1、细胞爬片免疫荧光实验步骤第一天：1. 在培养板中将已爬好细胞的玻片用 PBS浸洗 3次，每次 3min；2. 用 4%的多聚甲醛固定爬片 15min， PBS 浸洗玻片 3次，每次 3min；3. 0.5%Triton X-100( PBS配制 )室温通透 20min（细胞膜上表达的抗原省略此步骤） ；4. PBS浸洗玻片 3次，每次 3 min，吸水纸吸干 PBS，在玻片上滴加正常山羊血清，室温封闭 30min；5. 吸水纸吸掉封闭液，不洗，每张玻片滴加足够量的稀释好的一抗并放入湿盒，4孵育过夜；第二天：6. 加荧光二抗： PBST 浸洗爬片 3次，每次 3min，吸水纸吸干爬片上多余液体后
2、滴加稀释好的荧光二抗，湿盒中 20-37孵育 1h，PBST 浸洗切片 3次，每次3min；注意：从加荧光二抗起，后面所有操作步骤都尽量在较暗处进行。7. 复染核：滴加 DAPI避光孵育 5min，对标本进行染核，PBST 5min4次洗去多余的 DAPI；8. 用吸水纸吸干爬片上的液体，用含抗荧光淬灭剂的封片液封片，然后在荧光显微镜下观察采集图像。细胞免疫荧光步骤 1.在 24 孔板里加 500 微升培养基，放爬片，接种细胞（做实验以 30-50%汇合度较好。10000-30000 左右 2.给药处理 24h。 3.PBS 洗三遍。 4. 4冷的多聚甲醛固定 15 分钟，PBS 洗三遍，每次
3、 5min，摇床。 （避光）5.0.5Triton X100（PBS 配）破膜 15min，PBS 洗三遍，每次 5min，摇床。6.5%BSA（牛血清白蛋白，PBS 配）封闭 60 分钟,不用洗。 7.加一抗孵育（5%BSA配），4摇床过夜。 8. 收集一抗，PBS 洗三遍，每次 5min，摇床。孵育二抗 Alexa Fluor 488（1:1000 ）,室温 60min（避光） 9. 回收二抗，PBS 洗三遍， 摇床，每次 5min。 10. 0.5ug/mLDAPI（5%BSA 配， 2 滴/ml）染核 15min。（避光） 11. PBS 洗三遍，每次 5min，摇床。 12.取载玻片
4、，滴加 10uL 抗 荧光衰减封片剂，将爬片有细胞面盖在封片剂上，指甲油封片子的对角线。 All steps for IF 1) Remove culture medium and fix cells (a common fixative is 4% formaldehyde in PBS, for 15 minutes) 2) Wash well in PBS (3 x 5 minutes is typical) 3) Permeabilize the cells (a common permeabilization reagent is 0.2% Triton X-100 in PBS f
5、or 30 minutes) 4) Wash well in PBS 5) (optional: Block for non-specific dye binding using the Image-iT FX Image Enhancer Solution, I36933) 6) Block for non-specific antibody binding 30-60 minutes (a common blocking solution would be 3-6% bovine serum albumin / 5% normal goat serum / PBS, or commerci
6、al blocking reagents like our BlockAid, product B10710) 7) Incubate in primary antibody for 30-60 minutes, in blocking solution or overnight at 4 degrees (antibody concentrations vary, but usually between 0.5-10ug/mL) 8) Wash well in PBS 9) Incubate in secondary antibody for 30-60 minutes, in 3-6% b
7、ovine serum albumin / PBS (a good starting antibody concentration is 5 ug/mL) 10) Wash well in PBS 11) Counterstain as needed (such as with DAPI, D1306) 12) Mount in appropriate mounting medium (for fluorescent secondaries, a good antifade solution is best, such as ProLong Gold, P36934, or SlowFade Gold, S36937)
