1、蛋白质组学蛋白质组学相关技术及发展文献综述蛋白质组学相关技术及发展文献综述 张粒 植物学 21107016 1 概念及相关内容 1994 年澳大利亚 Macquaie 大学的 Wilkins 和 Williams 等在意大利的一次科学会议上首次提出了蛋白质组 proteome 这个概念该英文词汇由蛋白质的 “prote”和基因组的“ome”拼接而成并且最初定义为“一个基因组所表达的蛋白质”1。然而这个定义并没有考虑到蛋白质组是动态的而且产生蛋白的细胞、组织或生物体容易受它们所处环境的影响。目前认为蛋白质组是一个已知的细胞在某一特定时刻的包括所有亚型和修饰的全部蛋白质 2。蛋白质组学就是从整体角
2、度分析细胞内动态变化的蛋白质组成、表达水平与修饰状态了解蛋白质之间的相互作用与联系提示蛋白质的功能与细胞的活动规律。 2 蛋白质组学的分类 蛋白质组学从其研究目标方面可分为表达蛋白质组学和结构蛋白质组学。前者主要研 究细胞或组织在不同条件或状态下蛋白质的表达和功能这将有助于识别各种特异蛋白 3 目前蛋白质组学的研究在这方面开展的最为广泛其运用技术主要是双相凝胶电泳 Two-dimensional gel electrophoresis2DE 技术以及图像分析系统 当对感兴趣的蛋白质进行分析时可能用到质谱。由于蛋白质发生修饰后其电泳特性将发生改变这些技术可以直接测定蛋白质的含量并有助于发现蛋白质
3、翻译后的修饰如糖基化和磷酸化等 4 。 结构蛋白质组学的目标是识别蛋白质的结构并研究蛋白质间的相互作用。近年来酵母双杂交系统是研究蛋白质相互作用时常用的方法同时研究者也将此方法不断改进 5。有研究者最近发现在研究蛋白质相互作用时通过纯化蛋白复合物并用质谱进行识别是很有价值的 4。 3 蛋白质组学相关技术 目前蛋白质组学研究在表达蛋白质组学方面的研究最为广泛其分析通常有三个步骤第一步运用蛋白质分离技术分离样品中的蛋白质第二步应用质谱技术或 N 末端测序鉴定分离到的蛋白质第三步应用生物信息学技术存储、处理、比较获得的数据。 3.1 蛋白质分离技术 这类技术主要是电泳其中应用最多的是双向电泳技术其他
4、还有 SDS-PAGE、毛细吸管电泳等。除了电泳外还有液相色谱通常使用高效液相色谱 HPLC 和二维液相色谱 2D-LC。 另外还有用于蛋白纯化、除杂的层析技术、超离技术等。 3.1.1 双相凝胶电泳 双相凝胶电泳 two-dimensional gel electrophoresis2DE 这是最经典、最成熟的蛋白质组分离技术产生于 20 世纪 70 年代中叶但主要的技术进步如实验的重复性、可操作性蛋白质的溶解性、特异性等是在近 lO 年取得的。它根据蛋白质不同的特点分两相分离蛋白质。第一相是等电聚焦 IEF 电泳根据蛋白质等电点的不同进行分离。蛋白质是两性分子根据其周围环境 pH 可以带正
5、电荷、负电荷或静电荷为零。等电点 pI 是蛋白质所带静电荷为零时的 pH 周围 pH 小于其 pI时蛋白质带正电荷大于其 pI 时蛋白质带负电荷。IEF 时蛋白质处于一个 pH 梯度中在电场的作用下蛋白质将移向其静电荷为零的点静电荷为正的蛋白将移向负极静电荷为负的将移向正极直到到达其等电点如果蛋白质在其等电点附近扩散那么它将带上电荷重新移回等电点。这就是 IEF 的聚焦效应它可以在等电点附近浓集蛋白从而分离电荷差别极微的蛋白。 pH 梯度的形成最初是在一个细的包含两性电解质的聚丙烯酰胺凝胶管中进行。在电流的作用下两性电解质可形成一个 pH 梯度。但由于两性电解质形成的 pH 梯度不稳定、易漂移
6、、重复性差 80 年代以后研究人员研制了固定 pH 梯度的胶条 IPG。此种胶条的形成需要一些能与丙烯酰胺单体结合的分子每个含有一种酸性或碱性缓冲基团。制作时将一种含有不同酸性基团的此分子溶液和一种含有不同碱性基团的此分子溶液混合两种溶液中均含有丙烯酰胺单体和催化剂不同分子的浓度决定 pH 的范围。聚合时丙烯酰胺成分与双丙烯酰胺聚合形成聚丙烯酰胺凝胶。 第二相是 SDS 聚丙烯酰胺凝胶电泳 SDS-PAGE 根据蛋白质的分子量不同进行分离。此相是在包含 SDS 的聚丙烯酰胺凝胶中进行。SDS 是一种阴离子去污剂它能缠绕在多肽骨架上使蛋白质带负电所带电荷与蛋白质的分子量成正比在 SDS 聚丙烯酰
7、胺凝胶中蛋白质分子量的对数与它在胶中移动的距离基本成线性关系。SDS-PAGE 装置有水平和垂直两种形式垂直装置可同时跑多块胶如 Amersham pharmacia Biotech 的 Ettan DALT II 系统可同时跑 12 块胶提高了操作的平行性。 经过 2DE 以后二维平面上每一个点一般代表了一种蛋白这样成千种不同的蛋白即可被分离有关蛋白质的等电点、分子量及每种蛋白的数量信息也可以得到。 蛋白质组学分析对 2DE 后的染色技术要求很高除了标准的敏感性要求外还要求染色技术的线性和均一性 6。目前有多种染色方法如考马斯亮蓝染色、银染色、及荧光染色等。银染比考马斯亮蓝染色灵敏度高已有学
8、者对这两种方法进行了比较如 PhillipCash 等在 检测肺炎链球菌红霉素敏感株和抵抗株表达的蛋白时用考马斯亮蓝 G-250 染色发现了 200 多种蛋白 PI 4-7 分子量 15000-110000 在相同的 PI 和分子量范围下用银染检测到 360 多种蛋白 7。但是银染的线性效果并不是很好并且对质谱分析干扰大。考马斯亮蓝染色线性、均一性较高 对质谱干扰较小 但其敏感性较低。较理想的是荧光染色 Thierrry Rabilloud 等比较了两种荧光剂 RuBps 和 Sypro Ruby 的效果发现其敏感性、线性都很好对质谱干扰小 6 但其成本较高。实验时可以根据不同的目的选用不同的
9、方法。 2DE 图像所产生的大量蛋白质点是单纯用肉眼分析无法完成。目前有多种图像分析软件可用于胶的图像分析如 MelanieII BioRad PD Quest BioRad Phoretix 2D Full 又称 2D Image Master Elite Amersham Pharmacia Biotech 等这些软件可以完成蛋白质点的识别、匹配等具有很强的分析功能但其缺点是需要很多的图像手工校对一般分析一个图像需要 8-10h。 2DE 是目前唯一的一种能溶解大量蛋白质并进行定量的方法具有高通量、重复性好、敏感性较高等优点 8。它能同时分离和定量数千种甚至上万种蛋白 8。它的分辨率极高等
10、电聚焦相可以区分 PI 相差 0.1 的蛋白质 SDS-PAGE 相可以区分分子量相差 1kD 的蛋白质 9。 其缺点是由于蛋白表达水平的差异较大一些低丰度的蛋白不易检测 810。另外某些基因的表达产物在 2D 胶中呈多点或不同基因的表达产物共点使 2D 胶数据的比较、定量更加复杂8。2DE 分离的蛋白数量受诸多因素影响疏水性的膜蛋白往往是药物设计最好的靶点很难用此法分离同时染色技术的灵敏度和线性范围不足以呈现所有分离的蛋白质。目前人们采用多种方法来减少这些缺点如通过增加上样量分离低丰度蛋白应用窄范围固定 pH 梯度胶条、蛋白层析等技术提高分离的蛋白数目应用荧光染色提高检测灵敏度等。 3.1.
11、2 双向荧光差异电泳 双向荧光差异电泳 twodimensional difference gel electrophoresis2DDlGE 2DDIGE 分析系统是在传统双向电泳技术的基础上结合了多重荧光分析的方法在同一块胶上共同分离多个分别由不同荧光标记的样品并第一次引入了内标的概念极大地提高了结果的准确性、可靠性和重复性。在 DIGE 技术中每个蛋白点都有它自己的内标且软件自动根据每个蛋白点的内标对其表达量进行校准这样可以很好地去除样品的假阳性差异点。DIGE 技术可检测到表达差异小于 10 的蛋白统计学可信度达到 95 以上。利用 Ettan DIGE技术还可以对微量少到 5g 样品
12、进行蛋白质组学分析。2D-DIGE 的具体操作过程与常规2DE 的步骤相似所不同的就是在样品制备时在每份样品中预先分别加入不同的荧光染料并且需要制作一个供其他样品比较的内参另外在电泳后的凝胶显色时需要在特殊的荧光检测 仪中进行。 3.1.3 液相色谱 高效液相色谱因具有分离效率高、分析速度快、检测灵敏度高和应用范围广等特点广泛应用于生产实践中。高效液相色谱是利用高压输液泵驱使带有样品的流动相通过装填固定相的色谱柱利用固液相之间的分配机理对混合物样品溶液进行分离的方法。例如对奶粉中三聚氰胺的检测 11。二维或多维液相色谱是将分离机理不同而又相互独立的两支色谱柱串联起来构成的分离系统。样品经过第一
13、维的色谱柱进入接口中通过浓缩、捕集或切割后被切换进入第二维色谱柱及检测器。二维液相色谱通常采用两种不同的分离机理分析样品即利用样品的不同特性把复杂混合物如肽分成单一组分这些特性包括分子尺寸、等电点、亲水性、电荷、特殊分子间作用亲和等。在一维分离系统中不能完全分离的组分可能在二维系统中得到更好的分离分离能力、分辨率得到极大的提高。完全正交的二维液相色谱峰容量是两种一维分离模式单独运行时峰容量的乘积。 3.2 目的蛋白点的筛选 对目的蛋白的筛选通常与双向电泳连用主要用来分析凝胶中分离出的蛋白质样品采用的主要技术手段通常是 Western 印迹和差异蛋白比较分析。 Western 印迹主要是将双向电
14、泳后的凝胶不经过染色而直接转印到固相支持物如 NC 膜、PVDF 膜等上再在膜上进行免疫学反应从而筛选出与免疫功能相关的蛋白差异蛋白比较分析则是先对凝胶进行染色然后应用软件如 Image Master、PDQuest 等对存在差异的 2 组凝胶进行比较从而找出差异的蛋白。在比较时通常要求每个被分析的样品重复 3 次然后先做组内比较再做组间比较。 3.3 蛋白质鉴定技术 对 2DE 所产生的上千个蛋白用传统的方法如 Edman 降解法等进行分析将是一个很艰巨的任务。质谱技术的发展解决了这一难题。 3.3.1 一级质谱 质谱技术的高速发展目前可以快速、高效地对目的蛋白进行鉴定且样品用量少通常达到微
15、克级。除此之外质谱技术还可以对蛋白质翻译后修饰进行分析。根据离子源的不同质谱主要包括基质辅助激光解析飞行时间质谱 MALDITOFMS、电喷射离子井飞行时间质谱 ESITOFMS。常用的质谱分析仪除了飞行时间 TOF 外还有四级杆 Q、离子井而在串联质谱中通常使用的是 QTOF 或 TOFTOF 等。 2 种离子源都可以使肽段、蛋白、药物的代谢产物、寡核苷酸等其他碳水化合物离子化进而被质谱仪分析。通常的质谱仪一般由样品槽、离子源、分析仪和检测器组成。 由于单一地依靠蛋白质相对分子质量并不能对目的蛋白进行理想的鉴定因此须事先用蛋白酶如胰蛋白酶将检测样品酶解成不同长度的肽段。在 MALDITOF质
16、谱中还需要向样品中加入基质以促使样品离子化离子化的确切基质目前还不清楚然后在离子源的作用激光激发下使样品变为气相离子。这些被激发的气相离子进入质量分析仪根据其荷质比而把肽段进行区分。质谱的整个过程都是在真空条件下进行的。ESI 则不需要基质辅助而是使用具有一定能量的电子直接作用于样品分子使其电离。 3.3.2 二级质谱 二级质谱同时将 2 个上述质谱连接在一起构成的串联质谱可以更精确、更灵敏地分析蛋白样品。二级质谱的使用使得质谱不仅可检测肽段的相对分子质量还可以检测它的氨基酸序列。利用质谱仪的第一个分析仪对蛋白样品进行初步检测从样品混合中选择特定的肽段再将这个特定的肽段与惰性气体如氮气、氩气等
17、碰撞从而将肽段进一步离解。在被选择的肽段与惰性气体发生能量碰撞时支持蛋白主链构象的化学键受到破坏碰撞后的结果再被第二级质谱分析仪分析。串联质谱又叫碎片谱或 MSMS 谱。在二级质谱中可以将差别只有 1 个氨基酸的相邻肽段区分开。因此通过分析临近峰的相对分子质量可以检测肽段的氨基酸序列旧。3.3.3 肽质量指纹图谱 肽质量指纹图谱 peptide InasfingerprintingPMF 当被离子化的肽段经过质谱仪时这些肽段因其相对分子质量的不同而被分离因此产生了含有不同峰值的肽质量指纹图谱。蛋白质鉴定便是通过对 PMF 的分析实现的即将所得到的 PMF 与已知数据库中一个蛋白的理论期望蛋白酶
18、肽段进行比较可以得到一个匹配程度得分当这个得分高于理论计算的得分时便认为该蛋白是理论中的蛋白。这些已知数据库在互联网上有很多其中NCBI 和 EBI 的数据库是最大的而且是免费的。在搜索这些数据库时需要使用搜索软件如Mascot、PepSea、PeptideSearch 等其中 Mascot 是最常用的软件。最近开发了一个新的程序Paragon 该程序克服了 Mascot 被动的、概率的、估计的搜索模式所带来的缺点被认为是Mascot 的替代者旧。 质谱技术能清楚地鉴定蛋白质并能准确地测量肽和蛋白质的分子量、氨基酸序列及翻译后的修饰。目前 MS/MS 是唯一能够迅速测序 N 末端封闭或共价修饰
19、肽段的方法 12。质谱技术很灵活能与多种蛋白分离、捕获技术联用对普通的缓冲液成分相对耐受 12 能快速鉴定大量蛋白质点而且很灵敏 10 在一些情况下仅需 10-15 fmol 的蛋白10139 这在只能得到极少量蛋白的情况下鉴别蛋白是很有用的。在实际工作中可将几种技术结合应用如串联质 谱与 Edeman 微测序技术相结合 12MALDI 质谱与纳米电子喷射质谱相结合 14 这些技术相互互补为分析 2DE 所分离的大量蛋白质提供了有效的手段。 质谱技术是一项强大的分离分析技术但它只能分离气体状态的带电分子而且一次只能分析带正电或带负电的分析物。质谱分析很难区分两种同源性极高的蛋白。由于质谱分析只
20、是描述蛋白的少量多肽因此可能把删节的蛋白当成是原来的蛋白。通常只适用于象酵母等基因组序列已知的个体。 3.4 酵母双杂交技术 酵母双杂交系统的建立得力于对真核生物调控转录起始过程的认识。细胞起始基因转录需要有反式转录激活因子的参与。转录激活因子在结构上是组件式的 modular 即这些因子往往由两个或两个以上相互独立的结构域构成 其中有DNA 结合结构域 DNA binding domain 简称为 DB 和转录激活结构域 activation domain 简称为 AD 它们是转录激活因子发挥功能所必需的。 单独的 DB 虽然能和启动子结合 但是不能激活转录而不同转录激活因子的 DB 和 A
21、D 形成的杂合蛋白具有激活转录的功能。DB与 AB 分别能与多肽 X 和 Y 结合由 DB 和 AD 形成的融合蛋白现在一般分别称之为“诱饵”bait 和“猎物”或靶蛋白 prey or target protein。 如果在 X 和 Y 之间存在相互作用 那么分别位于这两个融合蛋白上的 DB 和 AD 就能形成有活性的转录激活因子 从而激活相应基因的转录与表达。这个被激活的、能显示“诱饵”和“ 猎物”相互作用的基因称之为报道基因reporter gene。 通过对报道基因表达产物的检测 反过来可判别作为“诱饵”和“猎物” 的两个蛋白质之间是否存在相互作用 15。用酵母双杂交系统检测蛋白质之间
22、的相互作用通常会存在假阳性或假阴性的问题已有许多学者对此系统进行了改进并且将其扩展到检测 DNA-蛋白质 RNA-蛋白质小分子-蛋白质之间的相互作用上 16。 3.5 蛋白质样品的生物信息学分析 分子生物学的发展把生命活动的物质基础追溯到核酸和蛋白质两大类生物大分子它们构成了生物数据的主要部分。关于这些生物大分子的结构、相互作用和功能的研究也产生着大量数据。 3.5.1 蛋白功能的预测 蛋白功能的预测可以通过 3 条途径实现。首先通过与已知蛋白质序列相比较来检测蛋白的功能。此外蛋白质的一些其他性质可以直接由序列分析得到。比较常用的蛋白质序列数据库是 SwissProt、P1R 和 NCBI 的
23、 Blast 其次可以通过蛋白质的物理性质的预测。蛋白质 的一些功能特征可以通过蛋白序列直接推算出来通过组成蛋白质的 20 种氨基酸的物理和化学性质分析已知或未知蛋白质的性质如等电点相对分子质量、疏水性、跨膜螺旋、卷曲螺旋及信号肽等。除了上述 2 种方法外还可以与保守的基序和图形数据库比较判断功能。对于那些与数据库中已知功能蛋白质无同源性的序列或找到同源性的蛋白质功能为未知时我们可与保守的基序比较来判断其功能。基序数据库中最为常用的是网站 Prosite。 3.5.2 蛋白结构的预测 虽然有时蛋白质的序列相似但是却执行着不同的功能或同源基因编码的蛋白质虽然序列差别很大但是对于生物体来说执行的却
24、是同样的功能。这主要是因为蛋白质的空间结构发挥了作用。在 PDB 等数据库中可以检索到一些蛋白质高级结构的同源性。蛋白质二级结构预测的基本依据是每一段相邻的氨基酸残基具有形成一定二级结构的倾向。因此进行二级结构预测需要通过统计和分析发现这些倾向或者规律。蛋白质二级结构预测的方法有 3 种。一是由已知结构统计各种氨基酸残基形成二级结构的构象趋势其中最常用的是 Chou 和 Fasman 法二是基于氨基酸的物理化学性质包括堆积性、疏水性、电荷性、氢键形成能力等三是通过序列比对由已知三维结构的同源蛋白推断未知蛋白的二级结构。一般对于 螺旋预测精度较好对 折叠差些而对除 螺旋和 折叠等之外的无规则二级
25、结构则效果很差。蛋白质三维结构的预测是最复杂和最困难的预测技术。序列差异较大的蛋白质序列也可能折叠成类似的三维构象。由于蛋白质的折叠过程并不十分清晰从理论上解决蛋白质折叠的问题还有待进一步的科学发展但也有一些有一定作用的三维结构预测方法如与已知结构的序列比较、同源模建、threading 算法和折叠识别方法。 尽管生物信息学发展迅猛但是它仍然不能承载所有的研究信息。虽然通过在生物数据库网站内检索可以得到一定的分析结果但这个分析结果可能并不完整比如细菌中的有些蛋白不仅对于机体来说发挥正常代谢的功能而且该蛋白还具有一定的致病性而后者基本上无法通过生物信息学网站分析得到这就需要阅读大量的文献以获得更
26、完整的信息。 4 蛋白质组学的应用 蛋白质组学的应用为医学、生命科学等研究领域提供了新的思路并且带来了较为丰硕的结果。目前在原核生物、真核生物以及多细胞生物体研究中都有广泛应用。如对霍乱弧菌 17 以及大肠杆菌 18 在不同酸碱条件下蛋白表达的变化的研究表明这些病原菌会随环境的改变而调节蛋白表达以使其达到最大的致病能力。在真核生物研究方面 Michel Perrot 等用 2DE 及质谱、免疫杂交、微量测序等方法分离和鉴定了酿酒酵母的 401 种蛋白309 种以 前曾报道过剩余的 92 种是新发现的从而拓展了酵母参考图谱为研究细胞功能、酵母翻译因子靶点提供了条件 10。应用蛋白质组学技术还可能
27、实现癌症的早期诊断 120l。在致病微生物方面同样硕果累累。蛋白质组学的应用可以实现高通量、高效率地对样品进行分析并可以同时得到多个重要的研究结果。 5 存在的不足 尽管蛋白质组学应用前景广阔、研究成果丰硕但仍然存在许多不足。如 2DE 的灵敏度虽然已达 fmol 水平但仍难将细胞组织内多种痕量调控蛋白分离显示出来而此类蛋白对于基础与应用研究都极为重要甚至比高含量结构蛋白更为重要。此外现有质谱技术虽然在蛋白质组成分的鉴定中高效、灵敏、特异但仪器价格十分昂贵因此技术推广受到很大的限制。还有现今的蛋白质组研究仍局限于对已完成基因组计划的理论预测的蛋白质组进行实证分析闭。未来的蛋白质组学应该摆脱基因
28、组学的束缚在真正意义上实现蛋白质的体外合成、体外加工与修饰以及简单方便的蛋白测序与鉴定等。 6 展望 目前有约 60 种微生物的全基因组序列已经测出 DNA 序列信息仅提供了细胞运用其基因的所有可能方式的一种静态瞬间快照 蛋白质组学则研究基因编码的活动怎样发生和什么时候发生如蛋白翻译 以及非基因编码的活动之间的关系如蛋白质翻译后的修饰或蛋白质、核酸、脂类、糖类之的相互作用。因为实际蛋白数量反映了翻译的能力和效率、翻译后的修饰和每个蛋白的转化比率蛋白质组学分析给基因表达最终产物的研究提供了信息。因此它是对翻译水平等研究的一种补充是全面了解基因组表达必不可少的一种手段它的发展将给分子生物学领域带来
29、革命性变化。 参考文献 1 Wilkins M R Sanchez J CCooley A Aet a1Progress with proteome projects why all proteins expressed by a genome should be identified and how tO do itjBiotechnol Genet Eng Rev19961319-50 2 de Hoog C LMann MProteornics 们 Almu Rev Genomics Hum Genet20045267293 3 Anderson NL MathesonAD Steine
30、r S. Proteomics: applications in basic and applied biology. Current Opinion in Biology 2000 11:408-412. 4 Walter P. Blackstock Weir MP. Proteomics: quantitative and physical mapping of cellular proteins. Tibtech March 1999 17:121-127. 5 Cenciarelli C Chiaur DS Guardavaccaro D et al. Identification of a family of human F-box proteins
