1、方法一：1. 首先需要把细胞养在玻璃片上（悬浮细胞需要用多聚赖氨酸包被过的玻璃片）2. 然后在 4PFA 里面室温下固定 30 分钟，PBS 洗两次，0.1% TX-100 室温下作用 12 分钟使细胞膜通透。3. 接下来进行荧光标记，需要在一个大的容器（面 积大，扁平状的，比如大的培养皿）里面，放一张用水打湿的滤纸，以保持湿度。4. 剪一片合适大小的 parafilm，在上面滴上稀释在 1BSA/TBS 中的一抗（稀释倍数依具体抗体而定），每个玻璃片 30ul 足够，把玻璃片盖在上面（细胞面朝下），室温下孵育 30 分钟，然后在 PBS 里洗三次。5. 接下来二抗孵育步骤同上。6. 最后，在
2、载玻片加上 mounting medium（大约每个玻璃片加 10ul），把玻璃片放上去（细胞面朝下），37 度 30 分钟，然后就可以在荧光显微镜下观察了。7. 抗体很重要，不能有非特异性结合。你可以先做 WB 检测一下你的抗体，看看有没有 杂带。8. 双标的话，可以把两个一抗一起加或者分别标记两次（可以都 试一下看看那种方法合适）。如果一个抗体需要二抗，一个是直接荧光标记的，可以把 荧 光标记的那个和另外一个的二抗一起加。方法二：1. 选取一抗时要来源于两种不同的动物，我用的是来源于 rabbit 和 rat 的抗体，二抗则是不同荧光信号标记 的，我用的是 donkey anti-rabb
3、it-FITC（绿）和 donkey anti-rat-Tex-Red（红）。2. 我的做法是两种一抗同时孵育，然后两种二抗同 时孵育。抗体浓度、孵育时间要仔细摸索，我感觉一抗 4 度孵育过 夜比较好，背景比 较清晰。3. 我的阳性对照用的是阳性组织切片，阴性 对照则分别 是家兔和大鼠的 IgG，荧光标记物对照是 PBS+荧光 标记物。4. 封闭血清与二抗来源动物一致，我用的是 10%的正常 donkey 血清。5. 其余步骤同一般免疫荧光单标操作。方法三：1.片子的制作：可以做细胞爬片， 细胞甩片， 还有直接在 24well/12well/96well 中直接染色2.细胞爬片的制作：直接购买
4、公司的已经处理过的细胞爬片，要是自己制作的话，就用无菌的盖玻片用多聚赖氨酸处理后让细胞自己爬片3.细胞甩片：需要甩片机将细胞悬液均匀甩到玻片上。4.其实小的 well 的话，可以直接拿来染色，没 问题的。5.固定：用 PBS 洗去培养液，用固定液（如甲醇和丙酮；4%多聚甲醛；酒精。 。）固定细胞。6.内源性过氧化物酶处理，3%过氧化氢处理细胞（选作，二抗连 HRP 得必做，其他的如做免疫荧光染色不用做）。7.通透（胞浆蛋白和细胞核蛋白需要做；细胞膜蛋白不需要做），一般选用 Triton-X100 来做细胞通透，浓度和时间需要摸索，一般是 0.1-5%，处理时间为 1-30 分钟，级个别需要到1
5、-2 小时。8.封闭：洗去通透液，用二抗同源的血清约 10%的浓度 in PBS 中封闭半小时，也可以 选用 5-10%脱脂奶粉。封闭结束后千万不要洗，直接上一抗。9.一抗：具体你想做什么样的蛋白，咨 询抗体公司如 santa cruze,Abcam,sigma。选取具体的抗体，但是一抗的稀释浓度也是要摸索，抗体稀 释液可以购买 抗体公司现成的，对于新手还是挺好的。时间一般是 4 度过夜或者 37 度 1 小时。一抗最好还是选用外国抗体公司的抗体。10. 洗去一抗。11. 上二抗，二抗一般抗体公司会给你推荐的，你在其中 选 上一个就行了，自己选国产的也行，就是选在哪个动物体内做的一抗，二抗就选
6、抗那个动物的就行了。二抗的 浓度也是需要摸索的，抗体稀释液和一抗相同就行了。二抗的 时间一般是 37 度半小时。12. 底物显色（选作，二抗连得是 酶的必做，按 试剂盒的说 明书添加就行了，显色时间可能需要摸索，以免显色过度引起假阳性；二抗 连得是荧光报告的不用做）13. 洗去二抗，染核14. DAPI 或者 Hoechst 染核15. 洗去染核液，加 PBS，上镜观察。方法四：(1) 细胞准备。对单层生长细胞，在传代培养时，将细胞接种到预先放置有处理过的盖玻片的培养皿中，待细胞接近长成单层 后取出盖玻片， PBS 洗两次；对悬浮生长细胞，取对数生长细胞，用 PBS 离心洗涤(1000rpm，
7、5min)2 次，用 细胞离心甩片机制 备细胞片或直接制备细胞涂片。(2) 固定。根据需要选择适当的固定剂固定细胞。固定完毕后的细胞可置于含叠氮纳的 PBS中 4保存 3 个月。 PBS 洗涤 35 min。(3) 通透。使用交联剂(如多聚甲醛) 固定后的细胞，一般需要在加入抗体孵育前，对细胞进行通透处理，以保证抗体能够到达抗原部位。 选择通透剂应充分考 虑抗原蛋白的性质。通透的时间一般在 5-15min。通透后用 PBS 洗涤 35 min。(4) 封闭。使用封闭液对细胞 进行封闭， 时间一般为 30min。 (5) 一抗结合。室温孵育 1h 或者 4过夜。PBST 漂洗 3 次，每次冲洗
8、5min。 (6) 二抗结合。间接免疫荧光需要使用二抗。室温避光孵育 1h。PBST 漂洗 3 次，每次冲洗5min 后，再用蒸馏水漂洗一次。 (7) 封片及检测。滴加封片剂一滴，封片， 荧光显微镜检查。方法五：1 漂洗血清蛋白 PH7.2-7.4，37 度 PBS 2 小时.2 -20 度甲醇固定 20 分钟后，自然、干燥 10 分钟3 PBS 洗净：3min34 1%Triton：25min-30min.配成 50ultriton+5mlpBS5 PBS 洗净：25min6 羊血清封闭：37 度，20 分 钟7 一抗，4 度过夜，一般要大于 18 小时或者 37 度 1-2 小时8 4 度
9、 PBS 洗净，min5 次9 二抗 37 度小于一小时10 37 度 PBS 洗净，33min11 凉干封片（封闭液 PH8.5） 细胞免疫荧光步骤：1.细胞爬片；首先是玻片的处理，普通的盖玻片用砂 轮划成自己要的大小的小方 块，先用洗衣粉洗干净，用水冲静烤干，然后泡酸过夜，捞酸后流水洗净，烤干，置于器皿中高压灭菌，然后再烤箱中大约 8 小时烤干备用。爬片可以在培养皿 六孔板或 24 孔板中都可，我选择在培养皿中爬。一为节约经费（培养皿可以重复利用）二来觉得培养皿口大，操作比 较方便。培养皿消毒同上，消毒 时记得消两把镊子 具体操作是：用胰酶消化好细胞，充分吹打，使之成单细胞悬液（注意：这一
10、点很重要，关系到将来爬出来片子的质量）取出消毒的培养皿，可以先加少量培养基（以使玻片与培养皿紧密接触），将玻片小心放入 摆放其中，然后将单细胞悬液一滴一滴的滴到玻片上。最后盖上培养皿置于 37 度 5CO2 的暖箱中培养，根据细胞生长状况，24 小时或更长时间适时 取出爬片。爬片置于 37 度 PBS 中洗三次，每次 3 到 5 秒钟，然后在 4多聚甲醛中固定 15 分钟，然后再用 37 度去离子水将甲醛冲干净，注意手法 轻柔，要不然掉片很厉害。同时操作过程中注意玻片的正反面，要不然真的是前功尽弃。将做好的爬片置于滤纸上晾干，然后用中性 树胶粘在载玻片上。注意一定要等中性树胶彻底干了之后才能做
11、后续实验，要不然玻片会掉下来的，就又是前功尽弃了 做好的细胞爬片可以放在20 保存备用，具体能保存多 长时间不太清楚，当然尽量早用。2.4%多聚甲醛固定 10min(固定细胞器用预冷的 70%甲醇+30% 丙酮) ；3.PBS 漂洗 5min；4.0.5% Triton 穿孔 15min(丙酮固定法不用透化处理) ；5.PBS 漂洗 2 次，每次 5min；6.1%BSA 封闭 30min；7.加入 1%BSA 稀释的一抗，于 37杂交 2h；8.PBS 漂洗 2 次，每次 5min；9.加入 1%BSA 稀释的二抗，于 37杂交 1h；10.PBS 漂洗 2 次，每次 5min；11.5ug
12、/ml DAPI 染色 2min；12.抗淬灭封片剂封片。抗淬灭封片剂:2.5% DABCO (w/v)50mM Tris(pH8.0)90%甘油细胞免疫荧光细胞爬片4%多聚甲醛固定 10min(固定细 胞器用预冷的 70%甲醇+30%丙酮)PBS 漂洗 5min0.5% Triton 穿孔 15min(丙酮固定法不用透化处理)PBS 漂洗 2 次，每次 5min1%BSA 封闭 30min加入 1%BSA 稀释的一抗，于 37杂交 2hPBS 漂洗 2 次，每次 5min加入 1%BSA 稀释的二抗，于 37杂交 1hPBS 漂洗 2 次，每次 5min5ug/ml DAPI 染色 2min抗淬灭封片剂封片2.5% DABCO (w/v)抗淬灭封片剂 50mM Tris(pH8.0)90%甘油0.25g DABCO9ml 甘油0.5ml 1M Tris(Ph8.0) 70溶解，-20保存0.5ml ddH2O
