1、第三讲 药物蛋白质组学 Pharmacoproteomics,一、概念和研究内容,Pharmacoproteomics: proteomics applied to pharmacology. 药物蛋白质组学：蛋白质组学与药学的学科交叉而逐渐形成新的研究领域。 研究内容： 临床前： 发现所有可能的药物作用靶点以及针对这些靶点的全部可能的化合物 应用蛋白质组学方法研究药物作用机制和毒理学 临床研究： 药物作用的特异蛋白作为患者选择有效药物的依据和临床诊断的标志物 应用类似于药物遗传学的方法，按照蛋白质谱来分类患者，给予个体化治疗，并预测药物疗效。,运用比较蛋白质组学的策略发现与药物作用相关的蛋白
2、质,二、药物作用靶点研究,通过研究比较疾病或药物作用的差异蛋白质表达谱，可发现影响疾病或药物作用的关键蛋白或生化途径，再综合分析蛋白质的生物学功能，便可推测新的、潜在的药物作用靶标。 直接发现和确认活性小分子药物的药靶： 小分子药物直接与蛋白质相互作用的蛋白质组技术，如亲和色谱法、酵母三杂交、蛋白质芯片、噬菌体展示技术、基于蛋白质活性的蛋白质组方法以及结构蛋白组学技术等。,药物作用靶点研究策略和方法,通过差异表达谱分析发现药物靶标 蛋白质活性表达谱（activity-based protein profiling, ABPP）分析 亲和色谱法(affinity chromatography)
3、直接分离活性小分子的结合蛋白 酵母三杂交系统鉴定药物靶点 噬菌体展示技术,通过差异表达谱分析发现药物靶标,2、蛋白质活性表达谱（activity-based protein profiling, ABPP）分析,activity-based probes（ABPs）：包含结合/反应基团和分析标签（如荧光素） 设计的探针分子仅结合蛋白（酶）的活性形式，因此通过测定荧光能间接测定蛋白活性。 优点是通过测定酶活性代替测定蛋白的结合或蛋白表达水平,PNAS August 6, 2002 vol. 99 no. 16 1033510340,Nature 422, 226-232 (13 March 20
4、03),3、亲和色谱法(affinity chromatography) 直接分离活性小分子的结合蛋白,基本原理：将活性小分子配体的某些功能基团（羧基或氨基）与水不溶性载体（树脂或琼脂糖珠）通过连接臂连接作为固定相，制成亲和吸附柱；然后将蛋白提取液或细胞裂解液通过亲和柱，用缓冲液充分洗涤非结合蛋白，与小分子配基亲和结合的蛋白留在柱上；最后通过干扰配基与靶蛋白相互作用的条件溶液（如蛋白变性溶液或用游离的配基竞争结合）解吸附结合于亲和柱上的蛋白。洗脱出来的蛋白通常可用凝胶电泳法鉴定后再用MALDI-TOF MS分析，或消化成多肽后用液质串联色谱（LC-MS/MS）分析，也可进行免疫分析。,成功的例
5、子,Yamamoto等应用连续亲和色谱法成功分离和鉴定了免疫抑制剂FK506的特异性结合蛋白FKBP12。 Anal Biochem. 2006 May 1;352(1):15-23. Bach等用同样的方法成功鉴定了抗癌药Roscovitine 能特异性结合细胞内多个激酶CDK5， ERK1，和ERK2。 J Biol Chem. 2005 Sep 2;280(35):31208-19.,4、酵母三杂交系统鉴定药物靶点,酵母双杂交系统广泛用于研究蛋白质之间的相互作用，在此基础上发展的酵母三杂交系统将应用范围扩展到蛋白质蛋白质、蛋白质RNA、蛋白质小分子化合物等更广阔的研究领域。 BD：DNA
6、结合域 AD：转录激活域 DHFR：二氢叶酸还原酶 MTX：甲氨喋呤,成功的例子,Becker等先通过连接臂聚乙烯乙二醇共价连接CDK抑制剂purvalanol B和MTX，再将此化合物加入表达DHFR-BD融合蛋白和激酶cDNA文库AD融合蛋白的酵母菌，检测报告基因的表达，鉴定了purvalanol B的已知靶蛋白CDK1、CDK5和CDK6，同时也发现了新的激酶靶蛋白CDC/CDK样蛋白CDC样激酶3(CLK3)、PCTAIRE蛋白激酶1(PCTK1)和PCTK2、丝/苏氨酸激酶p21(CDKN1A)激活的激酶4(PAK4)、核糖体蛋白S6激酶3(RSK3)、非受体酪氨酸激酶FYK和yam
7、aguchi肉瘤癌基因(YES)、受体酪氨酸激酶ephrin受体B2(EPHB2)和fms相关酪氨酸激酶4(FLT4)。 Chem Biol. 2004 Feb;11(2):211-23 Licitra应用酵母三杂交系统成功确认他克莫司(FK506)药靶FKBP12(FK506binding protein) Proc Natl Acad Sci U S A. 1996 Nov 12;93(23):12817-21,三、药物蛋白质学在临床诊断和治疗中的应用,应用药物蛋白质组学可筛选出疾病特异性蛋白质，可作为疾病分类分型和临床诊断的标志，还可作为评价药物疗效及预测疾病预后的依据，进而实现药物个体
8、化治疗。,1、发现疾病特异性生物标记物进行诊断及预测疾病的预后及转归,应用蛋白质学技术能够动态、整体地观察疾病发生过程中蛋白质种类和数量的变化，通过比较正常和疾病状态下蛋白质的表达情况，可以鉴定出疾病特异性生物标记物（biomarker)。 Biomarker： A characteristic that is objectively measured and evaluated as an indicator of normal biologic processes, pathogenic processes, or pharmacologic responses to a therapeu
9、tic intervention。 FDA draft Pharmacogenomics Guidance Diagnosis Tool for staging disease Indicator of disease status Predict and/or monitor clinical response to an intervention,生物标记物（biomarker),Biomarkers are the foundation of evidence based medicine-who should be treated, how and with what Absent n
10、ew markers, advances in more targeted therapy will be limited and treatment will remain largely empirical It is imperative that biomarker development be accelerated along with therapeutics,Example,(A) Specific populations of cells were recovered using laser under microscopic observation.,(B) The ext
11、racted proteins were labeled with fluorescent dyes and separated by two-dimensional polyacrylamide gel electrophoresis (2D-PAGE). (C) Evaluation of the reproducibility of 2D-DIGE by scatter graphs.,Results of hierarchical clustering were associated with histological grouping: the seven normal liver
12、tissues, 11 adjacent nontumor tissues, six well-differentiated HCCs, and one moderately-differentiated HCC were grouped together, while the 13 moderately-differentiated HCCs and seven poorly-differentiated HCCs were clustered together forming a separate group (A). Principal component analysis also s
13、howed similar results (B),Among the identified proteins, EB1 is controlled by c-Myc, RhoA and CDC42, which have all been linked toHCC malignancy in previous reports,2、评价药物疗效,大多数药物和疾病的靶点是蛋白质，可以认为，如果一个药物能够使疾病的蛋白质组学的表现与正常状态越接近，表明这个药物的治疗效果越好。,Example,3、研究药物毒理机制进行药物毒性生物标志物的监控,通过药物蛋白质组学的研究可准确、快速地揭示药物的毒副作用
14、。 检测经药物刺激的组织细胞的蛋白质组，建立其蛋白质谱数据库，有助于了解它们的毒理学机制，并建立可用于评估其安全性的生物标志物。 例如：庆大霉素明显的毒副作用是肾毒性。Kennedy等运用蛋白质组学研究了庆大霉素治疗后的大鼠血清标本，发现了一个持续高表达的蛋白，此蛋白可能参与了补体的替代途径激活过程，并且能够与肾皮质上皮细胞结合，有望成为评价庆大霉素毒性的非侵人性标志物。 Toxicol Lett, 2001, 120(1.3):379-384,四、抗肿瘤药多药耐药机制的蛋白质组学研究,Multidrug resistance (MDR) in cancer： 肿瘤细胞对一种化疗药物产生耐药性
15、后，对其它的多种化疗药物也产生不同程度的药耐性，致使药物的疗效不断的下降。 MDR is a significant obstacle to the success of chemotherapy MDR that develops in cancer cells often results from elevated expression of particular proteins such as cell-membrane transporters,Potential mechanisms of chemoresistance suggested by various published
16、 pharmacoproteomic studies,(A) drugsequestration, (B) modulation of PKC activity, (C) apoptosis, and (D) modulation of cytoskeleton organization Mitoxantrone:米托蒽醌；FABP:fatty acid binding protein(脂肪酸结合蛋白）；Thioedoxin:硫氧还原蛋白；Rho-GDP解离抑制因子；Annexins:膜联蛋白；MAP:microtubule-associated protein(微管相关蛋白）,Protein
17、s identified by the proteomic approach in cancer cell lines resistant to different anti-cancer drugs,anti-cancer drugs: a mitoxantrone, b daunorubicin, c etoposide, d doxorubicin, e paclitaxel, f cisplatin, g vincristine and h antimitotic compound,五、基于蛋白质组表达谱的抗肿瘤药物化疗敏感性预测,化学治疗是肿瘤的三大治疗手段之一。近30年来，虽然某些
18、恶性肿瘤的化学治疗有明显改善，但多数肿瘤，特别是实体瘤疗效仍不理想。这与肿瘤存在个体差异性，以及多重耐药性等因素有关。 如何选择有效药物，进行个体化的治疗早已成为化疗界所关注的问题。,传统药敏检测方法及其存在的问题,药敏检测方法,存在问题,集落形成法（HTCA）,标本可评价率低，仅有4070。实验周期长，需要2周以上测试药物种类和数量有限操作繁琐，难以标准化阳性预测值较低，仅有4060,四唑蓝比色法 (MTT),敏感性较差，最低仅能检测500个细胞量程较小，有效量程在2.0以内,细胞毒性差异染色法 (DiSC),可适用标本类型不广，目前仅用于血液肿瘤 人为判断因素较大，难以推广标本可评价率不高
19、，仅有7080阳性预测值较低，仅有7080,胸腺嘧啶核苷掺入法 (3H-TdR),实验人员接触放射，不利于健康标本可评价率不高，仅有7080测试结果仅能反映少量处于增殖相的肿瘤细胞对某些药物的测试结果存在假阴性,The selective pressure exerted by drugs combined with cell heterogeneity (often a result of tumor genomic instability) is the driving force for drug resistance. In addition, tumors can regulate
20、their own microenvironment by remodeling the extracellular matrix, deregulating cellcell contact and cellcell interactions with neighboring mesothelial and endothelial cells, and other changes such as increased hypoxia. Factors unrelated to the tumor but contributed by the host, e.g. gene polymorphi
21、sms, also contribute to drug resistance.,Proteomic technology applied to cancer-patient management,Proteomic pattern analysis of serum has the potential to detect early-stage disease, toxicity or recurrence. Once the disease has been diagnosed and biopsied, protein microarrays coupled with laser-cap
22、ture microdissection (LCM) offer a means to profile the individual signal pathways that are deranged in the tumour cells of the patient. In this manner, the combinatorial therapy can be tailored to, and monitored in, the individual patient.,Architecture of the model system for drug response predicti
23、on,Results:,Eight protein markers were identified for the prediction of drug response to 5-fluorouracil CDH1, CDH2, KRT8, ERBB2, MSN, MVP, MAP2K1, and MGMT. All of these proteins, except for KRT8, are involved in the pathogenesis of colon cancer.,Unsupervised hierarchical clustering of the NCI-60 pa
24、nel based on the eight protein markers. The colon cancer lines were aggregated into two groups. One group contained five cell lines, whereas the other contained two lines.,结果表明，鉴定出的蛋白标志物不仅可用于检测和诊断结肠癌，而且也为特异性清除癌细胞的最佳联合治疗方案中的靶点设计提供了基础,六、 药物蛋白质组学与个体化给药方案研究,SUMMARY,一、药物蛋白质组学概念和研究内容 二、药物作用靶点研究（研究策略和方法) 通过差异表达谱分析发现药物靶标 亲和色谱法(affinity chromatography) 直接分离活性小分子的结合蛋白 酵母三杂交系统鉴定药物靶点 蛋白质活性表达谱（activity-based protein profiling, ABPP）分析 三、药物蛋白质学在临床诊断和治疗中的应用 发现疾病特异性生物标记物（biomarker)进行诊断及预测疾病的预后及转归 评价药物疗效 研究药物毒理机制进行药物毒性生物标志物的监控 四、抗肿瘤药多药耐药机制的蛋白质组学研究：MDR及其机制研究进展 五、基于蛋白质组表达谱的抗肿瘤药物化疗敏感性预测 六、药物蛋白质组学与个体化给药方案研究,
