1、1,The Fifth Lecture Proteome & Proteomics,2,第一节 蛋白质组学的概念及其发展史,3,基因组时代 后基因组时代,1、背 景,4,越来越多的研究表明, 由于mRNA自身剪切拼接、翻译调控以及产物的翻译后加工修饰，基因表达的中间产物mRNA水平的研究并不能取代蛋白质水平的研究。甚至一些实验证明了某些物种mRNA与表达蛋白质的相关性不高(相关系数低于0.5)。因此,要精确地研究基因的功能,需要直接对执行生命功能的蛋白质进行研究。,1) 从mRNA表达水平不能预测蛋白表达水平,5,2) 从基因序列无法预测蛋白质的修饰和加工情况,基因与其编码产物蛋白的线性对应关
2、系只存在于新生肽链而不是最终的功能蛋白中：新生肽链合成后存在多种加工、修饰过程。近年来人们还发现蛋白质间存在类似与mRNA分子里内含子的剪切、拼接，并证明其基本元件“intein”广泛存在于多种蛋白质中。而大量蛋白尤其是一些重要调控蛋白的化学修饰（如甲基化、糖基化、磷酸化）、剪切加工（如酶原降解、结构域拼接）不但可改变其立体结构，而且是实施其功能与调节的重要结构基础。这些都不能从其基因编码序列中预测，而只能通过对其最终功能蛋白进行分析。,6,3) 蛋白质组可以动态反映生物有机体所处的状态,细胞周期的特定时期、分化的不同阶段、对应的生长和营养状况、温度、应激和病理状态，这些状态所对应的蛋白质组是
3、有差异的。蛋白质组学的研究可望提供精确、详细的有关细胞或组织状况的分子描述。因为诸如蛋白质合成、降解、加工、修饰的调控过程只有通过蛋白质的直接分析才能揭示。,7,Definition:“A full set of PROTEins encoded by the genOME” Marc Wilkins and Keith Williams (1995)(i.e. a Full Array of All Proteins Present in an organism, a Tissue, or a Cell),2、What is a proteome and proteomics?,8,In a
4、 living organism, a proteome, may be considered to be a SNAPSHOT of the Protein Array Existing at a Given Time.It is a dynamic entity, changing with time, mirroring the biological state of the organism.,9,Characterizations of proteome,Is DynamicGives Information on Relative Levels of Functioning Pro
5、teinsPermits Identification of Proteins, including Post- translational Modifications,10,蛋白质组学(proteomics),指应用各种技术手段来研究蛋白质组的一门新兴科学，其目的是从整体的角度分析细胞内动态变化的蛋白质组成成份、表达水平与修饰状态，了解蛋白质之间的相互作用与联系，揭示蛋白质功能与细胞生命活动规律。,11,主要研究内容,了解某种特定的细胞、组织或器官制造的蛋白质种类；,明确各种蛋白质分子是如何形成类似于电路的网络的；,描绘蛋白质的精确三维结构，揭示其结构上的关键部位，如与药物结合并且决定其活性
6、的部位。,12,Proteome 与 Genome关系,互补的角度/空间来研究细胞的分子架构 相辅相成 Genome - 导演RNome - 编剧Proteome-演员,13,Proteome 与 Genome区别,稳定性 Proteome -动态 Genome -静态 修饰化程度 Proteome - 高 Genome - 低 复杂程度 Proteome - 高 （20aa + 高度多样性修饰） Genome -低（4nt） 特异性 Proteome - 组织和细胞特异性 Genome - 无组织和细胞特异性,14,功能蛋白质组 (Functional Proteome),1997年，由Co
7、rdwell和Humphery-Smith提出的，它指的是在特定时间、特定环境和实验条件下基因组活跃表达的蛋白质。 功能蛋白质组只是总蛋白质组的一部分，通过对功能蛋白质组的研究，既能阐明某一群体蛋白质的功能，亦能丰富总蛋白质数据库，是从生物大分子(蛋白质、基因)水平到细胞水平研究的重要桥梁环节。,15,从局部入手研究蛋白质组的各个功能亚群体。 将多个亚群体组合起来，逐步描绘出接近于生命细胞的“全部蛋白质”的蛋白质组图谱。,16,功能蛋白质组,17,3、进 展,各国政府支持，国际著名研究和商业机构加盟： 1996年澳大利亚建立了世界上第一个蛋白质组研究中心（Australia Proteome
8、Analysis Facility，APAF）,18,美国国立癌症研究院（NCI）投资1 000万美元建立肺、直肠、乳腺、卵巢肿瘤的蛋白质组数据库。 NCI和FDA共同投资数百万美元建立癌症不同阶段的蛋白质组数据库。 英国建立三个蛋白质组研究中心对已完成或即将完成全基因组测序的生物体进行蛋白质组研究。,19,Celera公司投资上亿美元独自启动了全面鉴定和分类汇总人类组织、细胞和体液中的蛋白质及其异构体，构建新一代的蛋白质表达数据库的工作。,20,1997年召开了第一次国际“蛋白质组学”会议1998年在美国旧金山召开了第二届国际蛋白质组学会议 1999年1月在英国伦敦举行了应用蛋白质组会议,2
9、1,我国也于1998年启动了蛋白质组学研究，在中科院上海生物化学研究所举办了两次全国性的蛋白质组学研讨会,22,2003成立了中国人类蛋白质组组织（CHHUPO），并分别于2003年9月、2004年8月以及2005年8月召开了中国蛋白质组学首届、第二届及第三届学术大会，2004年10月在中国北京召开了第三届国际蛋白质组学会议。,23,国内已有若干蛋白质组学研究中心或重点实验室相继成立，如复旦大学蛋白质研究中心、军事医学科学院蛋白质组中心、高等院校蛋白质组学研究院、中国科学院蛋白质组学重点实验室和中国医学科学院蛋白质组学研究中心等。 其中高校蛋白质组研究院是由国内多所高校、临床单位和国内外有关公
10、司联合建立的研究机构，是我国高校大规模打破学校界限，与国内外多方面力量联手，进军蛋白组组学研究领域所采取的新举措。,24,科技部已将疾病蛋白质组研究列入我国“973”计划项目和“863”计划项目；国家自然科学基金委员会也将“蛋白质组研究”列为重点项目。 我国在鼻咽癌、白血病、肝癌和肺癌蛋白质组研究方面取得了较大的进展。,25,已进行了肝癌细胞系及正常肝细胞蛋白质组的比较分析研究，发现了两者间不同的蛋白表达群； 自行建立了肝癌高/低转移细胞系，进行了原位食管癌/转移食管癌间的比较蛋白质组研究，初步发现了一批与肿瘤转移相关的蛋白质群。,26,通过蛋白质芯片技术对肺癌病人和正常人血清中的蛋白质谱的对
11、比分析，找到了15个差异蛋白并利用Biomarker Pattern 分析软件建立了肺癌诊断分类树模型。初步盲筛结果表明，这15个分子标志可能成为临床诊断肺癌的新指标，有重要应用价值。 在大规模人胎肝蛋白表达谱方面初步鉴定出500个高丰度蛋白，150个磷酸化相关蛋白等等。,27,第二节 蛋白质组学研究方法概述,28,蛋白质组研究更为复杂和困难：蛋白质数目大大超过基因数目。蛋白质随时间和空间而变化。,29,发展高通量、高灵敏度、高准确性的研究技术平台是现在乃至相当一段时间内蛋白质组学研究中的主要任务。,当前主要任务,30,主要专业术语及其英文对照和缩写,IPG-IEF：固相pH梯度等电聚焦（im
12、mobilized pH gradients isoelectric focusing） SDS- PAGE：十二烷基磺酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳（Sodium dodecyl sulfate- polyacrylamide gel electrophoresis） 2-DE：双向电泳(Two Dimensional Electrophoresis) HPLC：高效液相色谱（High Performance Liquid Chromatography） MALDI-TOF MS：基质辅助激光解吸电离飞行时间质谱（Matrix Assisted Laser Desorption/Ionizatio
13、n Time-of-Flight Mass Spectrometry),31,研究策略与技术,两条互补的实验流程 基于凝胶的工作流程（Gel-based workflow） 基于液相色谱的工作流程（LC-based workflow）,32,蛋白质组学实验室所需的条件,33,一、蛋白质组表达模式的 研究方法,34,研究蛋白质组的组成成分 支撑技术主要有双向凝胶电泳、以质谱为代表的蛋白质鉴定技术及生物信息学分析。,蛋白质组表达模式 （expression profile）,35,（一）蛋白质组研究中的样品制备,36,蛋白质组研究的基本技术-样品制备,重要性： 在制备时丢失的蛋白永远不能在后面实验
14、中弥补 把蛋白质看作具有独特而奇妙性质的实体 原则： 使所有待分析的蛋白样品全部处于溶解状态 防止样品在聚焦时发生蛋白的聚集和沉淀 防止在样品制备过程中发生样品的抽提后化学修饰（如酶性或化学性降解等） 完全去除样品中的核酸和某些干扰蛋白,37,通常可采用细胞或组织中的全蛋白质组分进行蛋白质组分析。 也可以进行样品预分级，即将细胞或组织中的全体蛋白质分成不同部分，分别进行研究。,38,样品预分级的主要方法,蛋白质溶解性：可溶性蛋白、非溶性蛋白等 蛋白质定位：膜蛋白、核蛋白等 蛋白质细胞器定位：线粒体、高尔基体、叶绿体等,39,样品预分级主要作用在于提高低丰度蛋白质的上样量和检测灵敏度。,40,组
15、织水平上的蛋白质组样品制备,临床样本都是各种细胞或组织混杂，而且状态不一，如肿瘤中癌变的上皮类细胞总是与血管、基质细胞等混杂。,41,激光捕获显微切割(laser capture microdissection，LCM),可直接在显微镜下从组织切片中精确分离特定的细胞或细胞群。,42,蛋白质组研究的基本技术- 蛋白提取,步骤： 破碎 沉淀蛋白 去除杂质,43,蛋白质组研究的基本技术- 蛋白提取,样品制备流程 - 破碎尽可能减少蛋白水解/其它形式蛋白降解原则 机械法（超声波法、高压法 、机械匀浆法 ） 化学法（去污剂法、酶裂解法 ） 物理法（液氮研磨法、循环冻融法、渗透 法 、玻璃珠破碎法 ）,
16、44,就这些方法具体而言，选择的时候如果是较易破碎的细胞组织，就可以采用渗透法，这种方法十分温和，适用于血细胞和组织培养细胞。 而对于细菌细胞，则可以采用冻融法，利用液氮一次或者多次反复冻融来裂解细胞。 去污剂法适用于组织培养细胞，将样品悬浮于含有去污剂的裂解液中，可以溶解细胞膜释放内含物，如果裂解液中含有SDS，为了不干扰等电聚焦，可以将裂解的样品用含有过量的非离子或者两性离子去污剂的溶液稀释，或用丙酮沉淀法去除SDS。 另外酶裂解法适用于植物组织、细菌和真菌细胞。,45,一些较剧烈的方法也有自己的适用范围： 如超声波法适用于细胞悬浮液 高压法常用于有细胞壁的微生物 研磨法适用于微生物和组织
17、 机械匀浆法是机体软组织破碎最常用的方法之一 玻璃珠破碎法则用于细胞悬浮液和微生物的破碎。,46,蛋白质组研究的基本技术- 蛋白提取,样品制备流程 - 沉淀蛋白 去杂浓缩蛋白可溶性是关键 TCA-丙酮沉淀法 三氯醋酸（TCA）沉淀法 引起降解/修饰 丙酮沉淀法 硫酸铵沉淀法 影响IEF 醋酸铵沉淀法 步骤繁琐,47,48,49,2-DE结果影响因素分析,50,蛋白质组研究的基本技术- 蛋白提取,样品制备流程 - 去除杂质 关键是尽量不丢失蛋白和减少蛋白修饰 核酸的清除 （DNase/Rnase） 多糖的清除 （超离心 、TCA沉淀等） 去污剂的清除 （丙酮沉淀法等） 盐离子和外源带电小分子的清
18、除（透析、TCA-丙酮沉淀法）,51,核酸的清除 对电泳的影响：增加样品粘度、与蛋白质形成复合物后会出现假象迁移和条纹。 解决的方法：用适量纯的不含蛋白酶的核酸内切酶进行降解，或是利用合成载体两性电解质（SCA）同核酸结合形成复合物的能力，再通过超速离心来去除复合物。,52,多糖的清除 对电泳的影响：带负电的多糖会与蛋白形成复合物，导致拖尾和影响聚焦。 解决的方法：利用超离心和高pH，高离子强度，和TCA等沉淀法。,53,去污剂的清除 对电泳的影响：SDS能与蛋白形成带负电的复合物，对等电聚焦影响大，需要清除。 解决的方法：用含载体两性电解质或两性离子去污剂（CHAPS、Triton X-10
19、0或NP-40）的溶胀液稀释，或者丙酮沉淀法。,54,盐离子和外源带电小分子的清除 对电泳的影响：样品中的盐会增加凝胶条的电导，使其无法达到设置的电流，从而影响蛋白质聚焦，带电小分子会引起水的流动，使胶条的一端肿胀而另一端变干，导致两端的酸、碱性蛋白无法聚焦，造成拖尾或丢失。 解决的方法：常用透析去除盐成分，TCA-丙酮沉淀法可以清除小分子。,55,2-DE电泳结果影响因素分析,可能原因：样品含高丰度Pr,可能原因：TCA残留致使Pr丢失,56,可能原因：多糖未去除干净，被考马氏亮蓝染色 建议：样品用clean-up处理,57,可能原因：聚焦不够，或者盐离子过多 造成水平条带的其它原因： De
20、tergent去污剂浓度过低 尿素浓度过低 DTT浓度过低，或者用量过少 上样位置不合适（比如cup loading） 蛋白酶活性 胶条溶胀时间过短 样品中含有不溶的蛋白(centrifuge 1 hr / 40,000 g) 空气中的CO2,58,2-DE结果影响因素分析,可能原因：Tris质量不好,可能原因：Urea 不纯,59,可能原因：平衡过程中DTT不足，导致一些蛋白出现垂直条带,60,可能原因：样品中含盐等离子杂质过高，导致等电聚焦失败。 建议：避免过多盐，需除盐，如在洗细胞时要把PBS在离心后彻底移除，或在最后一步清洗时采用250mM蔗糖/10mM Tris 洗细胞。,61,蛋白
21、质组研究的基本技术- 蛋白提取,样品制备注意事项： 蛋白质水解 - 蛋白酶抑制剂(PMSF等) 特殊样品的制备 (低丰度 、强碱性蛋白质 （核糖体）、极端分子量 ) 样品定量 重复性,62,63,特殊样品的制备,低丰度蛋白的分离：尽管增加上样量和提高总蛋白的溶解度能增加分离时的低丰度蛋白的量，但同时增加了高丰度蛋白的负荷，且造成蛋白的叠加效应而影响分离。 现常用预分级窄pH胶的微制备技术进行分离：即将总蛋白组分成蛋白质组亚群，再用pH梯度小于2个pH单位的IPG胶进行窄pH范围的分离。,64,强碱性蛋白质（如核糖体 ）的处理：先将蛋白预处理以富集，再用特殊pH梯度的IPG胶条（如pH312、4
22、-12或10-12）进行等电聚焦。 其中窄范围碱性IPG胶（如pH10-12）的挑战是克服反向、阴极向阳极、电渗流和水平条纹模式，而宽范围的碱性IPG胶（如pH3-12、4-12）等消除了窄范围胶所需要的专门水化液,65,极端分子量的蛋白质：小于8kD和大于200kD的蛋白在常规IPG-2D上不易看到，这可能是在Tris/glycine缓冲液中，样品和游离的十二烷基硫酸根离子持续积累浓缩，与小分子量的蛋白质发生对流混合，产生茸毛状的或模糊的带，从而降低小蛋白的分辨率；在胶底端，高浓度的十二磺酸使蛋白固定致染色困难。至于高分子量蛋白少的原因可能是在变性条件下，蛋白质复合物变成了多肽，或者可能是大
23、分子。,66,2-DE重复性,The same protocol and sample, however not the same results Rec: similar; cir: different,67,（二）蛋白质组研究中的样品分离,双向凝胶电泳two-dimensional electrophoresis，2-DE)：利用蛋白质的等电点和分子量，结合凝胶化学特性，分离各种蛋白质的方法。,68,原 理,第一向在高压电场下对蛋白质进行等电聚焦(IEF), 再在第一向垂直方向上进行第二向SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS-PAGE)。 1975年首先由OFarrell等创立。,69,特
24、点,可分离10100 kD分子量的蛋白质 高灵敏度和高分辨率 便于计算机进行图像分析处理 与质谱分析匹配,70,IEF是一种根据样品的等电点不同而使它们在pH梯度中相互分离的一种电泳技术 将等电点不同的蛋白质混合物加入有pH梯度的凝胶介质中，在电场内经过一定时间后，各组分将分别聚焦在各自等电点相应的pH位置上，形成分离的蛋白质区带 从而得知其等电点信息,第一向IEF电泳,71,IEF的基本条件,step 1,step 2,step 3,total,voltage,Time,Volt-Hours,Ramp,250,20min,Linear,4000,4000,2hr,10,000V-hr,Lin
25、ear,Rapid,5 hr,14,000V-hr,7 cm,step 1,step 2,step 3,total,total,step 1,step 2,step 3,11 cm,17 cm,250,250,8000,10000,10000,8000,20min,20min,2.5hr,2.5hr,20,000V-hr,40,000V-hr,30,000V-hr,50,000V-hr,5.3 hr,7 hr,Linear,Linear,Linear,Linear,Rapid,Rapid,72,IEF电泳,73,第一向IEF电泳,传统OFarrell系统双向电泳的缺陷。 Bjellgvist等
26、发展并完善了固相pH梯度等电聚焦技术，Grg等成功地将之应用于双向电泳。,74,固相pH梯度等电聚焦的优点,克服了载体两性电解质阴极漂移等缺点。 稳定的可以随意精确设定的pH梯度。尤其可在较窄的pH范围内进行第二轮分析，大大提高了分辨率及重复性。,75,聚丙烯酰胺凝胶形成网状结构，具有浓缩效应、电荷效应、分子筛效应 。SDS与蛋白质形成雪茄状带负电荷复合物，从而消除了蛋白间的电荷及形状差异，电泳速度仅与分子量有关 从而得知其分子量信息,第二向SDS-PAGE电泳,76,第二向SDS-PAGE电泳,垂直板电泳水平超薄胶电泳,77,第二向垂直SDS-PAGE电泳,凝胶浓度与其对应的分离范围,胶浓度
27、 分离范围(KD)5% 36-2007.5% 24-20010% 14-20012.5% 14-10015% 14-60,78,第二向垂直SDS-PAGE电泳,步骤： 溶液配置(Buffer、Bis-Acr、 AP、TEMED) 灌胶 电泳,Ettan Dalt twelve电泳系统,79,第二向垂直SDS-PAGE电泳,Ettan Dalt six电泳系统,80,2-DE 凝胶蛋白质斑点的检测,染色： 1）考马斯亮兰染色法；2）银染法；3）负染法；4）荧光染色法；5）放射性同位素标记法等,81,2-DE 凝胶蛋白质斑点的检测,图像扫描和分析Image Scanner II,82,2-DE 凝
28、胶蛋白质斑点的检测,全自动斑点切取系统（Ettan Spot Picker）,83,2-DE技术的缺点,极酸、极碱性蛋白质，疏水性蛋白质，极大蛋白质、极小蛋白质以及低丰度蛋白质用此种技术难于有效分离。 胶内酶解过程费时、费力，难于与质谱联用实现自动化。,84,新型非凝胶技术,液相色谱法 liquid chromatography，LC 毛细管电泳 capillary electrophoresis，CE,85,液质联用技术（LC-MS/MS）,蛋白质混合物直接通过液相色谱分离以代替2-DE的分离，然后进入MS系统获得肽段分子量，再通过串联MS技术，得到部分序列信息，最后通过计算机联网查询、鉴定
29、蛋白质。,86,根据蛋白质带电性及疏水性不同，用MS分离多肽复合物。,多维色谱技术（LC/LC-MS/MS）,多维蛋白质鉴定技术(multidimensional protein identification technology),87,（三）蛋白质组研究中的样品分析鉴定,传统方法：蛋白质微量测序氨基酸组成分析,88,新型蛋白质鉴定技术 质谱（MS）法,基本原理：样品分子离子化后，根据离子间质荷比（m/z）的差异来分离并确定样品的分子量。,89,“软电离”的特点,分子电离时保留整个分子的完整性，不会形成碎片离子。 灵敏度高、快速、能同时提供样品的精确分子量和结构信息、既可定性又可定量、并能有
30、效地与各种色谱联用来分析复杂体系。,90,基质辅助激光解吸/电离飞行时间质谱（matrix-assisted laser desorption/ionization time of flight mass spectrometry，MALDI-TOF MS） 电喷雾质谱（electrospray ionization mass spectrometry， ESI-MS）,主要质谱类型,91,鉴定和注释蛋白质的路线,通过肽质谱指纹图（peptide mass fingerprinting，PMF）和数据库搜寻匹配 通过测出样品中部分肽段二级质谱信息或氨基酸序列标签和数据库搜寻匹配,92,目 录,
31、93,仪 器,MALDI-TOF质谱仪：灵敏度高（可达fmol），分析速度快，谱图简单易于解析以及受缓冲液、盐份的干扰小,94,MALDI-TOF MS 样品溶于固定的底物中形成晶体，用激光脉冲使其离子化，离子被加速后通过飞行管时分离，所有离子均可被检测，常用来测蛋白质、多肽、核酸和多糖等生物大分子,95,肽质谱指纹图在数据库中匹配 不成功的可能原因,样品量太少，PMF图信噪比太低，输入库中搜寻的数据质量不好。 2-DE胶上所取的一个蛋白质点并非单一蛋白质，所获PMF图实际上是两个以上蛋白质的混合图。,96,操作中角蛋白或其他蛋白质的污染 蛋白质发生了较多的翻译后修饰，数据库中未有记载 所用胰
32、蛋白酶质量不够好，蛋白酶自酶解片段多 未知的新蛋白质 数据库规模太小,续：,97,组织切片或印片原位质谱分析技术 两级飞行时间串联质谱（MALDI-TOF/TOF） 傅里叶转换回旋共振质谱（FTMS） 表面增强激光解吸/电离飞行时间质谱（SELDI-TOF-MS）,联合技术精确鉴定蛋白质,98,（四）蛋白质组学研究的生物信息学,生物信息学是蛋白质组学研究的一个不可缺少的部分。,99,蛋白质组研究相关网站,蛋白质组学研究依赖生物信息学和网络技术 http:/www.proteomeworks.bio- 蛋白质组研究技术、信息等 http:/ 发现新蛋白及新作用(新药开发) http:/www.p
33、roteome.med.umich.edu 蛋白质组研究相关企业、各 种仪器来源、新闻等 http:/www.proteome.co.uk 各种蛋白质组研究相关信息 http:/www.micromass.co.uk 介绍蛋白质鉴定的先进仪器 http:/www.expasy.ch 蛋白质鉴定专家系统，Swiss Institute of Bioinformatics http:/expasy.proteome.org.au 蛋白质鉴定专家系统，Australian Proteome Analysis Facility http:/expasy.cbr.nrc.ca 蛋白质鉴定专家系统，Can
34、adian Bioinformatics Resours,100,构建和分析双向凝胶电泳图谱 数据库的搜索与构建,应 用,101,蛋白质组数据库是蛋白质组研究水平的标志和基础,瑞士的SWISS-PROT拥有目前世界上最大、种类最多的蛋白质组数据库。目前应用最普遍的数据库是NRDB 和dbEST数据库。,102,dbEST数据库,由美国国家生物技术信息中心（NCBI）和欧洲生物信息学研究所（EBI）共同编辑，包括许多生物体的表达序列标签（EST）,肽序列标签(PST)或部分序列信息最适合查寻dbEST数据库,103,概念：把一个基因组表达的全部蛋白质或一个复杂体系中所有的蛋白质进行精确的定量和鉴
35、定。,（五）定量蛋白质组学研究,104,低丰度蛋白质检测困难蛋白质表达量差异很小，如在50%以下时，精确定量成为瓶颈 蛋白质表达的瞬时变化,蛋白质定量的难点,105,1基于双向凝胶电泳的定量 蛋白质组研究策略,双向凝胶电泳(2-DE)是目前唯一能分离展示大量蛋白质并进行蛋白质定量分析的一种方法。荧光差异显示双向电泳（F-2D-DIGE）,106,2基于生物质谱的定量蛋白质组研究策略,原理：对于具有相同离子化能力的蛋白质或多肽，可以通过比较质谱峰的强度（或峰面积）得到待比较蛋白质的相对量。,107,二、蛋白质组功能模式的 研究方法,108,揭示蛋白质组成员间的相互作用、相互协调的关系，并深入了解
36、蛋白质的结构与功能的相互关系，以及基因结构与蛋白质结构功能的关系。,主要研究目标,109,（一）蛋白质翻译后修饰的研究,翻译后修饰,糖基化,乙酰化,甲基化,羧基化,二硫键,110,修饰肽的检测的高灵敏度方法 蛋白质翻译后修饰的定量分析 合适的修饰状态下处理和电离条件 测定工作量巨大,研究面临的困难：,111,（二）蛋白质相互作用研究技术,生命的基本过程是不同功能蛋白质在时空上有序和协同作用 新陈代谢以蛋白质复合体或多蛋白质网络协同作用实现 细胞信号转导及病原体感染和免疫反应,112,1989年Field 和Song等人在酵母细胞中设计的分析蛋白质相互作用的方法。 以真核细胞转录激活因子的结构和
37、活性特点为基础的。,1酵母双杂交系统 （yeast two-hybrid system）,113,转录激活因子GAL4的特点,N端含NLS和与酵母GAL1基因启动子上游激活序列(UASG)结合的结构域 C端含GAL1转录激活结构域,114,功能上相互独立又互相依赖，只有通过某种方式结合在一起才具有完整的转录因子活性,115,系 统 构 建,分别构建含GAL4 BD 和AD 的两个酵母融合蛋白表达载体； 建立含特殊基因型、适用于双杂交体分析的酵母菌株,116,117,酵母双杂交,118,主要特点和优势,使蛋白质表现型和基因型相联系 筛选cDNA文库 真实反应体内蛋白质间相互作用情况 不需分离靶蛋
38、白 敏感性高,119,缺 点,1.假阳性结果 2.假阴性结果 3.限于核内表达的蛋白质的相互作用,120,2噬菌体表面显示技术 ( phage display ),三个基本因素：在噬菌体p和p衣壳蛋白N端插入外源待筛基因编码的蛋白，形成的融合蛋白表达在噬菌体颗粒的表面；同时其保持的外源蛋白天然构象能被相应的抗体或受体识别,121,利用固相支持物上的抗体或受体，采用亲和筛选法（panning），从噬菌体文库中筛选出能结合筛选分子的目的噬菌体。 外源多肽或蛋白质表达在噬菌体的表面，其编码基因可通过分泌型噬菌体的单链DNA测序推导出来。,122,主 要 应 用,筛选与特异抗体或受体相互作用的蛋白质
39、研究抗体或受体的结合位点 构建随机肽库、抗体库和蛋白文库 改造和提高蛋白质的生物学和免疫学特性 研究新型多肽药物、疫苗和抗体 研究涉及到蛋白质与核酸相互作用的生物学过程和新型的基因治疗导向系统,123,主要优点,在细菌外完成 高度的选择性 亲和纯化反应高效性 不需要了解筛选分子结构,124,缺 点,限制肽段大小 外源蛋白质无法正确折叠或修饰 融合蛋白可能会影响到蛋白质本身活性,125,3基于质谱的蛋白质相互作用研究方法,靶蛋白制备 蛋白质复合体的纯化 蛋白质复合体的质谱鉴定,基本步骤：,126,（1）亲和层析耦联质谱技术,基本原理：将某种蛋白质以共价键固定在基质（如琼脂糖）上，含有与之相互作用
40、的蛋白质的细胞裂解液过柱，先用低盐溶液洗脱下未结合的蛋白质，然后用高盐溶液或SDS溶液洗脱结合在柱子上的蛋白质，最后用多维液相色谱耦联质谱技术（MDLC-ESI-MS/MS）鉴定靶蛋白的结合蛋白。,127,先决条件,得到足够多的保持生物活性的重组靶蛋白作为诱饵（bait） 获得足够量、纯度高的与诱饵相互作用的蛋白质,128,利用含靶蛋白的融合蛋白获得 相互作用蛋白质,谷胱甘肽S转移酶（glutathione S-transferase，GST）融合蛋白 蛋白A融合蛋白,129,主要优点,灵敏度高：高浓度靶蛋白 候选蛋白质与靶蛋白的结合机会均等 检测多亚基蛋白质之间的相互作用,130,（2）免疫
41、共沉淀耦联质谱技术,原理：以细胞内源性靶蛋白为诱饵，用抗靶蛋白抗体与细胞总蛋白进行免疫共沉淀（immuno-precipitation，IP）纯化靶蛋白免疫复合物，凝胶电泳分离后，质谱鉴定靶蛋白的结合蛋白。,131,研究鼻咽癌细胞系中的p53 相互作用蛋白,抗p53抗体与HNE1和HNE2总蛋白进行免疫共沉淀 SDS-PAGE分离免疫沉淀复合物 切取p53结合蛋白条带，酶解后进行电喷雾串联质谱（LC-ESI-MS/MS）分析，得到相应的肽序列标签 搜索数据库,132,特 点,生理条件下蛋白质之间的相互作用 所有蛋白质与靶蛋白的相互作用 可检测依赖于修饰的蛋白质相互作用,133,局 限 性,A.
42、 灵敏性不高 B. 假阳性 C. 受免疫球蛋白的干扰较大,134,Biacore基于表面等离子共振（SPR）进行生物大分子相互作用分析(BIA) 质谱（MALDI-TOF-MS或LC-ESI-MS/MS）鉴定Biacore芯片上配体所捕获的生物分子,（3）生物传感器耦联质谱技术,组 成,135,当生物大分子结合（如蛋白质相互作用）时会引起作用表面(芯片)折射率的变化，这种光信号可被光感受器接受并转换成电信号传送到计算机，再由计算机还原为模拟的生物信号。,Biacore的基本工作原理,136,（4）串联亲和纯化耦联质谱技术,基本原理：在靶蛋白一端或中部嵌入蛋白质标记（TAP Tag），经过特异性
43、的两步亲和纯化，在生理条件下与靶蛋白相互作用的蛋白质便可洗脱下来，然后用质谱技术对得到的蛋白质复合体进行鉴定。,137,主要流程,双重分子标签构建到靶蛋白表达融合蛋白 制备细胞裂解液 IgG柱纯化 TEV蛋白酶的洗脱液洗脱蛋白质复合体,138, 耦联钙调素的亲和柱纯化洗脱含EGTA的洗脱液洗脱 质谱鉴定结合蛋白质,续：,139,应用的基本领域：,鉴定新的蛋白质复合体 鉴定己发现复合体中的新组分,140,特 点,获得生理条件下与靶蛋白相互作用的蛋白质 鉴定出在空间上非直接物理相互作用的蛋白质 适用于大规模蛋白质相互作用研究,141,基本原理：将高度密集排列的蛋白分子作为探针点阵固定在固相支持物上
44、，当与待测蛋白样品反应时，可捕获样品中的靶蛋白，再经检测系统对靶蛋白进行定性和定量分析。,（三）蛋白质芯片（protein chips，protein array）技术,142,依据的杂交反应原理: 抗原-抗体反应 配体-受体反应 蛋白质-蛋白质相互作用,143,蛋白质芯片种类,生物化学芯片 化学型芯片 生物反应器芯片,144,芯片捕获的蛋白质的检测,以质谱技术为基础的直接检测法 间接法：将样品中的蛋白质或识别靶蛋白的抗体用酶、荧光素或同位素进行标记，结合到芯片上的靶蛋白就会直接或通过底物间接发出特定的信号，然后对信号进行扫描检测。,145,三 蛋白质组学在疾病 研究中的应用,146,疾病蛋白
45、质组学,人类疾病的发病机制、早期诊断及治疗 致病微生物的致病机理、耐药性 发现新的抗生素,147,人类疾病的蛋白质组研究,直肠癌：Sanchez等对15例结肠癌和13例正常人的结肠上皮进行2-DE。建立了包括882和861个斑点的结肠癌及正常人结肠粘膜的标准胶图。结果发现在分子量为13kD和pI值为5.6处的蛋白质仅出现在结肠癌的组织中。经鉴定为：钙粒蛋白B（calgranulin B）及钙卫蛋白（calprotectin）,148,人类疾病的蛋白质组研究 肝癌 - 醛糖还原酶 膀胱癌 -醛糖还原酶 、Trp-tRNA合成酶、IFN-诱导的r3，SOD及35.8kD和11.2kD两未知蛋白 扩张型心肌病 - 8种蛋白质,149,致病微生物的蛋白质组研究 检测博氏疏螺旋体与免疫有关的蛋白质 弓形体抗原的检测 白色念珠菌 -对真菌细胞壁蛋白分析筛选抗药真菌药物,150,阐明新抗生素作用机理寻找作用于细菌内新的靶分子找到有效的抗菌化合物,151,THANK YOU,
