1、1， 基因组：一个细胞或病毒所包含的全部基因。2， 蛋白质组(Proteome)的概念最先由 Marc Wilkins 提出。定义：蛋白质组是由一个细胞，一个组织或一个机体的基因组所表达的全部相应的蛋白质。是一个整体概念。 3， 蛋白质组学：是一门以全面的蛋白质性质研究(如表达水平、转录修饰、相互作用等)为基础，在蛋白质水平对疾病机理、细胞模式、功能联系等方面进行探索的科学，包括表达蛋白质组学，细胞谱蛋白质组学以3， 等 电 聚 焦 ： 分 离 两 性 分 子 ， 特 别 是 分 离 蛋 白 质 的 一 种 技 术 。 根 据 在 一 个 电 场 的 影 响 下 这 些 两 性分 子 在 ph
2、 梯 度 上 的 分 布 情 况 进 行 分 离等电聚焦技术：在一个pH梯度和外加电场下，蛋白质有移向pH梯度中使其净电荷为零的点的倾向。（带正电荷移向阴极，带负电荷移向阳极）。IEF可以基于极微小的电荷差异而分离蛋白，具有高分辨率。4， 负 染 就 是 用 重 金 属 盐 （ 如 磷 钨 酸 、 醋 酸 双 氧 铀 ） 对 铺 展 在 载 网 上 的 样 品 进 行 染 色 ； 吸 去 染 料 ，样 品 干 燥 后 ， 样 品 凹 陷 处 铺 了 一 薄 层 重 金 属 盐 ， 而 凸 的 出 地 方 则 没 有 染 料 沉 积 ， 从 而 出 现 负 染 效果 （ 图 2-15） ， 分
3、辨 力 可 达 1.5nm 左 右5， 质谱（又叫质谱法）是一种与光谱并列的谱学方法，通常意义上是指广泛应用于各个学科领域中通过制备、分离、检测气相离子来鉴定化合物的一种专门技术。 质 谱 分 析 是 一 种 测 量 离 子 荷 质 比 （ 电 荷 -质 量 比 ） 的 分 析 方 法 ， 其 基 本 原 理 是 使 试 样 中 各 组 分在 离 子 源 中 发 生 电 离 ， 生 成 不 同 荷 质 比 的 带 正 电 荷 的 离 子 ， 经 加 速 电 场 的 作 用 ， 形 成 离 子 束 ，进 入 质 量 分 析 器 。 在 质 量 分 析 器 中 ， 再 利 用 电 场 和 磁 场
4、使 发 生 相 反 的 速 度 色 散 ， 将 它 们 分 别聚 焦 而 得 到 质 谱 图 ， 从 而 确 定 其 质 量 。 7， 分 子 离 子 峰 ： 子 受 电 子 束 轰 击 后 失 去 一 个 电 子 而 生 成 的 离 子 M+成 为 分 子 离 子 。 在 质谱 图 中 ， 由 M+所 形 成 的 峰 称 为 分 子 离 子 峰 。7.碎片离子峰 当电子轰击的能量超过分子离子电离所需要的能量（5070eV）时，可能使分子离子的化学键进一步断裂，产生质量数较低的碎片，称为碎片离子。在质谱图上出现相应的峰，称为碎片离子峰。碎片离子峰在质谱图上位于分子离子峰的左侧。研究最大丰度的离
5、子断裂过程，能提供被分析化合物的结构信息。8.软电离技术 在 质 谱 分 析 中 ， 离 子 源 是 将 分 子 离 解 成 离 子 或 解 离 成 碎 片 ， 在 这 里 分 子 失 去 电 子 ，生 成 带 正 电 荷 的 分 子 离 子 。 分 子 离 子 可 进 一 步 裂 解 ， 生 成 质 量 更 小 的 碎 片 离 子 。 由 于 离 子 化 所 需 要的 能 量 随 分 子 不 同 差 异 很 大 ， 因 此 ， 对 于 不 同 的 分 子 应 选 择 不 同 的 离 解 方 法 。 通 常 称 能 给 样 品 较 大能 量 的 电 离 方 法 为 硬 电 离 方 法 ， 而
6、给 样 品 较 小 能 量 的 电 离 方 法 为 软 电 离 方 法 ， 后 一 种 方 法 适 用 于 易破 裂 或 易 电 离 的 样 品 。9.源 内 衰 变 技 术 （ insource-decay， ISD） 源 内 衰 变 发 生 在 离 子 源 区 域 内 ， 时 间 为 激 光 撞 击 之 后 几百 纳 秒 之 内 ， 是 离 子 的 “即 可 片 段 化 ”。 这 些 片 段 离 子 通 过 衰 减 离 子 取 出 ， 能 在 线 性 飞 行 时 间 质 谱中 被 发 现 ， 许 多 蛋 白 质 和 大 的 肽 常 在 MOLDI-TOF-MS 的 离 子 源 区 域 内
7、变 成 肽 离 子 片 段 。 主 要 产 生 含N 端 的 b 型 和 含 C 端 的 y 型 片 段 离 子 ， 通 过 分 析 这 些 片 段 离 子 谱 可 鉴 定 蛋 白 质 。10. 肽 质 量 指 纹 图 谱 是 指 蛋 白 质 被 酶 切 位 点 专 一 的 蛋 白 酶 水 解 后 得 到 的 肽 片 段 质 量 图 谱 。 由 于每 种 蛋 白 质 的 氨 基 酸 序 列 都 不 同 ， 蛋 白 质 被 酶 水 解 后 ， 产 生 的 肽 片 段 序 列 也 各 不 相 同 ， 其 肽 混 合 物质 量 数 据 也 具 特 征 性 ， 这 种 特 征 就 像 指 纹 一 样
8、， 所 以 称 为 指 纹 谱 。 肽 质 量 指 纹 图 谱 可 用 于 蛋 白 质 的鉴 定 ， 用 实 验 测 得 的 PMF 与 蛋 白 数 据 库 中 的 蛋 白 质 理 论 PMF 比 对 ， 就 可 以 鉴 定 该 蛋 白 质肽 序 列 标 签 是 由 一 个 多 肽 的 部 分 氨 基 酸 序 列 和 该 肽 的 质 量 以 及 该 肽 未 测 序 部 分 的 质 量 等 组 成 。11.生物质谱就是运用现代质谱仪器解决生物学问题，如蛋白质测序，生物大分子分子量检测，磷酸化位点检测等生物质谱：主要用于小分子物质研究的质谱技术。它们具有高灵敏度和高质量检测范围。12. 基质辅助激
9、光解吸电离（matrix assisted laser desorption ionization, MALDI）在波长为7751250 nm 的真空紫外光辐射下产生光致电离和解吸作用，从而获得分子离子和含有结构信息的碎片，同时引入基质减少过分碎裂。基质辅助激光解吸电离技术适于结构复杂、不易汽化的大分子。一般采用固体基质，基质与样品比为 10000：1。根据分析物不同而使用不同的基质和波长电喷雾电离（Electrospray Ionizsation,ESI ） 利用强静电场从溶液直接产生气态离子化分子的一种方法采用强静电场（35kV ），以喷雾形式使液体样品形成高度荷电的雾状小液滴，小液滴经过
10、反复的溶剂挥发-液滴分裂后，产生单个带多电荷的离子，即在电离过程中，产生多种质子化离子。13. 蛋 白 质 芯 片 是 一 种 高 通 量 的 蛋 白 功 能 分 析 技 术 ， 可 用 于 蛋 白 质 表 达 谱 分 析 ， 研 究 蛋 白 质 与 蛋白 质 的 相 互 作 用 ， 甚 至 DNA 蛋 白 质 、 RNA 蛋 白 质 的 相 互 作 用 ， 筛 选 药 物 作 用 的 蛋 白 靶 点 等 。15. 亚 细 胞 蛋 白 质 组 学 内 涵针 对 细 胞 内 不 同 区 域 结 构 功 能 单 位 的 蛋 白 质 组 学 研 究 。 细 胞 内 成 分 根 据 空 间 结 构 、
11、 分 布 及 功能 不 同 ， 分 成 不 同 细 胞 器 或 细 胞 区 域 ， 如 细 胞 膜 、 胞 浆 、 线 粒 体 、 溶 酶 体 、 过 氧 化 物 酶 体 、 内 质 网 、高 尔 基 体 和 细 胞 核 等 。 另 外 ， 细 胞 器 内 一 些 功 能 单 位 多 是 大 分 子 结 构 体 或 多 蛋 白 复 合 体 ， 如 核 基 质 、剪 接 体 、 纺 锤 体 、 核 孔 结 构 以 及 核 糖 体 等 。16. 2D 双向电泳（two-dimensional electrophoresis ）是 等电聚焦电泳和 SDS-PAGE 的组合，即先进行等电聚焦电泳（按照
12、 pI 分离） ，然后再进行 SDS-PAGE（按照分子大小） ，经染色得到的电泳图是个二维分布的蛋白质图。二，简答题1. 质谱仪结构由 7 部分组成：进样系统、离子源室、质量分析器、检测器、数据处理系统、真空系统和供电系统。其中离子源室、质量分析器、检测器必须处于高真空状态，离子源要求 10-410-5Pa, 质量分析器要求 10-6Pa，以降低背景以及减少离子间或离子与分子的碰撞。进 样 系 统 ：把样品从室内常压转移到离子源。离子源室：把品分子转换成样品离子。（品离子是带有电荷的样品分子。最简单的形成样品离子的方法就是从中行分子里移除一个电子，这样就形成了正离子。样品分子必须变成样品离子
13、才能被质谱所分析。）在质量分析器里，电场或者磁场，或者两者都有的分析器，被用来控制样品离子的运动，这样便可根据其质量不同而将其分离。虽然有很多不同的质量分析器，但是都执行相同的功能：根据质量分离不同的离子。检测器可以感知已经被分离的离子的到达，放大极其微小的离子的电流以便进一步的电子处理。虽有很不不同类型的检测器，但作用都一样，就是检测离子并将其转换成较强的电信号。记录仪接受检测器的信号，将其放大并记录，这样就得到了质谱图。质谱要在真空系统运行。减少空气中成分的干扰。常真空度的范围是室内常压的百万分之一或者十亿分之一。离子源，质量分析器和检测器在真空系统里。2.质谱肽谱分析通过测定肽和蛋白质的
14、分子质量，加上已知蛋白和 DNA 序列的信息，来试探性的确认给定组织或体液中存在的肽和蛋白质。质谱肽谱分析分 4 步：（1）从生物组织提取多肽和蛋白质并分馏提取液（2）测定提取液中各组分的分子质量（3）从肽或蛋白质的计算机库中搜索被测的分子质量是否符合特定的肽或蛋白质的质量；（4）再确认分析，如部分 N 端或 C 端的测序分析、氨基酸分析或串联质谱分析，这些再确认分析的对象应是那些在（1）（3）步中仍不能十分确认的特定肽或蛋白质3.ESI 特点是产生多电荷离子而不是碎片离子，使质量电荷比（m/z）降低到多数质量分析仪器都可以检测的范围，因而大大扩展了分子量的分析范围，离子的真实分子质量也可以根
15、据质荷比及电荷数算出。目前可检测分子质量 100 000Da 以下的蛋白质，最高可达 150 000Da。优势就是它可以方便地与多种分离技术联合使用，如液一质联用（LCMS）是将液相色谱与质谱联合而达到检测大分子物质的目MALDLI 特点 1.MALDAI 源使用的激光是脉冲式，每一脉冲激光产生的离子都先经过一加速电场而获得动能，然后再进入一个高真空无电场飞行管道，离子在此无电场飞行管道内以在加速电场获得的速度匀速飞行。离子越小，飞行速度越快。每一脉冲激光产生一批离子得到一张质谱图，一般使用的是多次脉冲激光扫描质谱峰结果的累加。2.所产生的质谱图多为单电荷离子，因而质谱图中的谱峰与样品各组分的
16、质量数有一一对应关系。最适于分析多肽和蛋白质混合物，蛋白质序列分析，制作太指纹图谱，测量化合物分子量等，在基因领域的研究也可以应用于 DNA 序列测定、DNA 点突变、遗传病诊断等。3.MALDAI 源的离子化程度非常高，是灵敏度最高的质谱仪，能对极微量的样品（fmol-amol)进行分析的。4. 基本原理是将分析物分散在基质分子（尼古丁酸中及其同系物）并形成晶体，当用激光（337nm 氮激光）照射晶体时，基质分子吸收激光能量，又以热的形式将能量释放，样品解吸附，同时基质晶体升华，基质和样品分子气化进入质谱仪的气相。基质-样品间发生电荷转移使样品分子电离。 5. 基本原理 主要利用物质在流动相
17、与固定相之间的分配系数差异来实现分离。 6. 1.双向磷酸多肽图谱 2.高分辨率凝胶电泳 3.固相金属亲和色谱 4.反相高效液相色谱 5.毛细管电泳 6.免疫沉淀 7.化学修饰法 8.另外一种修饰手段，不仅可以用来研究磷酸化丝氨酸肽段和磷酸化苏氨酸肽段，还可以研究磷酸化酪氨酸肽段。这方法的显著特点是：通过碳化二乙胺的催化作用将胱氨酸加到磷酸基团上，再通过巯基乙胺与碘乙酰树脂柱的共价结合使磷酸化肽得以纯化。但肽的 N 端首先用叔丁氧羰基保护；C 端进行酰胺化保护，以免复杂反应产生。磷酸肽的洗脱是通过三氟乙酸切割氨基磷酸键完成的。碳化二乙胺方法在质谱分析前，需要多步化学反应和柱纯化过程，所以可能会
18、有大量的样品丢失，而且这种方法只适用于磷酸肽的富集，目前还没有应用于磷酸化蛋白质的富集 7. 原理:质谱是很好的蛋白质鉴定工具，但不同的蛋白质或多肽在质谱中有不同的离子化效率，所以不能从质谱图中对蛋白质进行定量分析。以稳定同位素为内标，将物理化学性质相同、质量不同的同位素掺入两种样品，混合后不同状态的相同蛋白质因质量差异在质谱图中表现为一对峰，通过比较质谱峰强弱，精确定位出蛋白质不同状态下表达量的变化。这就是基于稳定同位素标签和液相色谱与串联质谱联用技术定量和鉴定蛋白质的理论依据。 8. 线粒体的分离纯化基本原则：先制备组织或细胞匀浆，然后进行差速离心，低速去除细胞核及细胞碎片；高速离心分离线
19、粒体，有必要还可进行密度梯度离心。组织细胞的特异性及所要线粒体的实验用途决定了方法的细节。这些细节包括：匀浆器的选择、缓冲液的成分、许可混杂其他细胞器的程度等。通常用 Ficoll、Percoll、碘化介质（OptiPrep, Nycodenz, metrizamide）和蔗糖来形成密度梯度进一步纯化线粒体 纯度鉴定：分离线粒体时可能混杂其他细胞器，线粒体的相对纯度可以通过检测线粒体或其他可能存在的细胞器的标志酶来确定。线粒体纯度最好的方法之一是测定几种标志酶的活性。一方面可检测所分离的线粒体是否保留了其生物学功能，另方面检测其他细胞器污染程度如微粒体、溶酶体等。线粒体组分还可以通过电子显微镜
20、检查。 9. 1. 富集低丰度蛋白质，完善全细胞蛋白质组 2. 提供蛋白质的亚细胞定位信息 3. 加深对亚细胞组分的结构功能理解 4. 加深对细胞生理分子机制的理解 5. 亚细胞蛋白质组的差异表达谱 10. 1. 细胞器的蛋白质组学研究 2. 大分子结构体和多蛋白复合物的蛋白质组学研究 3. 酵母的亚细胞蛋白质组学研究 4.核蛋白质组的研究11， 蛋白质组学研究任务研究目的 分离蛋白，显示差异，将表现型与功能联系起来； 寻找蛋白质之间的相互作用，动态地反映生物体所处的状态。12，相互作用网络的研究技术等样品 样品制备样品分离蛋白质点提取鉴定功能确定 生物信息学 图像分析13，1）蛋白质组样品制
21、备基本原则尽可能提高样品溶解度，抽提最大量的总蛋白，减少蛋白质的损失解除蛋白质之间以及与其它生物大分子的相互作用，使蛋白质完全处于变性状态和还原状态减少对蛋白质以及蛋白质组的人为修饰（假点）总之：尽可能简单，减少步骤 14. 一、样品制备的前控制 1. 染色方法的选择 采用双向电泳等方法纯化蛋白质，往往需要染色后才能准确获得用于分析鉴定的样品。染色方法与蛋白质分析的灵敏度高度相关，染色效果十分重要。 2. 污染的控制(角蛋白)在蛋白质组学分析中，常见 a-角蛋白的污染，主要来自实验人员的皮肤屑和头皮屑。也有 b-角蛋白的污染，来自实验人员穿着的毛衣。 2）盐分和去污剂 在进行质谱分析前，应特别
22、注意样品中盐分和去污剂等含量对质谱分析的影响。MALDI-MS 分析技术可以耐受一定量的小分子杂质和盐类物质，但样品中含有表面活性剂或其他难溶盐分，则很难产生好的结晶。 二.样品的制备 操作步骤及注意事项： （1）切胶和脱色 切胶前用 ddH2O 洗胶 2 次，每次 15min. 用干净的刀片从胶上切取蛋白点，将胶块切成 1mm3 大小，放入 200ml Eppendorf 管内。切胶时尽量不要超出蛋白点的范围，胶块的大小要适当。胶块太小在以后的抽取步骤中可能被吸掉, 太大不利于脱色、酶切、抽取等步骤。 1）考马斯亮蓝染色凝胶的脱色 用 50% 乙腈/25mM NH4HCO3 脱至背景无色（也
23、有用 50%甲醇） 2）银染凝胶的脱色 30 mM 铁氰化钾与 100mM 硫代硫酸钠用前 1：1 混合。脱至无淡黄色溶液产生，吸去溶液，加ddH2O 冲洗。 脱色后的胶块用 100%乙腈脱水后，真空离心干燥 2030min15，一、微量凯氏（Kjeldahl ）定氮法含氮有机物与浓硫酸共热,即分解产生氨（消化），氨又与硫酸作用，变成硫酸铵。经强碱碱化使之分解放出氨，借蒸汽将氨蒸至酸液中，根据此酸液被中和的程度可计算得样品之氮含量。若以甘氨酸为例，其反应式如下：H2NCH2COOH+ 3H2SO4 ? 2CO2 + 3SO2 +4H2O +NH3 (1)2NH3 + H2SO4 ? (NH4)
24、2SO4 (2)(NH4)2SO4 + 2NaOH ? 2H2O +Na2SO4 + 2NH3 (3)为了加速消化，可以加入 CuSO4 作催化剂，K2SO4 以提高溶液的沸点。收集氨可用硼酸溶液，滴定则用强酸。计算所得结果为样品总氮量，如欲求得样品中蛋白含量，应将总氮量减去非蛋白氮即得。如欲进一步求得样品中蛋白质的含量，即用样品中蛋白氮乘以 6.25 即得。二、双缩脲法（Biuret 法）蛋白质含有两个以上的肽键，因此有双缩脲反应。在碱性溶液中，蛋白质与 Cu2+形成紫色络合物，此紫色络合物颜色的深浅与蛋白质含量成正比，而与蛋白质的相对分子量及氨基酸成分无关，故可用来测定蛋白质含量。测定范围
25、为 110ug 蛋白质。 ,三 Folin酚试剂法（ Lowry 法）这种蛋白质测定法是最灵敏的方法之一。过去此法是应用最广泛的一种方法，由于其试剂配制较为困难，近年来逐渐被考马斯亮兰法所取代。此法的显色原理与双缩脲方法是相同的，只是加入了第二种试剂，即 Folin酚试剂，以增加显色量，从而提高了检测蛋白质的灵敏度。四、紫外吸收法由于蛋白质分子中，酪氨酸和色氨酸残基的苯环含有共轭双键，因此蛋白质具有吸收紫外光的性质。吸收高峰在 280nm 处，其吸光度与蛋白质含量成正比，可用作定量测定。五、考马斯亮兰法（Bradford 法）考马斯亮蓝 G250 是一种染料，在游离状态下呈红色，当它与蛋白质结
26、合后变为青色。蛋白质含量在01000g 范围内，蛋白质一色素结合物在 595nm 下的吸光度与蛋白质含量成正比，故可用比色法测定。16，二维凝胶电泳基本原理第一向是等电聚焦，根据蛋白质等电点(pI)不同的分离第二向是SDS-PAGE，根据蛋白质分子量不同的分离。一般采用垂直电泳或水平电泳，两者差别不大，均适于分子量 10-150kd 的蛋白质。17，二维凝胶电泳图像分析主要步骤包括图像扫描、斑点检测、背景消减、斑点配比和数据库构建。18，作 用 原 理 聚 丙 烯 酰 胺 凝 胶 为 网 状 结 构 ， 具 有 分 子 筛 效 应 。 它 有 两 种 形 式 ： 非 变 性 聚 丙 烯 酰 胺
27、凝 胶 及 SDS-聚 丙 烯 酰 胺 凝 胶 （ SDS-PAGE） ； 非 变 性 聚 丙 烯 酰 胺 凝 胶 ， 在 电 泳 的 过 程 中 ， 蛋 白 质 能够 保 持 完 整 状 态 ， 并 依 据 蛋 白 质 的 分 子 量 大 小 、 蛋 白 质 的 形 状 及 其 所 附 带 的 电 荷 量 而 逐 渐 呈 梯 度 分开 。SDS 是 阴 离 子 去 污 剂 ， 作 为 变 性 剂 和 助 溶 试 剂 ， 它 能 断 裂 分 子 内 和 分 子 间 的 氢 键 ， 使 分 子 去 折 叠 ，破 坏 蛋 白 分 子 的 二 、 三 级 结 构 。 而 强 还 原 剂 如 巯 基
28、乙 醇 ， 二 硫 苏 糖 醇 能 使 半 胱 氨 酸 残 基 间 的 二 硫 键断 裂 。 在 样 品 和 凝 胶 中 加 入 还 原 剂 和 SDS 后 ， 分 子 被 解 聚 成 多 肽 链 ， 解 聚 后 的 氨 基 酸 侧 链 和 SDS结 合 成 蛋 白 - SDS 胶 束 ， 所 带 的 负 电 荷 大 大 超 过 了 蛋 白 原 有 的 电 荷 量 ， 这 样 就 消 除 了 不 同 分 子 间 的电 荷 差 异 和 结 构 差 异 。20SWISS-PROT 是 经 过 注 释 的 蛋 白 质 序 列 数 据 库 ， 由 欧 洲 生 物 信 息 学 研 究 所 (EBI)维
29、护 。 数 据 库 由 蛋白 质 序 列 条 目 构 成 ， 每 个 条 目 包 含 蛋 白 质 序 列 、 引 用 文 献 信 息 、 分 类 学 信 息 、 注 释 等 ， 注 释 中 包 括蛋 白 质 的 功 能 、 转 录 后 修 饰 、 特 殊 位 点 和 区 域 、 二 级 结 构 、 四 级 结 构 、 与 其 它 序 列 的 相 似 性 、 序 列残 缺 与 疾 病 的 关 系 、 序 列 变 异 体 和 冲 突 等 信 息 。 SWISS-PROT 中 尽 可 能 减 少 了 冗 余 序 列 ， 并 与 其 它30 多 个 数 据 建 立 了 交 叉 引 用 ， 其 中 包
30、括 核 酸 序 列 库 、 蛋 白 质 序 列 库 和 蛋 白 质 结 构 库 等 。 利 用 序 列 提取 系 统 (SRS)可 以 方 便 地 检 索 SWISS-PROT 和 其 它 EBI 的 数 据 库 。 SWISS-PROT 只 接 受 直 接 测 序 获 得的 蛋 白 质 序 列 ， 序 列 提 交 可 以 在 其 Web 页 面 上 完 成 。完 整 的 GenBank 数 据 库 包 括 序 列 文 件 ， 索 引 文 件 以 及 其 它 有 关 文 件 。 索 引 文 件 是 根 据 数 据 库 中 作者 、 参 考 文 献 等 建 立 的 ， 用 于 数 据 库 查 询
31、 。 GenPept 是 由 GenBank 中 的 核 酸 序 列 翻 译 而 得 到 的 蛋白 质 序 列 数 据 库 ， 其 数 据 格 式 为 FastA。 GenBank 中 最 常 用 的 是 序 列 文 件 。 序 列 文 件 的 基 本 单 位 是序 列 条 目 ， 包 括 核 苷 酸 碱 基 排 列 顺 序 和 注 释 两 部 分 。三 ， 论 述 题1， (1) 酵 母 双 杂 交 技 术酵 母 双 杂 交 系 统 的 建 立 是 基 于 对 真 核 生 物 调 控 转 录 起 始 过 程 的 认 识 。 细 胞 起 始 基 因 转 录 需 要 有 反 式转 录 激 活 因
32、 子 的 参 与 。 反 式 转 录 激 活 因 子 ， 例 如 酵 母 转 录 因 子 GAL4 在 结 构 上 是 组 件 式 的（ modular） ， 往 往 由 两 个 或 两 个 以 上 结 构 上 可 以 分 开 ， 功 能 上 相 互 独 立 的 结 构 域 （ domain） 构成 ， 其 中 有 DNA 结 合 功 能 域 (DNA binding domain,DNA-BD)和 转 录 激 活 结 构 域 （ activation domain， DNA-AD） 。 这 两 个 结 构 域 将 它 们 分 开 时 仍 分 别 具 有 功 能 ， 但 不 能 激 活 转 录
33、 ， 只 有 当 被 分 开的 两 者 通 过 适 当 的 途 径 在 空 间 上 较 为 接 近 时 ， 才 能 重 新 呈 现 完 整 的 GAL4 转 录 因 子 活 性 ， 并 可 激活 上 游 激 活 序 列 （ upstream activating sequence, UAS） 的 下 游 启 动 子 ， 使 启 动 子 下 游 基 因 得 到转 录 。 根 据 这 个 特 性 ， 将 编 码 DNA-BD 的 基 因 与 已 知 蛋 白 质 Bait protein 的 基 因 构 建 在 同 一 个 表 达 载 体上 ， 在 酵 母 中 表 达 两 者 的 融 合 蛋 白 B
34、D-Bait protein。 将 编 码 AD 的 基 因 和 cDNA 文 库 的 基 因 构 建在 AD-LIBRARY 表 达 载 体 上 。 同 时 将 上 述 两 种 载 体 转 化 改 造 后 的 酵 母 ， 这 种 改 造 后 的 酵 母 细 胞 的 基因 组 中 既 不 能 产 生 GAL4， 又 不 能 合 成 LEU、 TRP、 HIS、 ADE， 因 此 ， 酵 母 在 缺 乏 这 些 营 养 的 培 养 基上 无 法 正 常 生 长 。 当 上 述 两 种 载 体 所 表 达 的 融 合 蛋 白 能 够 相 互 作 用 时 ， 功 能 重 建 的 反 式 作 用 因
35、子 能够 激 活 酵 母 基 因 组 中 的 报 告 基 因 HIS、 ADE、 LACZ、 MEL1， 从 而 通 过 功 能 互 补 和 显 色 反 应 筛 选 到 阳性 菌 落 。 将 阳 性 反 应 的 酵 母 菌 株 中 的 AD-LIBRARY 载 体 提 取 分 离 出 来 ， 从 而 对 载 体 中 插 入 的 文 库 基因 进 行 测 序 和 分 析 工 作 。 酵 母 双 杂 交 的 优 点 快 速 获 得 相 互 作 用 蛋 白 的 基 因 只 需 单 一 步 骤 的 质 粒 构 建 在 体 内 鉴 定 蛋 白 的 相 互 作 用 弱 小 的 ， 暂 时 的 相 互 作
36、用 也 能 鉴 定 能 在 整 个 时 间 段 积 聚 弱 小 的 相 互 作 用 信 号缺 点 假 阳 性 是 酵 母 双 杂 交 系 统 的 最 大 问 题 假 阳 性 通 常 由 以 下 原 因 造 成 :1. prey 蛋 白 的 非 特 异 性 结 合2. 无 需 与 诱 饵 蛋 白 结 合 就 能 诱 导 报 告 基 因 的 转 录 （ 这 是 大 多 数 假 阳 性 的 诱 因 ）（ 2） 噬 菌 体 展 示 技 术噬 菌 体 展 示 技 术 是 在 深 刻 理 解 噬 菌 体 遗 传 学 和 生 理 学 特 性 的 基 础 上 产 生 的 。 其 原 理 是 将 蛋 白 质文
37、库 整 合 到 一 个 简 单 的 噬 菌 体 颗 粒 中 ， 利 用 目 的 蛋 白 质 与 特 异 配 基 的 亲 和 力 ， 筛 选 和 配 基 特 异 结 合的 蛋 白 质 。 噬 菌 体 展 示 技 术 一 般 要 经 过 多 轮 的 筛 选 ， 这 样 就 可 以 得 到 在 文 库 中 含 量 很 低 的 与 配 基 特异 作 用 的 蛋 白 质 。优 点 1. 高 度 选 择 性 2. 可 以 构 建 大 的 噬 菌 体 文 库 （ 1091010） ， 亲 和 纯 化 可 在 高 浓 度 下 进 行 （ 大 于 103 噬 菌体 /ml） 3. 通 过 改 变 洗 脱 步 骤
38、 的 严 格 性 ， 来 评 价 融 合 蛋 白 结 合 的 特 异 性 。 缺 点 ： 1. 多 价 展 示 对 于 肽 段 大 小 的 限 制 2. 蛋 白 质 能 被 细 菌 分 泌 3. 体 外 实 验 ， 蛋 白 质在 细 菌 内 无 法 正 确 折 叠 4.融 合 蛋 白 会 影 响 蛋 白 本 身 的 活 性 (3)蛋 白 质 亲 和 层 析 （ Pull-down)在 一 定 的 条 件 下 ， 某 种 蛋 白 质 共 价 连 接 在 基 质 如 琼 脂 糖 上 ， 用 以 结 合 抽 提 物 中 能 与 该 蛋 白 结 合的 配 体 蛋 白 。先 用 低 盐 溶 液 洗 脱
39、下 未 结 合 的 蛋 白 质 ， 再 用 高 盐 溶 液 或 SDS 洗 脱 下 结 合 在 柱 子 上 的 蛋 白 质 。蛋 白 质 需 要 纯 化 ， 通 常 简 单 方 法 是 构 建 融 合 蛋 白 ， 常 用 的 谷 胱 甘 肽 S 转 移 酶 （ GST)， 可 用 谷 胱 甘肽 -琼 脂 糖 柱 纯 化 ； Staphylococcus 蛋 白 A 在 IgG 柱 上 纯 化 ； 含 His6-Tag 的 肽 段 在 镍 柱 上 纯 化 ；麦 芽 糖 结 合 蛋 白 可 在 含 直 链 淀 粉 的 柱 子 上 纯 化 。优 点 :(1)灵 敏 度 高 ， 在 高 浓 度 固 定
40、 蛋 白 质 条 件 下 可 检 测 微 弱 的 相 互 作 用 （ 结 合 常 数 ： 10-5mol/L, 生 理 上 相 关 的 最 微 弱 的 相 互 作 用 在 10-3mol/L)(2) 可 以 同 时 检 测 抽 提 物 中 所 有 的 蛋 白 ， 它 们 结 合 机 会 均 等(3) 通 过 构 建 突 变 体 ， 可 以 检 测 与 特 异 性 相 互 作 用 有 关 的 蛋 白 质 结 构 域 或 关 键 的 氨 基 酸 残 基(4) 检 测 多 亚 基 蛋 白 质 间 的 相 互 作 用 假 阳 性 ：（ 1） 电 荷 间 的 相 互 作 用 使 蛋 白 质 与 检 测
41、蛋 白 质 结 合 ， 可 以 利 用 带 相 同 电 荷 的 对 照 柱 来 消 除（ 2） 通 过 B 蛋 白 ， A 蛋 白 与 检 测 蛋 白 间 接 结 合（ 3） 两 种 蛋 白 质 的 细 胞 定 位 不 同 ， 但 在 认 为 条 件 下 ， 却 能 高 特 异 性 结 合 。 (4)免 疫 共 沉 淀原 理 : 免 疫 共 沉 淀 （ Co-Immunoprecipitation） 是 以 抗 体 和 抗 原 之 间 的 专 一 性 作 用 为 基 础 的 用 于研 究 蛋 白 质 相 互 作 用 的 经 典 方 法 。 是 确 定 两 种 蛋 白 质 在 完 整 细 胞 内
42、 生 理 性 相 互 作 用 的 有 效 方 法 。 其 原 理 是 ： 当 细 胞 在 非 变 性 条 件 下 被 裂 解 时 ， 完 整 细 胞 内 存 在 的 许 多 蛋 白 质 蛋 白 质 间 的 相 互 作 用被 保 留 了 下 来 。 如 果 用 蛋 白 质 x 的 抗 体 免 疫 沉 淀 x， 那 么 与 x 在 体 内 结 合 的 蛋 白 质 y 也 能 沉 淀 下来 。 这 种 方 法 常 用 于 测 定 两 种 目 标 蛋 白 质 是 否 在 体 内 结 合 ； 也 可 用 于 确 定 一 种 特 定 蛋 白 质 的 新 的 作用 搭 档 。优 点 （ 1） 检 测 细 胞
43、 裂 解 原 液 中 所 有 蛋 白 质 与 检 测 蛋 白 质 的 相 互 作 用（ 2） 抗 原 、 抗 体 相 互 作 用 是 在 生 理 浓 度 下 被 检 测 的 ， 可 排 除 过 量 表 达 带 来 的 假 阳 性 。（ 3） 可 检 测 到 体 内 形 成 的 天 然 复 合 体（ 4） 天 然 蛋 白 质 如 果 经 过 翻 译 后 修 饰 ， 可 以 检 测 到 依 赖 于 或 不 依 赖 于 修 饰 的 蛋 白 质 相 互 作 用缺 点 ：（ 1） 有 时 免 疫 共 沉 淀 的 蛋 白 质 并 非 直 接 相 互 作 用（ 2） 灵 敏 度 不 高 ： 抗 原 浓 度
44、低(5) 化 学 交 联 法如 果 两 种 或 两 种 以 上 蛋 白 彼 此 间 存 在 特 异 性 的 亲 和 性 并 在 生 物 体 内 可 以 形 成 复 合 物 ， 可 以 用 该 法 研究 这 种 相 互 作 用 ， 尤 其 是 瞬 时 相 互 作 用 。使 用 一 种 交 联 试 剂 ， 并 且 在 交 联 试 剂 的 光 激 活 部 分 带 有 标 记 ， 将 该 试 剂 共 价 耦 联 到 一 蛋 白 质 上 ， 耦联 物 与 抽 提 物 一 起 温 育 。 若 抽 提 物 中 的 A 蛋 白 能 与 耦 联 蛋 白 质 发 生 相 互 作 用 ， 光 激 活 后 交 联 剂
45、 的一 部 分 就 结 合 到 A 蛋 白 上 。 加 入 还 原 剂 ， 切 割 交 联 试 剂 ， 使 A 蛋 白 带 有 交 联 剂 上 有 标 记 的 部 分 ，然 后 通 过 凝 胶 电 泳 等 方 法 分 析 该 蛋 白 。优 点 ：（ 1） 能 检 测 微 弱 的 相 互 作 用（ 2） 能 检 测 到 动 态 过 程 不 同 发 育 阶 段 与 不 同 蛋 白 质 的 瞬 时 相 互 作 用（ 3） 通 过 能 穿 膜 的 交 联 剂 。 交 联 可 在 体 内 进 行缺 点 ： 没 有 选 择 性2， 荧 光 双 向 差 异 凝 胶 电 泳 一 般 将 能 在 可 见 光 范
46、 围 内 强 烈 吸 收 和 辐 射 出 荧 光 的 染 料 称 为 荧 光 染 料 。 荧 光 染 料 实 质 上 是 颗 粒 很 细的 荧 光 染 料 的 树 脂 固 体 溶 液 ， 这 些 染 料 有 特 定 的 电 子 共 轨 体 系 。 荧 光 双 向 差 异 凝 胶 电 泳 是 在 双向 电 泳 的 基 础 上 出 现 的 技 术 ， 将 待 比 较 的 蛋 白 质 样 品 经 不 同 的 荧 光 染 料 标 记 后 ， 等 量 混 合 进 行 双 向电 泳 。 因 荧 光 染 料 灵 敏 度 高 ， 所 需 样 品 量 非 常 少 ， 每 次 只 需 50ug.一 张 胶 可 同
47、 时 分 析 3 个 样 品 ，省 去 了 不 同 胶 图 之 间 的 匹 配 问 题 ， 节 约 时 间 ， 重 复 性 提 高 。 还 可 以 对 大 样 本 量 进 行 统 计 分 析 ， 需 在 每 张 胶 中 加 入 由 所 有 样 品 等 量 混 合 而 成 的 内 标 ， 以 确保 各 张 胶 之 间 对 比 的 准 确 性 ， 以 最 大 限 度 反 映 生 物 学 改 变 而 不 是 系 统 改 变 。 由 于 所 需 的 胶 数减 少 ， 分 析 通 量 得 到 了 提 高 。（ 2） 细 胞 培 养 条 件 下 稳 定 同 位 素 标 签 技 术 （ stable iso
48、tope labeling with amino acids in cell culture,SILAC）培 养 条 件 下 稳 定 同 位 素 标 签 技 术 ， 是 通 过 细 胞 的 正 常 生 长 代 谢 ， 把 稳 定 同 位 素 标 记 的 氨 基 酸 引 入 到蛋 白 质 组 成 中 ， 质 谱 分 析 质 量 相 差 6u。 这 可 以 大 大 简 化 质 谱 定 量 分 析 前 人 工 处 理 的 复 杂 度 。 目 前 ，可 用 在 培 养 条 件 下 稳 定 同 位 素 标 签 技 术 上 的 稳 定 同 位 素 主 要 包 括 ： 2H、 13C、 15N 等 。除 了
49、 在 定 量 比 较 蛋 白 质 组 研 究 方 面 发 挥 作 用 外 ， 在 生 化 代 谢 、 信 号 通 路 以 及 蛋 白 质 间 相 互 作 用 动 力学 研 究 等 方 面 也 有 巨 大 的 潜 力 。缺 点 ： 只 能 用 在 基 于 培 养 的 细 胞 体 系 以 及 单 细 胞 生 物 上 。1.同 位 素 标 记 亲 和 标 签 技 术 的 原 理 同 位 素 标 记 亲 和 标 签 试 剂 由 3 部 分 组 成 ： 试 剂 与 蛋 白 质 反 应 的 基 团 ， 这 个 基 团 特 异 结 合 肽 链 中半 胱 氨 酸 残 基 的 巯 基 ； 中 间 的 连 接 子 ， 可 以 结 合 稳 定 的 同 位 素 ； 亲 和 标 签 -生 物 素 ， 可 以 和卵 白 素 结 合 ， 选 择 分 离 同 位 素 标 记 亲 和 标 签 标 记 的 多 肽 。 由 8 个 氘 原 子 与 8 个 氢 原 子 分 别 ICAT质 量 正 好 相 差 8u。（ 1） 优 点 兼 容 任 何 生 长 条 件 下 的 组 织 中 的 蛋 白 质 ， 比 较
