1、蛋白质一级结构：指多肽链中氨基酸的排列顺序。主要靠肽键维系，有些蛋白质还包括二硫键。（Assembly 组装，集合。 ）linear；ordered；1 dimensional；sequence of amino acid polymer；by convention, written from amino end to carboxyl end；a perfectly linear amino acid polymer is neither functional nor energetically favorablefolding；occurs at the ribosome ；involve
2、s dehydration synthesis and polymerization of。 Dihedral angle 180 双面角: (phi) angle = rotation about C2N1 ； (psi) angle = rotation about C2C2蛋白质二级结构：指肽链主链的空间走向（折叠和盘绕方式），是有规则重复的构象。并不涉及氨基酸残基侧链的构象。主要的化学键：氢键（Folding 折叠加工）蛋白质二级结构的主要形式：-螺旋 ； -折叠；-转角；无规则卷曲 ；环； 三股螺旋。non-linear； 3 dimensional；localized to reg
3、ions of an amino acid chain；formed and stabilized by hydrogen bonding and other bonds结构域（domain）含数百个 AA 残基的多肽链折叠成两个或多个稳定的相互独立的球状实体结构域是介于二级和三级结构之间的一种结构层次 蛋白质三级结构：指在一条多肽链中所有原子的整体空间排布，在二级结构的基础上进一步盘曲折叠形成的特定球状结构，包括所有主链和侧链的结构。（Packing 包装）次级键；二硫键（共价键）；疏水键；范德华力；离子键；氢键non-linear； 3 dimensional；global but res
4、tricted to the amino acid polymer；formed and stabilized by hydrogen bonding, covalent bonding, hydrophobic；packing toward core and hydrophilic exposure to solvent； A globular amino acid polymer folded and compacted is somewhat functional and energetically favorable-interaction!蛋白质四级结构：具有二条或二条以上独立三级结
5、构的多肽链通过次级键相互组合而形成的空间结构（Interaction 相互作用） non-linear； 3 dimensional；global, and across distinct amino acid polymers；formed by hydrogen bonding, hydrophobic packing and hydrophilic exposure；favorable, functional structures occur frequently结构与功能关系：一级结构决定其高级结构，高级结构决定其功能。蛋白质一级结构是空间结构和生物功能的基础，一级结构决定空间结构；镰
6、刀形红细胞贫血（sickle-cell anemia）编码珠蛋白 链的结构基因第六个密码子（codon）由 CTTCAT，相应的多肽序列中 N端的第六个氨基酸由 GluVla；其空间结构发生相应改变，在表面形成互补区，使蛋白质分子之间彼此聚合，促使红细胞在低氧压下变形成镰形，使红细胞容易破裂，发生溶血，丧失运输氧的生物活性。 发夹式 模体：两段相邻的反平行 链被一环链连接在一起构成的组合，其形貌与发夹相似，故称为发夹式 模体（hairpin motif） ，也称为 组合单位（ - unit)。反平行 层回纹模体： 4 段反平行 链常常以特定的来回往复方式组合，其形貌类似于希腊钥匙上特有的回形装
7、饰纹，故在文献中被称为希腊钥匙型模体（Greek key motif ） 。 - - 模体：这是一种连接两股平行 链的结构元素组合。几乎在所有含平行 链的结构中都有该模体存在。复杂模体：两个相邻的 发夹模体通过环链相连，可以构成更加复杂的模体。血红素结构（Heme）：Hb 中每个亚基包含一个血红素，血红素：1 个亚铁离子(Ferrous ion)；1 个原卟啉（4 个吡咯基由次甲基桥连接后，形成一个原卟啉环 Porphyrin ring ）原卟啉呈扁平状，铁离子位于原卟啉中央亚铁离子，6 个配位数：2 个共价键、2 个配位键与原卟啉环 4 个 N 相连；第 5、6 配位置，分别位于 Heme
8、平面两侧。血红素与珠蛋白结合：Heme 埋藏在亚基的空穴中伸向外，极性很强的丙酸基位于分子表面，其余在分子内。Heme 平面两侧各一个 His：F8His 近 Heme 平面，以配位键与 Fe 离子相连；E7His 远，O2 在此可与 Fe 离子可逆结合，为了有利于 O2 的结合， Hb 每个亚基都为 Heme 提供一个疏水空穴。血红蛋白亚基之间的接触 1、1/1 或（2/2）的接触面较大，形成一个稳定的二聚体，接触不受 02 与血红素结合的影响。（包含了 -chain 和 -chain 的 G10 到 H9 之间及 B、D 螺旋段 34 aa，17-19 个氢链相连）2、1/2(或 2/1)
9、的接触面较少，把 2 个二聚体连系成 1 个四聚体。此接触易受 O2与血红素结合的影响，且在氧合、脱氧中接触不同（2 的 FG 和 1 的 CD 螺旋段的 19个残基构成） 。3、脱氧 Hb 中，4 个亚基通过 8 个盐桥互相结合。8 个盐桥使脱氧 Hb 分子构象受约束，使其对氧亲和力低于单独的 -亚基、- 亚基对氧的亲和力，也低于氧合 Hb 的氧亲和力。4、DPG （2，3 一二磷酸甘油酸）与 Hb 结合可进一步降低脱氧 Hb 对 O2 亲和力。 DPG位于 Hb4 个亚基之间的空穴中， DPG 分子中几个负电荷基团与每个 - 亚基几个正电荷基团（Val1,Lys82,His143）相互吸引
10、，产生六个盐桥，可使脱氧 Hb 四级结构更稳定，从而进一步降低了脱氧 Hb 对 O2 的亲和力。协同效应 cooperativity： 一个亚基与其配体（Hb 中的配体为 O2）结合后，能影响此寡聚体中另一亚基与配体的结合能力，称为协同效应。Hb4 个亚基 4 个 O2 结合部位相互作用， “协同效应” 。(1) 正协同效应：促进作用；(2) 负协同效应：抑制作用Allostery 别构效应（变构效应）蛋白质分子中，一个亚基，由于配体的结合而发生的构象变化，引起相邻亚基的构象与性能发生改变的现象，这种现象称为蛋白质的别构效应当血红蛋白的一个 亚基与氧分子结合以后，可引起其他亚基的构象发生改变，
11、对氧的亲和力增加，从而导致整个分子的氧结合力迅速增高，使血红蛋白的氧饱和曲线呈“S”形。血红蛋白的两种构象： T 态和 R 态无氧存在时，血红蛋白血红素 Fe 原子的第 6 个配位位置是空着的，形成去氧血红蛋白；有氧存在时，能够与氧结合形成氧合血红蛋白；血红蛋白存在两种主要构象态：T 态（紧张态, tense state）和 R 态（松弛态，relaxed state） ；O2 和两种构象态的 Hb 都能结合，但对 R 态 Hb 的亲和力更高，并且氧的结合更稳定了 R态。血红蛋白的 T 态经过渡态向 R 态转变。Bohr 效应：随着 H+浓度和 CO2 浓度的升高，氧合曲线右移，促使氧合血红蛋
12、白释放O2蛋白质设计 Protein Design基因水平：定点突变 从头、全新设计基因定点突变 ：体外特异性改变基因内某个碱基的技术叫做定点诱变技术。盒式诱变：指利用人工合成的具有突变序列的寡核苷酸片段即所谓的寡核苷酸盒取代野生型基因中相应的序列优点：简单、易操作、突变率高；缺点：靶 DNA 区段两侧要有限制酶单切点将目的基因插入 M13 派生载体正链的合成突变引物的合成异源双链 DNA 分子的制备闭合异源双链 DNA 分子的富集转化；突变体的筛选突变基因的鉴定寡核苷酸引物诱变：使用化学合成的有突变碱基的寡核苷酸短片段作引物，启动单链DNA 分子进行复制，随后这段寡核苷酸引物便成为了新合成的
13、 DNA 子链的一个组成部分新链具有了突变的碱基序列；长度：818 nt全新蛋白质设计或蛋白质从头设计目的：创造具特定功能的全新蛋白质；创造具特定结构的全新蛋白质；探索蛋白质折叠机理设计思路：A 根据设计第一原理设计蛋白质（了解残基形成二级结构单元的特点后，要安排残基的最大的疏水相互作用形成一个紧密的疏水内核。离子相互作用及氢键可以进一步用于稳定蛋白质的结构） 。B 根据主链的构象限制设计二级结构。方法1.二级结构模块单元的自组装；2.配体诱导组装；3.通过共价交叉连接实现肽的自组装4.在合成模板上肽的组装；5.线性多肽折叠为球状结构；6.基于组合库的全新蛋白质设计蛋白质的功能设计通过反向拟合
14、天然蛋白质设计新的功能；键合及催化的从头设计；在全新蛋白质中引入结合位点；催化活性蛋白质的设计；膜蛋白及离子通道的设计新材料的设计人造蛋白:1.冠醚、环糊精类模型： -胰凝乳蛋白酶的模拟；2.胶束模型；3.肽模型1. 分子印记模型分子印迹：原理：制备对某一化合物(PT) 具有选择性的聚合物(MIP) 的过程抗体酶（Abzyme ）具有催化性质的免疫球蛋白，可谓是酶和抗体性质的兼得。所以又被称为催化抗体（Catalytic antibody）抗体酶的作用机制 酶 抗体酶本质区别 过渡态(激发态分子) 基态分子 Ag-Ab选择性结合构像发生改变 相同点电荷互补， 疏水键、静电、氢键等 抗体酶的制备
15、: 诱导法,基因工程法 ,拷贝法,导入法,修饰法诱导法是选择适当的化学模型与载体蛋白连接后使动物免疫，通过杂交瘤技术筛选和分离单克隆抗体,希望从中筛选得到具有催化活性的单抗。基因工程法,拷贝法,导入法,修饰法抗体酶的应用在有机合成上的应用手性合成:催化生成某一特定的旋光异构体。立体专一性地水解 R 构型的萘普生乙酯抗体酶非酶合成:Diels-Alders 反应（双烯合成）等；选择催化不利的反应过程在临床医学上的应用：抗体介导前药治疗（ADEPT ）技术抗体酶作用: 识别肿瘤细胞表面抗原抗体酶作用；水解前药取得了很大进展1、转酰基反应 2、水解反应 3、Claisen 重排反应 4、酰胺合成反应
16、 5 Diels-Alder 反应6、转酯反应 7、光诱导反应 8、氧化还原反应 9、脱羧反应 10、顺反异构化反应存在的问题： 抗体酶与天然酶相比，抗体酶的催化效率和转换数远远低于天然酶 抗体酶特点种类多，结合能力强; 可诱导，可改造; 特殊意义反应.蛋白质改造 Protein Alteration 蛋白质水平使用化学、物理等方法，使 Pr 分子的结构发生改变，从而改变 Pr 的某些特性和功能的过程横向：提高 Pr 的活性、稳定性、改变抗原性等；纵向：扩大 Pr 的使用范围侧链基团修饰化学修饰剂与蛋白质反应类型：烷基化反应；酰基化反应；氧化还原反应；芳香环取代反应酶的化学交联交联剂：具有两个
17、反应活性部位的双功能基团，可在相隔较近的两个 Aa 残基或酶与其他分子之间发生交联反应。常用交联剂：戊二醛根据交联试剂的两个功能基团：相同同型双功能试剂；不相同杂型双功能试剂根据交联剂：可切断型（常用 DTT 等还原剂切断） ；不可切断型（常用于固定化酶）总结： Pr 分子修饰的功能和局限性功能：提高生物活性活力：对效应物、底物的反应性能；增强在不良环境中的稳定性消除或降低抗原性；产生新的催化能力；进行酶的结构与功能的基础研究、酶的催化机制等酶学研究局限性：修饰剂的选择难度大；Pr 的构象或多或少会发生改变，一定程度上防碍对结果的解释；只能对具有活泼反应性的氨基酸侧链进行修饰蛋白质组研究出现的
18、理论和实际意义从理论上来讲,无论是从基因组计划的局限,还是从蛋白质研究的自身发展而言,大规模,全方位的蛋白质研究势在必行.从实际意义上来讲，蛋白质组学是发现药靶的主要技术平台。蛋白质组定义：一个基因组、一种生物或一种细胞/组织所表达的全套蛋白质。基因组与蛋白质组之间的比较（7 个）同一性与多样性基因组作为遗传信息的载体,其最大的特征就是同一性；对于蛋白质组而言, 不同类型的细胞或同一个细胞在不同的活动状态下,蛋白质组的构成是不一样的。静态和动态一个个体的基因组自个体诞生到死亡,始终保持不变；而作为新陈代谢的主要执行者的蛋白质组,在个体的生命活动中却总是变动不停的.人们可以通过确定变化的蛋白质来
19、理解其功能.有限与无限对基因组而言,要测定的基因组不论大小,其核甘酸的数量是明确的。对蛋白质组来说,蛋白质的种类有多少很难确定。时间与空间稳定与不稳定性DNA 通常位于细胞核内,且保持稳定,因此测定基因组的 DNA 序列不受时空的限制. 而在蛋白质组的研究中,时间和空间的影响都必需要考虑.孤立行为与相互作用基因组的基因间是相互孤立的,互不干扰.但蛋白质正好相反,它们彼此间有广泛的相互作用.单一手段和多种技术基因组既无量的变化，也无质的变化，所以，在基因组研究中,DNA 测序技术是一个最基本和最主要的工具. 在蛋白质组的研究中,需要的研究技术远远不止一种,并且技术的难度也远远大于基因组研究技术.
20、蛋白质组技术可以简单的分为两类：第一类是蛋白质组的分离技术.包括双向电泳技术,细胞分级分离技术,亲和层析技术等.第二类是蛋白质组的鉴定技术,其核心是质谱技术.蛋白质芯片技术，噬菌体展示技术和大规模的双杂交技术等也属于鉴定技术。互补与互助基因组测序后的下一个任务就是进行基因注释，蛋白质组数据可以大大提高基因注释的正确率。蛋白质组的许多工作离不开对基因组的研究。蛋白质组学研究的内容蛋白质鉴定；蛋白质结构；蛋白质分布；蛋白质功能蛋白质的丰度变化蛋白质修饰；蛋白质与蛋白质的相互作用；蛋白质与疾病的关联性。蛋白质组研究的宗旨是将组织或细胞所有蛋白质（至少是大部分）分离与鉴定。蛋白质组学研究的基本步骤及相
21、关技术第一步,运用 2DE 技术分离样品中的蛋白质 .第二步,运用质谱技术鉴定分离的蛋白质.第三步,运用生物信息学技术存储,处理,比较获得的数据.双向凝胶电泳(2DE) 应用于分离蛋白质混合物的技术。 原理：第一项基于蛋白质等电点不同在 PH 梯度胶内等电聚焦；第二项则根据蛋白质分子量不同进行 SDS-PAGE 电泳分离，从而最终把复杂蛋白质混合物中的蛋白质在二维平面上分开。生物质谱技术极高的灵敏度和对结果的迅速获得而正成为蛋白质鉴定分析的主要支撑技术.生物质谱技术的原理:通过离子化装置将分子转化为气态离子,接着通过质谱分析器按照荷质比(M/Z)不同进行分离,最后转化到离子检测装置.目前用来分
22、析蛋白质和肽的样品离子技术主要有: 基质辅助激光解吸收离子化质谱(MALDI),电子喷射离子化质谱(ESI), 飞行时间质谱(TOF),串联质谱(MS/MS) 等.生物信息学(Bioinformaticas)生物信息学是指生物学与计算机科学以及应用数学等学科相互交叉而形成的一门新兴学科, 它主要是通过生物大分子信息的获得,加工,存储,分类,检索与分析,以达到理解生物大分子信息的生物学意义.蛋白质组研究的重要历史事件1994 年,Marc Wilkins 最早提出了蛋白质组 (Proteomics)的概念.1995 年,悉尼大学 Humphery Smith I 实验室与 Willams 等四家
23、实验室共同分离与鉴定Mycoplasma genitaium 的蛋白质组,“Proteome”首次出现。2001 年,国际人类蛋白质组组织(HUPO)宣告成立。2002 年,第一次国际人类蛋白质组大会召开. “人类血浆蛋白质组计划(HPPP)” 和人类肝脏蛋白质组计划(HLPP)首批执行计划启动。人类蛋白质组计划（Human Proteome Project） ，旨在归类和描绘出人体内的所有蛋白质。“人类蛋白质组计划”是继人类历史上三大有影响的“计划”“曼哈顿原子弹计划” 、“阿波罗登月计划”和“人类基因组计划”之后，全球共同实施的又一重大科研计划。Human Liver Proteome P
24、roject (HLPP) ，中国牵头的人类肝脏蛋白质组计划。Plasma Proteome Project (PPP) ，美国牵头的人类血浆蛋白质组计划。HLPP 计划的总体目标包括：两谱（表达谱、修饰谱） ；三图（定位图、连锁图和结构图） ；三库（样本库、抗体库、数据库） 。PPP 的研究目标先期目标：比较样本收集、处理和储存过程对血浆蛋白质组的影响；比较不同技术平台的优缺点、灵敏度和局限性；比较高丰度蛋白处理方法；数据提取、整理、储存和提交的标准化最终目标：全面认识人类血浆蛋白质组；揭示血浆蛋白组在世界不同种族和不同国家的同一种族人群中的变异度；认识人类在特定时间和特定生理条件下的血浆蛋
25、白质组；药物作用和疾病对血浆表达蛋白的影响等。蛋白质和肽的分离（一）蛋白质的分离双向凝胶电泳技术原理： 根据蛋白质化合物的等电点和相对分子量的特异性，将蛋白质化合物在第一个方向上按照等电点高低进行分离（等电聚焦） ，在第二个方向上按照相对分子质量大小进行分离（十二烷基硫酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳， SDS-PAGE） 。双向电泳技术、计算机图像分析与大规模数据处理技术以及质谱技术被称为蛋白质组研究的三大基本支撑技术1.一维等电聚焦电泳 isoelectric focusing，IEF 原理：蛋白质等电点 pI 是由其内部氨基酸组成决定的物理化学常数。把蛋白质加入到含有pH 梯度的载体时，当介质
26、pH 高于其等电位置时，蛋白质带负电，反之带正电；此时外加一个电场，蛋白质分子就分别向正极或负极移动，当达到其等电点位置时，蛋白质不带电就不再漂移。这样，蛋白质组内的蛋白质按照 pI 不同分布在胶上不同位置。 2. SDS-PAGE 电泳1、条平衡后 IPG 胶可直接加在二向 SDS-PAGE 凝胶的表面，一向胶和二向胶的接触是影响电泳重复性的一个主要因素，不良接触（如中间有气泡）会产生点扭曲。2、避免电泳时垂直胶在电极中移位，需要用 0.5%的琼脂糖电极缓冲溶液封胶，封胶时温度不能太高，切不可引入气泡。电极缓冲溶液：500ml， 5 ，7.5g Tris,2.5g SDS,36g Glyci
27、ne3、大规模蛋白质组分析，需要成批二向 SDS-PAGE 同时运行可以获得图谱的重复性。APB 公司的垂直电泳仪 Ettan DaltII 和 Bio-Rad 的 Protean II XI 垂直胶操作简单、上样量大、重复性好，可以同时运行 12 块胶。4、运行步骤：第一步：每块胶限流 20mA、40min，此时 IPG 胶上的蛋白质进入二维胶。第二步：每块胶限流 30mA 至溴酚蓝前沿到达二维胶底部，约需 5h。2-D 凝胶电泳的挑战和问题1.低丰度蛋白质的检测、灵敏度不够。2.不同实验间蛋白质所在位置的漂移。3.不能全面代表膜蛋白或疏水蛋白的真实情况。4.极酸极碱蛋白质的分离难度很大。5
28、.某些蛋白质在等电聚焦缓冲液中低溶解度。6.特大分子量的蛋白质的检测难。7.特小分子量的蛋白质的检测难。8.容易受污染。9.处在变性的条件。10.速度慢且烦琐。（二）肽分离高效液相色谱法（High performance Liquid Chromatography，HPLC ）分析肽混合物的方法HPLC 主要分离模式和特征： 反相色谱：疏水性；离子交换色谱：强阳离子交换色谱：净正电荷；强阴离子交换：净负电荷。排阻色谱（分子筛）：肽大小/分子质量；亲和色谱：与特定功能基团的相互作用。串联 HPLC：连续使用各种不同的分离模式称为 “串联 HPLC”。串联 LC 原理是不同分离模式的结合使用可使混
29、合物中的肽得到更大程度的分离。串联 LC 法优点：1.大大增加了所鉴定肽的数量；2.有助于鉴定混合物中的低丰度的肽。优点 缺点2-DE 高分辨率，1000 个蛋白质；可得到等电点、相对分子质量信息可得到蛋白质表达谱；可平行运行多个胶。费时，费力；不易自动化；疏水，酸性，碱性200kDa；蛋白易丢失，样品负载量有限。2D-HPLC 快速，可分离各种蛋白质，易于自动化；样品在液相，馏分易收集；可做样品制备或浓缩不能得到等电点、相对分子质量信息；尚未实现平行操作；不易得到蛋白质表达谱；分辨率不够高。蛋白质的鉴定生物质谱技术质谱(MS)技术是利用离子化的帶电物体在电场中的移动来探测出分子的重量质谱仪包
30、含了五个主要的系统：將不同型态样品倒入质谱仪的进样系统(sample introduction)使样品游离成气态离子形式的离子源系统(ionization source)依质荷比(m/z : mass to charge ratio)不同分离各个样品离子的 质量分析仪(mass analyzer)探测各样品离子探测器(detector)；將离子探测訊號转換的数据处理系统(data system)。 1.基本原理简介-电离 Ionization ：将待测物处理过后产生气相的离子，并带有电荷。两种最有效的测定蛋白质质谱的电离（软电离）方法：MALDI；ESI。基质辅助激光解吸电离技术 MALDI(
31、Matrix-assisted laser desorption/ionization) 待测物质的溶液与能够吸收紫外波长的基质溶液混合后蒸发，使分析物与基质成为晶体或半晶体，用一定波长的脉冲式激光进行照射时，基质分子能有效的吸收激光的能量，使基质分子和样品分子进入气相并得到电离。 电喷雾电离质谱术 ESI（ electrospray ionisation ）样品溶解在极性 的、 挥发性缓冲液中 (不含盐) ，通过不锈钢毛细管 (70 - 150 mm) 以10-100 mL/min 的速度进样。将 3-4 kV 的高压加在喷嘴上，使样品 变成雾状液滴。雾状液滴直接穿过高真空区域，液滴逐渐挥发
32、，尺寸慢慢接近样品分子的尺寸 (依然携带一定的电荷)。流出液在高电场下形成带电喷雾，在电场力作用下穿过气帘；气帘的作用：雾化；蒸发溶剂；2.质量分析器肽质量指纹谱（peptide mass fingerprinting，PMF）肽质量指纹谱鉴定蛋白质是目前蛋白质组研究中较为常用的鉴定方法。PMF 是指蛋白质被酶切位点专一的蛋白酶水解后得到的肽片段质量图谱。由于每种蛋白质的氨基酸序列都不同，蛋白质被酶水解后，产生的肽片段序列也各不相同，其肽混合物质量数亦具特征性，所以称为指纹谱。测定肽混合物质量数最有效的质谱仪是 MALDI-TOF-MS，灵敏度高，谱峰简单，每个谱峰代表一种肽段。MALDI-T
33、OF-MS 适宜测量分子质量在 500 Da 以上的分子，在几千道尔顿以内质量准确度较高。串联质谱测定多肽序列原理:肽离子在串联的质量分析器的碰撞池中与中性气体原子碰撞，吸收能量裂解成一系列片段离子，根据其质荷比可推导出该肽段的氨基酸序列。蛋白质检测技术1. 考染（考马氏亮蓝染色）考染可以检测到 30-100ng 蛋白质，其灵敏度远低于银染或荧光检测。但考染的优点是染色过程简单，所需配制的试剂少，操作简便，无毒性，染色后的背景及对比度良好，与下游的蛋白质鉴定方法兼容。在样品量允许的情况下，考染是一个比较好的选择。（1）考马氏亮蓝与蛋白质反应机理：考马氏亮蓝（Commassie brillian
34、t blue）是一类三苯基甲烷衍生物，其结构见下图。分为 R-250（红兰色） 、R-350 （红兰色） 、G-250 （蓝绿色） ，它们与蛋白质结合生成深蓝色复合物，在 464-595nm 有吸收峰（ 595nm 最大） ，并且在比较宽的范围内（15-20 g ）扫描峰的面积与蛋白质量成线性关系，因此可在595nm 对蛋白质进行定量检测。在一定 pH 条件下，这种染料-蛋白质复合物被完全解聚。（2）考染特点：可以获得无背景或低背景的图谱；染色过程需 24-48h，所需时间较长；灵敏度不高，为 100-10ng，只能检测 10- 100ng 的蛋白质，低丰度的蛋白质难以显色。2. 银染银染是非
35、放射性染色方法中灵敏度最高的，其灵敏度可达 200pg。(1)原理：二维凝胶在固定液中固定后，在含戊二醛的溶液中增敏，然后浸泡在银盐溶液中，蛋白与 Ag+络合，凝胶空白背景中 Ag+结合不牢而被冲洗，然后在碱环境中络合的 Ag+被还原成金属银，蛋白点上金属银被曝光显示棕黄色或棕黑色。(2)特点A 银染分酸性（ AgNO3）与碱性（Ag(NH3)2+）两种,酸性染色背景浅、容易控制，碱性灵敏度稍高，但背景深、不容易控制。B 相对于考染，灵敏度高，可达 200pg。C 但由于存在戊二醛的特异性反应，对下一步的酶切肽谱提取存在困难；增敏过程蛋白质被部分提取至胶外。戊二醛的作用是利用醛基的交联作用和反
36、应活性，提高银染的灵敏度3.负染标准考染方法所存在的一个缺点是染色步骤中含蛋白质固定过程，银染法除了固定过程外，还有增敏步骤，这些步骤会将蛋白质提取至胶外，从而减少蛋白质产量，使得用于随后微量化学表征的样品量更少了。负染的开发则是专门为了提高 PAGE 胶上蛋白质的回收率。负染灵敏度稍高于考染，可达到 50ng 以下。（1）特点A 负染能提高 SDS-PAGE 胶上蛋白质的回收率，常用有铜染、锌 -咪唑染等。负染色结果在凝胶表面产生半透明背景，而凝胶显示黑色背景或相应底色，蛋白质以透明形式被检测出来，而且蛋白质被很好地保存下来。B 显色过程仅需 5-15min，蛋白质的生物学活性可以得到保持。
37、C 蛋白质易从胶上取出，一般用 EDTA 络合金属离子就可转移出蛋白质。 D 灵敏度 15ng。(2)原理（锌-咪唑染料）：咪唑存在时，自由或弱结合的锌离子以锌-咪唑形式沉淀下来，而大部分锌离子因与蛋白质结合牢固而留在胶上，从而导致半透明背景上的空白区域，这就是负染过程。4.荧光染色荧光试剂显色对蛋白质无固定作用，与质谱兼容性好，而其灵敏度与银染相仿，荧光检测正受到普遍关注和应用。(1)原理：利用荧光染料对蛋白质进行标记，在光激发下产生荧光，通过扫描得到图象。比如用甲基 Cy3 与甲基 Cy5 两种染料分别对两个不同蛋白样品进行荧光标记，并在一块 2-DE 胶上进行运行，由于两种染料激发波长不同，扫描时可得到两张有差异的图象，因此可用于差异蛋白质组学研究。由于是在同一块胶上运行，完全避免实验因素对重复性的影响(2)特点：灵敏度 250pg 与银染相近，但线性范围高于银染。蛋白质被荧光共价修饰，改变了移动性能，降低了溶解性，导致质谱鉴定出现偏差。不同样品由于所含蛋白质可被荧光修饰的功能基团数不一样，灵敏度变化不一样。染色方法 灵敏度 线性范围 与质谱兼容性 费用 硬件要求考染 100ng 3 + + +银染 200pg 7 + + +负染 15ng 3 + + +荧光标记 250pg 104 + + +
