品前处理手续繁琐，操作复杂，也难以推广。以上几种方法均耗时较长，而随着商品经济的发展，人们对时间概念的加强，无论是商家还是政府部门对检测时间的要求越来越高，而胶体金试纸条作为一种快速检测技术，能很好地解决这个问题，提高检测效率，缩减检测时间。（四）制定标准的必要性和意义1、提高农产品质量的需要玉米赤霉烯酮是由产毒真菌产生的代谢物，广泛存在于粮油食品和饲料中。这些产毒真菌
9、分布于各级食物链，即使是在现今拥有先进的农业技术和食品加工工艺的条件下，在作物种植、收获、储藏和加工过程中，仍然无法避免和防止产毒真菌的危害。随着我国经济快速发展，人民群众物质文化生活水平不断提高，对食品安全的关注进一步提高，迫切需要相应的检测技术，鉴于传统检测方法的专业性要求高和成本昂贵的缺点，玉米赤霉烯酮快速检测技术的研究及制订相应的检测方法标准是非常必要的。2、实现以人为本，保证广大群众生命健康的需要3玉米赤霉烯酮毒性很高，可通过污染谷物和那些来源于被玉米赤霉烯酮污染了的饲料喂饲的动物性食物（如牛奶、肉和蛋）而进入食物链，危害人类健康。其具有致突变、致癌性，还具有免疫毒性，其作用的靶器官
10、主要为肝脏，可引起人类和动物的肝脏病变和致癌。为了对国家、人民高度负责，保障人民生命安全和农村社会稳定，研究玉米赤霉烯酮快速检测技术并制订相应的检测方法标准是非常必要的。3、适应市场经济和加入 WTO 新形势的需要我国已经加入 WTO，我国农产品已面临国际和国内两个市场，为我国农产品（劳动密集型）进入国际市场提供了很好的机遇，但国际上十分重视农产品的安全问题，而农产品易于被真菌污染，可能存在玉米赤霉烯酮等真菌毒素残留问题，这已成为影响出口创汇的最大制约因素。由于毒素残留超标，引起外国拒收，退货、扣留、索赔、撤消合同等事件经常发生，给我国农产品生产者造成很大损失，并影响了我国农产品的形象。为了从
11、源头保证农产品质量，提高我国农产品的竞争力，研究玉米赤霉烯酮快速检测技术并制订相应的检测方法标准是非常必要的。二、标准制定过程饲料原料中玉米赤霉烯酮的快速筛查 胶体金免疫层析法标准由江西省兽药饲料监察所、北京勤邦生物技术有限公司、双胞胎（集团）股份有限公司、江西正邦科技股份有限公司负责起草编写。根据国家有关标准制定和修订工作的要求，标准起草单位在饲料原料中玉米赤霉烯酮的快速筛查 胶体金免疫层析法的起草编制过程中，主要工作包括以下几个方面：（1）详细查阅了国内、国外有关标准和相关专业期刊上发表过的参考文献等技术资料，并对这些资料进行了详细的对比，从方法的先进性、可靠性和实用性等几个方面考虑，选取
12、了几个代表性的参考资料作为标准起草中的主要技术参考文本。（2）及时购置相关的实验试剂、标准品和其他材料；已将玉米赤霉烯酮与 1,3-丙二胺反应得到具有氨基官能团的半抗原；将玉米赤霉烯酮半抗原与牛血清白蛋白和卵清蛋白分别进行偶联得到免疫原和包被原；已将制备获得的抗原通过免疫小鼠获得玉米赤霉烯酮单克隆抗体；建立了胶体金免疫层析法的反应体系，摸索不同条件对方法进行最优化，最终确定了最佳的检测方法。（3）开展多种饲料原料胶体金快速检测方法的试验，包括小麦、大米、黄豆、玉米、豆粕、花生粕、DDGS，这是方法的重要步骤和关键环节。不同样品用同一种方法进行试验和验证，确保本检测方法能够灵敏、特异、准确地检测
13、出饲料原料中玉米赤霉烯酮的含量。如：方法的灵敏度，按照空白饲料原料样品及 25g/kg、50g/kg、100g/kg、200g/kg四种浓度对饲料原料进行添加，确定检测限；方法的准确率，通过对经验证的阴阳性样品进行检测，得到本检测方法的假阴性率和假阳性率，盲样测定与仪器方法的结果进行比对，确保本方法的检测结果可靠；方法的特异性，运用本方法对饲料原料中常见的其他真菌毒素进行检测，确保本方法能特异性地检测饲料原料中玉米赤霉烯酮残留。（4）在技术指标完成试验工作之后，严格按照标准的格式，起草编写标准文本内容和编制说明内容。三、标准制定依据4本标准是根据 GB/T 1.1-2009标准化工作导则 第
14、1 部分：标准的结构和编写 、GB/T 20001.4-2015标准编写规则 第 4 部分：试验方法标准的要求而进行编写的。有关技术内容是在参考国外有关标准及文献的基础上经研究、改进和验证后制定的。四、标准技术内容和技术指标的论证（一）技术原理本方法应用了竞争抑制免疫层析原理。将氯金酸用还原法制成一定直径的金溶胶颗粒，标记抗体。硝酸纤维素膜为载体，利用了微孔膜的毛细管作用，滴加在膜条一端的液体慢慢向另一端渗移。在移动的过程中，会发生相应的抗原抗体反应，并通过免疫金的颜色而显示出来。样本中的玉米赤霉烯酮在流动的过程中与胶体金标记的特异性抗体结合，抑制了抗体和硝酸纤维素（NC）膜检测线上玉米赤霉烯
15、酮-BSA 偶联物的结合，使检测线不显颜色，结果为阳牲；反之，检测线显红色，结果为阴性。（二）胶体金免疫方法主要材料的制备1、半抗原的合成及鉴定玉米赤霉烯酮为小分子物质，不具备免疫原性，只有反应原性，因此需要与大分子共价结合后才能使动物免疫系统识别，产生相应的抗体，本实验首先需要合成小分子半抗原与蛋白质偶联的人工抗原。玉米赤霉烯酮小分子半抗原的制备既要保留其基本结构特征，同时又要很好地与大分子蛋白结合。本项目通过玉米赤霉烯酮小分子结构改造获得具有氨基官能团的半抗原，与牛血清白蛋白（BSA）偶联合成免疫原，与卵清蛋白（OVA ）偶联合成包被原。将玉米赤霉烯酮与 1,3-丙二胺反应得到具有氨基官能
16、团的半抗原，合成路线如下：取玉米赤酶烯酮 32mg，1,3-丙二胺 0.1mL 及少量 4-二甲氨基吡啶加入 5mL 干燥的二甲基甲酰胺中，作为 A 液；取 N,N-二环己基碳二亚胺 40mg 溶解于 1mL 干燥的二甲基甲酰胺，作为 B 液；0条件下缓慢滴加 B 液于 A 液中，滴加完毕后自然升温至室温，继续反应 24h。蒸除溶剂，柱层析纯化后得到羧丙基玉米赤霉烯酮，即为玉米赤霉烯酮半抗原。2、人工抗原的合成及鉴定（1）免疫原的合成将玉米赤霉烯酮半抗原与 BSA 进行偶联得到免疫原。具体操作如下：取 7mg 半抗原，溶解于 1mL 二甲基甲酰胺中；取戊二醛水溶液 0.1mL，加入半抗原5溶液
17、中，室温下搅拌 24h，即可得到反应液 A；称取 BSA 30mg，使之充分溶解在 2.7mL 0.1mol/L CB（pH 9.6）中，将反应液 A 逐滴缓慢滴加到 BSA 溶液中，并于室温下搅拌24h，用 5mol/L 的硼氢化钠水溶液 0.2mL 进行还原反应 4h，用 0.01mol/L PBS 4透析3d，每天换透析液 3 次，得到玉米赤霉烯酮免疫原。（2）包被原的合成将玉米赤霉烯酮半抗原与 OVA 进行偶联得到包被原。具体操作如下：取 7mg 半抗原，溶解于 1mL 二甲基甲酰胺中；取戊二醛水溶液 0.1mL，加入半抗原溶液中，室温下搅拌 24h，即可得到反应液 A；称取 OVA
18、30mg，使之充分溶解在 2.7mL 0.1mol/L CB（ pH 9.6）中，将反应液 A 逐滴缓慢滴加到 OVA 溶液中，并于室温下搅拌24h，用 5mol/L 的硼氢化钠水溶液 0.2mL 进行还原反应 4h，用 0.01mol/L PBS 4透析3d，每天换透析液 3 次，得到玉米赤霉烯酮包被原。（3）玉米赤霉烯酮免疫原与包被原的鉴定一般通过紫外扫描法鉴定半抗原与载体蛋白的偶联是否为有效偶联，因为半抗原与蛋白在紫外下有不同的特征吸收，当偶联成功时，偶联物的紫外吸收会有二者的迭加效应出现，因此比着单独的蛋白特征吸收会发生一定的偏移，可用于检测偶联是否成功。偶联比的测定用 pH7.4 的
19、 PBS 溶液稀释玉米赤霉烯酮半抗原、牛血清白蛋白、卵清蛋白和两种蛋白与玉米赤霉烯酮半抗原的结合物，配制成一定浓度的溶液，然后用紫外分光光度计进行全波长扫描，得到它们的紫外吸收光谱图。根据公式 K=A/CL 分别计算出玉米赤霉烯酮半抗原、牛血清白蛋白、卵清蛋白的摩尔消光系数。在载体蛋白和玉米赤霉烯酮半抗原的最大波长处检测偶联物的光吸收值，按公式计算两种物质在偶联物中的摩尔浓度比，即偶联比：Ca/Cb=（A 偶 264KBSA280-A 偶 280 KBSA264）/（A 偶 280KZEN 264-A 偶 264KZEN 280）蛋白含量的测定将偶联物稀释到适当倍数后，测定 280nm 和 2
20、60nm 的分光光度值，按公式计算蛋白的浓度即偶联物的浓度：蛋白质（mg/mL）=1.45OD 280-0.74OD260免疫原和包被原的鉴定结果通过紫外扫描法鉴定半抗原与载体蛋白的偶联是有效偶联，根据玉米赤霉烯酮半抗原、载体蛋白、偶联物在特定波长的摩尔吸光系数估算半抗原与载体蛋白的结合比分别为 14:1和 17:1，偶联效果较好。3、抗体的制备（1）动物免疫用无菌 pH7.0 的 PBS 液将合成的免疫原溶解，然后按免疫原（ZEN 半抗原-BSA）与6弗氏佐剂（FCA）1:3 的比例充分乳化制成油乳剂疫苗。首次免疫用弗氏完全佐剂疫苗，对810 周龄 Balb/c 小鼠进行免疫，颈背部皮下多点
21、注射，免疫剂量为 150g/只。14 天后二免，采用弗氏不完全佐剂（FICA） ，免疫剂量同上；28 天后三免，采用弗氏不完全佐剂，免疫剂量同上；31 天后加强免，不加佐剂，直接采用玉米赤霉烯酮半抗原-BSA 免疫。免疫过程见表 2。表 2 动物免疫过程免疫过程 免疫原 免疫剂量/(g/ 只) 间隔时间首免 ZEN半抗原-BSA（FCA ） 150 -二免 ZEN半抗原-BSA（FICA ） 150 14天三免 ZEN半抗原-BSA（FICA ） 150 14天加强免（融合前三天） ZEN半抗原-BSA 100 3天（2）单克隆抗体的制备 饲养细胞制备：断颈处死 810 周龄 Balb/c 小
22、鼠，浸泡在 75%酒精中 5min，随即放入超净工作台内，腹部朝上放于平皿内或固定于解剖板上。用眼科镊子夹起小鼠腹部皮肤，用剪刀剪一小口，注意切勿剪破腹膜，以免腹腔液外流和污染。然后用剪刀向上下两侧做钝性分离，充分暴露腹膜。用酒精棉球擦拭腹膜消毒。用注射器吸取 5mL RPMI1640 基础培养液，注入小鼠腹腔，轻轻抽回注射器，晃动小鼠腿部和尾部几次。用原注射器抽回腹腔内液体，注入离心管。如此反复操作 34 次。1000r/min 离心 10min，弃上清。用2050mL 完全培养液重悬细胞， 100L/孔滴加到培养板，置培养箱备用。脾细胞制备：加强免疫后 3 天，取免疫 Balb/c 小鼠一
23、只，眼眶采血后脱臼处死，在 75%酒精中消毒后取脾脏，去除结缔组织，制备脾细胞悬液，转移到 50mL 离心管中，加RPMI1640 至 30mL，15002000r/min 离心 5min，弃上清，加 RPMI1640 至 30mL，计数待用。骨髓瘤细胞制备：取 3 瓶生长状态良好的（活细胞数95%）骨髓瘤细胞，将之完全吹下，转移到 50mL 离心管中，加 RPMI1640 至 30mL，15002000r/min 离心 5min，弃上清，加 RPMI1640 至 30mL，计数待用。细胞混合：脾细胞:骨髓瘤细胞 =8:1，混合，15002000r/min 离心 5min。 细胞融合：将混合好
24、的细胞离心，倒干上清，把沉淀细胞块弹成糊状，置 37水浴，在 1min 内加入 1mL 融合剂，融合剂为聚乙二醇（ PEG）4000，作用 2min，并轻轻搅拌细胞，在随后 4min 内加入 20mL 无血清的 PEG 营养液，1000r/min 离心 10min，弃上清。用2050mL 完全培养液重悬细胞，铺种于含饲养细胞 96 孔细胞培养板，每孔 100L，置培养箱中。上清检测：待细胞长至孔底的 1/21/3 时，采用间接竞争 ELISA 法测定细胞上清液，筛选阳性孔。将阳性细胞在检测后 2 天内采用有限稀释法进行亚克隆。1014 天后，再取细胞上清检测，最终得到了稳定分泌玉米赤霉烯酮的单
25、克隆杂交瘤细胞株，将此细胞株进7行扩大培养和传代。老鼠致敏：液体石蜡致敏 Balb/c 小鼠，68 周，注射体积 500L/只。10 天后可制备腹水。注射细胞：收集杂交瘤细胞并用 1640 洗细胞两遍，取 100 到 150 万细胞注射于老鼠腹腔，一周后可见老鼠状态不活跃并且老鼠的腹腔肿大。腹水采集：注射细胞一周后对腹腔肿大的老鼠用无菌注射器于老鼠腹腔采集腹水，每隔一到两天采集一次，这样多次反复采集直到老鼠自然死亡。单抗纯化：采集到的腹水，用辛酸-饱和硫酸铵法进行纯化，纯化后的腹水放入-20 环境保存，腹水在使用前经过 0.01mol/L NaCl 于 4环境下透析 48h，中间每隔 68h
26、换液一次。4、胶体金的制备（1）玻璃器皿的准备用于实验的所有玻璃器皿在实验之前需要彻底清洁：将玻璃器皿先用自来水冲洗去除玻璃器皿表面的灰尘，用酸液浸泡 36h 后，取出，用自来水洗净酸液，再用蒸馏水洗 34次，再用去离子水把每个玻璃器皿洗三次，烤箱烘干后备用。专用的玻璃器皿用第一次生成的胶体金稳定其表面，弃去后以双蒸水洗净，可以减少金颗粒的吸附，玻璃器皿的表面污染会干扰金颗粒的生成。（2）柠檬酸三钠还原法取0.01%氯金酸水溶液100mL置于锥形瓶中，用恒温电磁搅拌器加热至沸腾，在持续高温、持续搅拌的情况下加入1% 柠檬酸三钠水溶液2mL ，继续匀速搅拌加热15min，溶液呈透亮的红色。室温冷
27、却，用去离子水恢复到原体积，4保存。（3）胶体金的质量鉴定肉眼观察：用肉眼观察制备的胶体金，其颜色为酒红色、均匀度较好无杂质、透明度较高，说明胶体金质量较好，结果见图1。图 1 肉眼观察胶体金颜色8紫外扫描鉴定：取冷却后的胶体金溶液进行400600nm 紫外扫描，确定最大吸收峰波长，观察最大吸收峰的峰形、峰宽，结果见图2。其图谱中最大吸收峰的峰宽较小，说明胶体金颗粒分布比较均匀，最大吸收峰波长为523nm 。图 2 胶体金的紫外/可见分光光度计扫描图透射电镜鉴定：透射电镜下观察胶体金颗粒的大小是否均匀一致，有无椭圆形及多角形。拍片放大后测量胶体金颗粒直径大小，取多个点计算胶体金颗粒的平均直径。
28、胶体金颗粒的透射电镜扫描图片见图3。由图3可知，在透射电镜下观察到胶体金颗粒的大小基本一致，没有椭圆形、多角形的金颗粒。将照片扫描后转换成电子版图片，放大后测量胶体金颗粒直径大小。随机挑选10个胶体金颗粒通过计算得到金颗粒平均直径为(200.5)nm。图 3 胶体金电镜扫描图片（4）胶体金溶液的准备用0.1mol/L K2CO3调节胶体金溶液的 pH值为7.2。由于金颗粒容易吸附于电极上使之堵塞，故不能用pH计测定胶体金溶液的 pH值，一般使用精密 pH试纸。5、胶体金标记抗体的制备（1）稳定胶体金最适抗体用量的选择以目测法确定稳定胶体金的最适抗体用量。用0.1mol/L K2CO3调节胶体金
29、溶液pH 为7.2，分装9管，每管1mL。待标记的抗体溶液用0.01mol/L ，pH7.6 的磷酸盐缓冲液作系列稀释为50400g/mL ，分别取0.1mL加入28管的胶体金溶液中。第1管加0.1mL三蒸水，混匀。静置5min后，在上述18管中加入0.1mL 10%NaCl溶液，第9管加0.1mL三蒸水，混匀后静9置2h，观察结果。稀释后抗体和其他试剂操作步骤见表3，结果见表4和图4。表 3 最适蛋白用量操作步骤管数试剂1 2 3 4 5 6 7 8 9抗体加样量（mL） 0.1 0.1 0.1 0.1 0.1 0.1 0.1 0.1 0.1抗体浓度（g/mL） 0 50 100 150 2
30、00 250 300 350 400胶体金（mL） 1.0 1.0 1.0 1.0 1.0 1.0 1.0 1.0 1.0摇匀，静置 5min10% NaCl（ mL） 0.1 0.1 0.1 0.1 0.1 0.1 0.1 0.1 0摇匀，静置 2h 后，观察结果备注：第1管为没有加入抗体的对照管，其内加入0.1mL三蒸水，第9管为没有加入氯化钠的对照管，其内加入0.1mL三蒸水。表 4 目测法确定稳定胶体金最适蛋白用量管号 1 2 3 4 5 6 7 8 9蛋白添加量（g） 0 5 10 15 20 25 30 35 40终颜色 蓝灰 蓝灰 蓝灰 红蓝 红 红 红 红 红图 4 胶体金与抗
31、体比例试验结果由表4和图4可知，未加抗体蛋白（1管）和加入抗体蛋白的量不足以稳定胶体金的24管，呈现由红变蓝的聚沉现象；未加入氯化钠的9管颜色不发生变化；而加入抗体蛋白量达到或超过稳定胶体金的最小蛋白用量的58管保持红色不变。其中含抗体蛋白量最低的5号试管即含稳定1mL胶体金所需的最小蛋白用量。在此基础上再增加20%即为待标记抗体蛋白的实际用量，即稳定胶体金的实际蛋白用量为每1mL胶体金溶液中添加24g 抗体蛋白。（2）胶体金标记抗体程序在磁力搅拌下，用0.1mol/L K2CO3调节胶体金的pH 至7.2，按每毫升胶体金溶液中加入抗体24g的标准向胶体金溶液中加入玉米赤霉烯酮单克隆抗体，搅拌
32、混匀10min ，加入10% 10BSA使其在胶体金溶液中的终浓度为1% ，静置10min。12000r/min，4离心40min，弃上清液，沉淀物用体积为初始胶体金体积1/10 的金标抗体稀释液（含0.5%的牛血清白蛋白、0.3%的表面活性剂、10%的蔗糖，pH7.2的0.02mol/L磷酸盐缓冲液）重悬，置 4环境中备用。（3）胶体金标记抗体的鉴定将羊抗鼠二抗点样于NC膜上，直接与金标抗体作用，可见有明显的粉红色斑点，表明金标抗体有活性。（三）胶体金免疫方法的建立1、固相载体的选择（1）吸水垫的选择取厚度为 2.59nm，质地均匀的 Cotton linters300 作为吸水垫组装试纸条
33、，滴加样品后5min 观察吸水垫的情况，样品吸收速度较快，故选择 Cotton linters300 作为吸水垫。（2）硝酸纤维素膜的选择将抗原适当稀释后通过点样方式分别包被在 milipore135、UnisartCN 140 和 mdi 70 三种 NC 膜上，经干燥、组装试纸条后，置于阴性样品中测试观察样品层析速度和检测线显色情况，结果见表 5。表 5 NC 膜点样显色结果NC 膜型号 millipore 135 UnisartCN 140 mdi 70显色情况 注：，表示着色很深，与背景反差很大；，表示着色较深或着色很深但与背景反差较小；，表示着色淡或着色较深但与背景反差很小；，表示没
34、有着色，或与背景色没有反差，表6-表22同此注释。由表5可知，不同孔径及厂家的NC膜点样后，均能显色，但显色程度略有不同， UnisartCN 140显色最深，milipore 135和mdi 70差别不大。不同NC膜组装的试纸条加样后样品展开速度和加样5min 后的检测线显色结果见表6。表 6 NC 膜层析显色结果NC 膜型号 millipore 135 UnisartCN 140 mdi 70试剂展开速度 较快 慢 快5min 后检测线显色情况 由表6可知，UnisartCN 140加入样品后层析速度较慢，5min内检测线显色最深，milipore 135试剂展开速度较UnisartCN 140快，但不及mdi 70。 milipore 135与mdi 70上检测线显色情况相差不多，但mdi 70背景颜色较浅。所以，综合层析速度与显色情况，三种NC膜中，mdi 70更符合试纸条设计要求。
