1、仪器分析实验 黄酮含量的测定,吸光光度法 是基于被测物质的分子 对光 具有选择吸收 的特性而建立的分析方法。,光的电磁波性质,一、物质对光的吸收与吸收光谱,光作用于物质时,物质吸收了可见光,而显示出特征的颜色,这一过程与物质的 性质及光的性质有关。,物质对光 的吸收,物质对光的吸收满足Plank 条件,吸收光谱 Absorption Spectrum,纯电子能态间跃迁,分子内电子跃迁,带状光谱,锐线光谱,定性分析与定量分析的基础,定性分析基础,定量分析基础,物质对光的选择吸收,在一定的实验条件下,物质对光的吸收与物质的浓度成正比。,二、溶液的吸光定律,透光率 (透射比),透光率定义:,T 取值
2、为0.0 % 100.0 %,全部吸收,T = 0.0 %,全部透射,T = 100.0 %,Lambert Beer Law:,K:吸光系数,入射光波长,物质的性质,温度,吸收定律与吸收光谱的关系,吸光定律,吸收光谱,吸光度的加合性,多组分体系中,如果各组分之间无相互作用,其吸光度具有加合性,即,对吸收定律偏离,主要原因,非单色光,吸光质点的相互作用,三、吸光分析仪的基本构造,光源,单色器,吸收池,检测器,显示,I0,It,参比,样品,未考虑吸收池和溶剂对光子的作用,单波长单光束分光光度计,单波长双光束分光光度计,实验二 黄酮类物质含量的测定,一 原理提要,黄酮类化合物是具有苯并吡喃环结构的
3、一类天然化合物的总称,一般都具有4位羰基,且呈现黄色。黄酮类化合物的3羟基、4羟基或5羟基、4羰基或邻二位酚羟基,与铝盐进行络合反应,在碱性条件下生成红色的络合物。本方法对样品中黄酮类化合物进行提取纯化后,用分光光度法于510nm波长下测定其吸光度,与芦丁标准品比较,进行待测物中总黄酮的定量测定。,3操作步骤 (1)样品处理1)固体样品:称取12g干燥的固体样品,用滤纸包紧,置于索氏提取器 中,加入50100ml70乙醇溶液浸润后,在80水浴下回流 3h,至提取液无色为止。粗提液冷却后,减压抽滤,并用少量 25乙醇溶液洗涤滤渣,合并滤液。在50下减压蒸馏,除去 其中的乙醇,直至索氏提取器内溶液
4、呈无醇味。倒出容器内溶 液,用30ml热水分3次洗涤,抽滤后,将滤液倒入分液漏斗 中,以75ml 氯仿分3次萃取脱脂,待完全分层后,收集各次下 层水溶液并定容至50ml。 2)液体样品:准确吸取1.0ml样品,定容至50ml后,直接以75ml 氯仿分3 次萃取脱脂,其余步骤同上。,(2)标准曲线的绘制:准确吸取芦丁标准溶液0、0.50、1.00、2.00、 3.00、00ml(相当于芦丁0、75、150、300、450、 600ug),移入10ml刻度比色管中,加入30乙醇溶 液至5ml,各加5亚硝酸钠溶液0.3ml,振摇后放置 5min,加入10硝酸铝溶液0.3ml摇匀后放置 6min,加1.0molL氢氧化钠溶液2ml,用30乙醇 定容至刻度。摇匀,放置15min,于510nm波长处测 定吸光度,以零管为空白,以芦丁含量(ug)为横 坐标,以吸光度为纵坐标绘制标准曲线,计算相关 系数(r)。,(3)样品测定:根据样品中总黄酮含量高低,取适宜体积待测 液,按标准曲线制备操作步骤于510nm处进行吸光度 的测定(样液如有沉淀,应过滤后测定)。 4.结果计算 根据标准工作曲线,求出相当于样品吸光度的芦 丁含量。,