1、第 七 章 微生物的遗传,基本概念,遗传(heredity)：亲代生物传递给子代一套实现与其相同形状的遗传信息。特点：具稳定性。 遗传型（genotype）：又称基因型，指某一生物个体所含有的全部基因的总和，是一种内在可能性或潜力。 遗传型 + 环境条件 表型表型（phenotype）：指生物体所具有的一切外表特征和内在特性的总和，是一种现实存在，是具一定遗传型的生物在一定条件下所表现出的具体性状。,变异(variation):生物体在外因或内因的作用下，遗传物质的结构或数量发生改变。变异的特点：a.在群体中以极低的几率出现，（一般为10-610-10）；b.形状变化的幅度大； c. 变化后形
2、成的新性状是稳定的，可遗传的。 饰变（modification）：指不涉及遗传物质结构改变而只发生在转录、转译水平上的表型变化。特点是：a.几乎整个群体中的每一个个体都发生同样的变化；b.性状变化的幅度小；c.因遗传物质不变，故饰变是不遗传的。引起饰变的因素消失后，表型即可恢复。,例如：粘质沙雷氏菌：在25下培养，产生深红色的灵杆菌素；在37下培养，不产生色素；如果重新将温度降到25，又恢复产色素的能力。,第一节 遗传变异的物质基础,证明DNA（RNA）是遗传变异物质基础的三个经典实验转化实验，噬菌体感染实验，病毒的拆开与重建实验 遗传物质在微生物细胞内存在烦人部位和方式染色质DNA染色质外D
3、NA:质粒DNA（细菌，放线菌，酵母菌）线粒体DNA(真核微生物),细菌的质粒,定义：是一类小型闭合环状核外双螺旋DNA分子，能独立于细胞核进行自主复制。分子大小约为2100106D，携带有数个到数十个甚至上百个基因。 性质： 可以在细胞质中独立于染色体之外独立存在（游离态），也可以通过交换掺入染色体上，以附加体（episome）的形式存在； 质粒是一种复制子（replicon），根据自我复制能力的不同，可把质粒复制的控制形式分为严紧型（15个）和松弛型（10200个拷贝）质粒,可以通过转化、转导或接合作用而由一个细菌细胞转移到另一个菌细胞中，使两个细胞都成为带有质粒的细胞；质粒转移时，它可以
4、单独转移，也可以携带着染色体（片段）一起进行转移，所以它可成为基因工程的载体。 对于细菌的生存并不是必要的 编码基因多样：产生毒素、抗药性、固氮、降解功能等。 存在范围：很多细菌如Shigella、Streptococcus lactis 、 S.aureus 、 E.coli等,几种代表性质粒,Figure. Representative FERTILITY PLASMID. A fertility plasmid carries the genes for conjugation as well as a number of other genes. In this figure the
5、fertility plasmid also carries antibiotic resistant genes.,1. F因子（fertility factor）：又称致育因子或性因子，62106D，94.5kb，相当于核染色体DNA 2%的环状双链DNA，足以编码94个中等大小多肽，其中1/3基因（tra区）与接合作用有关。存在于肠细菌属、假单胞菌属、嗜血杆菌、奈瑟氏球菌、链球菌等细菌中，决定性别。,R因子由相连的两个DNA片段组成，即抗性转移因子(resistence transfor factor, RTF)和抗性决定R因子(R-determinant），RTF为分子量约为11106
6、D，控制质粒copy数及复制，抗性决定因子分子量大小不固定，从几百万到100106Dalton以上。其上带有其它抗生素的抗性基因。 R-因子在细胞内的copy数可从12个到几十个，分为严紧型和松弛型两种，经氯霉素处理后，松弛型质粒可达20003000个/细胞。,2. R因子(resistance factor),是近年来在Rhizobium（根瘤菌属）中发现的一种质粒，分子量为200300106Dalton，比一般质粒大几十倍到几百倍，故称巨大质粒，其上有一系列固氮基因。,4. 巨大质粒（mega质粒）,3. 降解性质粒,只在假单胞菌属中发现。编码一系列能降解复杂物质的酶，从而能利用一般细菌所
7、难以分解的物质做碳源。这些质粒以其所分解的底物命名，例如有分解CAM（樟脑）质粒，XYL（二甲苯）质粒，SAL（水杨酸）质粒，MDL（扁桃酸）质粒，NAP（奈）质粒和TOL（甲苯）质粒等。,核外DNA的种类,第二节 基因突变和诱变育种,突变(mutation): 指生物体的表型突然发生的可遗传的变化。 染色体畸变:细胞学上可以看到的染色体变化 基因突变:细胞学上看不到遗传物质的变化 突变体(mutant)：发生了突变的微生物细胞或菌株 野生型(wild type)：从自然界分离到的任何微生物在其发生突变前的原始菌株,依表型的改变分为： 营养缺陷型：因突变而丧失产生某种生物合成酶的能力，并因而成
8、为必须在培养基中添加某种物质才能生长的突变类型。 抗性突变型：因突变而产生了对某种化学药物或致死物理因子的抗性 条件致死突变型：突变后在某种条件下可正常生长繁殖，而在另一条件下却无法生长繁殖的突变型 产量突变型，形态突变型，抗原突变型等,一、基因突变 (一)基因突变的类型,按是否比较容易、迅速地分离到发生突变的细胞来分： 选择性突变株（selective mutant）：具有选择标记（如营养缺陷性、抗性突变型、条件致死突变型），只要选择适当的环境条件，如培养基、温度、pH值等，就比较容易检出和分离到。 非选择性突变株（non-selective mutant）：无选择标记（如产量突变型、抗原突
9、变型、形态突变型），能鉴别这种突变体的惟一方法是检查大量菌落并找出差异。,（二）突变率,定义：每一细胞在每一世代中发生某一性状突变的几率。 突变率为108意味着一个含108个细胞的群体，当其分裂为2108个细胞时，一个个体的某一个基因即可发生一次突变。 突变率=突变细胞数/分裂前群体细胞数 突变是独立的。某一基因发生突变不会影响其它基因的突变率。在同一个细胞中同时发生两个基因突变的几率是极低的，因为双重突变型的几率只是各个突变几率的乘积。,若干细菌某一性状的自发突变率,菌 名 突变性状 突变率 E. coli 抗T1噬菌体 3108 E. coli 抗T3噬菌体 1107 E. coli 不发
10、酵乳糖 11010 E. coli 抗紫外线 1105 Staphylococcus aureus 抗青霉素 1107 S. aureus 抗链霉素 1109 Salmonella typhi 抗25g/L链霉素 1106 Bacillus megaterium 抗异烟肼 5105,（三）突变的特点,适用于整个生物界，以细菌的抗药性为例。 不对应性:突变的性状与突变原因之间无直接的对应关系。 自发性:突变可以在没有人为诱变因素处理下自发地产生。 稀有性：突变率低且稳定。 独立性：各种突变独立发生，不会互相影响。 可诱发性：诱变剂可提高突变率。 稳定性：变异性状稳定可遗传。 可逆性：从原始的野生
11、型基因到变异株的突变称为正向突变（forward mutation），从突变株回到野生型的过程则称为回复突变或回变（back mutation或reverse mutation）。,（四）突变机制,诱变剂（mutagen）：凡能提高突变率的任何理化因子，就称为诱变剂.种类：诱变剂的种类很多，作用方式多样。即使是同一种诱变剂，也常有几种作用方式。按照遗传物质结构变化的特点讨论几种有代表性的诱变剂的作用机制。,（1）碱基置换（substitution）,定义：对DNA来说，碱基的置换属于一种染色体的微小损伤（microlesion），一般也称点突变（point mutation）。它只涉及一对碱基
12、被另一对碱基所置换。 分类：转换（transition），颠换（transversion）。,对某一具体诱变剂来说，即可同时引起转换与颠换，也可只具其中的一种功能。根据化学诱变剂是直接还是间接地引起置换，可把置换的机制分成以下两类来讨论。,直接引起置换的诱变剂,定义：一类可直接与核酸的碱基发生化学反应的诱变剂，不论在机体内或是在离体条件下均有作用。 种类：很多。例如亚硝酸、羟胺和各种烷化剂（硫酸二乙酯，甲基磺酸乙酯，N-甲基-N硝基-N-亚硝基胍，N-甲基-N-亚硝基脲，乙烯亚胺，环氧乙酸，氮芥等）。 作用：它们可与一个或几个核苷酸发生化学反应，从而引起DNA复制时碱基配对的转换。 羟胺只引起
13、GCA:T， 其余都是可使GC=A:T发生互变的。 能引起颠换的诱变剂很少，只是部分烷化剂才有（参见下表）。,亚硝酸可以使碱基发生氧化脱氨作用胞嘧啶（C） 尿嘧啶（U）腺嘌呤（A） 次黄嘌呤（H）鸟嘌呤（G） 黄嘌呤（X） 这些反应及形成物均可在DNA复制中产生影响，主要是使碱基对发生转换。,碱基转换的分子机制以亚硝酸为例,腺嘌呤（A）变成次黄嘌呤（H）后引起的转换过程,腺嘌呤氧化脱氨后形成烯醇式次黄嘌呤（He） He通过互变异构效应形成酮式次黄嘌呤（HK） DNA复制时，HK 与胞嘧啶（C）配对 DNA第二次复制时，C与G正常配对，实现转换。,亚硝酸引起的AT-GC转换细节,黄嘌呤,鸟嘌呤,
14、这类诱变剂主要是一些碱基类似物 ,如：5-溴尿嘧啶(5-BU)和5-氨基尿嘧啶（5AU）、叠氮胸腺嘧啶（AIT）等； 作用方式：通过活细胞的代谢活动参入到DNA分子中，主要是在DNA复制时碱基类似物插入DNA中，引起碱基对配对错误，造成碱基置换。 以5-溴尿嘧啶(5-BU)为例： 5-BU是胸腺嘧啶（T）的类似物 ，酮式的5-BU可以和A配对，烯醇式的5-BU可以和G配对，在DNA分子复制的过程中，由于5-BU的插入和互变异构导致碱基置换。,间接引起置换的诱变剂,5-BU引起的转换细节,从上图中，还可以看到5-BU的掺入引起的GC回复到AT的过程。通过这两个图示，就很容易理解为什么同一种诱变剂
15、既可造成正向突变，又可使它产生回复突变的原因了。也可以知道，为什么像5-BU这类代谢类似物只有对正在进行新陈代谢和繁殖着的微生物才起作用，而对休止细胞、游离的噬菌体粒子或离体的DNA分子却不起作用。,（2）移码突变,定义：frame-shift mutation 或 phase-shift mutation，指诱变剂使DNA分子中增加（插入）或缺失一个或少数几个核苷酸，从而使该部位后面的全部遗传密码发生转录和转译错误的一类突变。由移码突变所产生的突变株，称为移码突变株（frame-shift mutant）。与染色体畸变相比，移码突变也只能算是DNA分子的微小损伤。吖啶类染料，包括原黄素、吖啶
16、黄、吖啶橙和-氨基吖啶等，以及一系列称为ICR类的化合物，都是移码突变的有效诱变剂。,诱发移码突变的几种代表性化合物,吖啶类染料都是平面型的三环分子，其结构与一个嘌呤嘧啶碱基对十分相似。,吖啶类化合物的诱变机制,至今还不很清楚，有人认为，由于它们是一种平面型三环分子，结构与一个嘌呤嘧啶对十分相似，故能嵌入两个相邻DNA碱基对之间，造成双螺旋的部分解开（两个碱基对原来相距0.34nm，当嵌入一个吖啶分子时，就变成0.68nm），从而在DNA复制过程中，会使链上增添或缺失一个碱基，结果就引起了移码突变。,吖啶类化合物诱发的移码突变及其回复突变图示,嘧啶对紫外线的敏感性要比嘌呤强得多。嘧啶的光化产物
17、主要是二聚体和水合物。其中了解较清楚的是胸腺嘧啶二聚体的形成和消除。 紫外线的主要作用是使同链DNA的相邻嘧啶间形成共价结合的胸腺嘧啶二聚体，引起双链结构扭曲变形，阻碍碱基间的正常配对，从而有可能引起突变或死亡。在互补双链间形成嘧啶二聚体的机会较少。但一旦形成，就会妨碍双链的解开，因而影响DNA的复制和转录，并使细胞死亡。,（3）紫外线对DNA的损伤及其修复,光复活作用（photoreactivation）：经UV照射的微生物立即暴露于可见光下，明显降低其死亡率的现象。 UV处理E.coli的实验结果对照：8106个/ml U.V. 100个/ml 试验：8106个/ml U.V. 36049
18、0nm 2106个/ml 经UV照射形成的含胸腺嘧啶二聚体的DNA分子，在黑暗下与一种光激活酶（也称光裂合酶）结合形成复合物，后者暴露在可见光（300500nm）下时，此酶会因获得光能而发生解离，从而使二聚体重新分解成单体。与此同时，光激活酶也从复合物中释放出来，以便重新执行功能。 由于一般的微生物中都存在着光复活作用，所以进行紫外线诱变育种时，只能在红光下照射及处理照射后的菌液。,可见光，30分,紫外诱变方法 设备：紫外灯、磁力搅拌器、暗室等， 紫外灯：波长为253.7nm, 功率是15W处理时的照射距离：20cm 30cm 样品：要直接暴露在紫外灯下，厚度不能超过3mm，照射时，要用磁力搅
19、拌器搅拌。 处理剂量：常用照射时间或死亡率作为相对剂量。,由于微生物接受的照射剂量与灯的功率、照射距离、照射时间、菌液浓度、菌液厚度、细胞本身特性等因素有关，所以单纯用时间表示照射剂量并不完全可靠。一定的死亡率必定对应一定的照射剂量，所以，在实际应用中，用死亡率表示照射剂量更可靠。通常先绘制照射时间与死亡率的关系曲线，然后选择合适的剂量。生产上经常采用的剂量：死亡率为70%80%左右。,暗修复作用（dark repair，也称切除修复）,1.由核酸内切酶切开二聚体的5末端，形成3-OH和5-P的单链缺口 2.核酸外切酶从5-P到3-OH方向切除二聚体，并扩大缺口。 3.DNA聚合酶以另一条互补
20、链为模板，从原有链上暴露的3-OH端起合成缺失片段。 4.连接酶将新合成的3-OH与原有的5-P相连接。,若干诱变剂的作用机制及诱变功能,（4）染色体畸变（chromosomal aberration）,某些理化因子，如X射线等的辐射及烷化剂、亚硝酸等，除了能引起点突变外，还会引起DNA的大损伤（macrolesion）染色体畸变，它包括： 染色体结构上的变化：缺失（deletion）,重复（duplication）,易位（translocation）,倒位（inversion） 染色体数目的变化,染色体结构上的变化,染色体内畸变：只涉及一条染色体上的变化， 如发生染色体的部分缺失或重复时，可
21、造成基因的减少或增加； 如发生倒位或易位时，可造成基因排序的改变，但数目却不改变。 倒位-是指断裂下来的一段染色体旋转180后，重新插入到原来染色体的原位置上，从而使其基因顺序与其它的基因顺序相反； 易位-是指断裂下来的一小段染色体再顺向或逆向地插入到同一条染色体的其它部位上。 染色体间畸变：指非同源染色体间的易位。,染色体畸变,转座因子（transposible element）,定义：在染色体组中或染色体组间能改变自身位置的一段DNA顺序。也称作跳跃基因（jumping gene）或可移动基因（movable gene）。 种类：插入序列，转座子，Mu噬菌体,插入序列(IS，inserti
22、on sequence),IS分子量最小（仅0.71.4kb），只能引起转座（transposition）效应而不含其它基因。可存在于染色体、F因子等质粒上。 E.coli的F因子和核染色体组上有一些相同的IS,通过这些同源序列间的重组，就可使 F因子插入到E.coli的核染色体组上，从而使后者成为Hfr菌株。因IS在染色体组上插入的位置和方向的不同，其引起的突变效应也不同。IS引起的突变可以回复，其原因可能是IS被切离，如果因切离部位有误而带走IS以外的一部分DNA序列，就会在插入部位造成缺失，从而发生新的突变。,转座子(Tn，transposon),Tn又称转位子，易位子,与IS和Mu噬菌
23、体相比，Tn的分子量是居中的（一般为225kb）。它含有几个至十几个基因，其中除了与转座作用有关的基因外，还含有抗药基因或乳糖发酵基因等其它基因。Tn虽能插到受体DNA分子的许多位点上，但这些位点似乎也不完全是随机的，其中某些区域更易插入。,Mu噬菌体,Mu噬菌体（即 mutator phage，诱变噬菌体）：它是E.coli的一种温和噬菌体。与必须整合到宿主染色体特定位置上的一般温和噬菌体不同，Mu噬菌体并没有一定的整合位置。与以上的IS和Tn两种转座因子相比，Mu噬菌体的分子量最大（37kb），它含有20多个基因。Mu噬菌体引起的转座可以引起插入突变，其中约有2%是营养缺陷型突变。,(5)
24、自发突变机制,微生物自身有害代谢产物的诱变效应 过氧化氢是普遍存在于微生物体内的一种代谢产物。它对Neurospora（脉孢菌）有诱变作用，这种作用可因同时加入过氧化氢酶而降低，如果在加入该酶的同时又加入酶抑制剂KCN，则又可提高突变率。这就说明，过氧化氢很可能是“自发突变”中一种内源性诱变剂。在许多微生物的陈旧培养物中易出现自发突变株，可能也是同样的原因。, 互变异构效应T、G的第六位上是酮基，会以酮式或烯醇式的状态出现;C、A的第六位上是氨基，会以氨基或亚氨基的状态出现 平衡一般趋向于酮式或氨基式，故在DNA双链结构中一般总是以AT和GC碱基配对的形式出现,在偶然情况下，当T以稀有的烯醇式
25、出现时，其相对位置上就出现G;同样，如果C以稀有的亚氨基形式出现，则在新合成DNA单链中与C相对应的位置上就将是A。这可能就是发生相应的自发突变的原因。 据统计，碱基对发生自发突变的几率约为10 8 10 9。, 环出效应即环状突出效应。有人提出，在DNA的复制过程中，如果其中某一单链上偶然产生一个小环，则会因其上的基因越过复制而发生遗传缺失，从而造成自发突变。下图就是环出效应的设想机制。在上链中，标记B处发生“环出”，故只有A及C能获得复制， 从而发生自发突变。而在下链中，复制仍正常进行, 紫外等背景辐射引起,诱变育种：是用物理或化学的诱变剂使诱变对象内的遗传物质（DNA）的分子结构发生改变
26、，引起性状变异并通过筛选获得符合要求的变异菌株的一种育种方法。,诱变育种具有极其重要的实践意义。当前发酵工业和其他微生物生产部门所使用的高产菌株，几乎毫无例外地都是通过诱变育种而明显提高其生产性能的。,二、诱变育种,诱变育种的步骤,诱变育种的基本流程,选择选择合适的出发菌株 制备待处理的菌悬液 诱变处理 筛选 保藏和扩大试验,1.出发菌株的选择 出发菌株用来育种处理的起始菌株 出发菌株应具备： 对诱变剂的敏感性高； 具有特定生产性状的能力或潜力； 出发菌株的来源； 自然界直接分离到的野生型菌株： 历经生产考验的菌株： 已经历多次育种处理的菌株：,2.制备细胞（孢子）悬液 要求： 菌体处于对数生
27、长期，并使细胞处于同步生长； 细胞分散且为单细胞，以避免表型迟延现象 方法：玻璃珠打散10-15min;加.3%吐温80（表面 活性剂）用无菌脱脂棉过滤。 制备： 物理诱变剂使用生理盐水；化学诱变剂使用缓冲液 浓度： 细菌、放线菌 108个/ml 霉菌、酵母菌 106个/ml,表型迟延现象:指某一突变在DNA复制和细胞分裂后，才在表型上显示出来，造成不纯的菌落。 产生原因：分离性迟延现象;生理性迟延现象,3.诱变处理诱变剂的作用：提高突变的频率；扩大产量变异的幅度 选择诱变剂的种类：在选用诱变剂时，在同样效果下，应选用最方便的因素；而在同样方便的情况下，则应选择最高效的因素。在物理诱变剂中，尤
28、以紫外线为最方便，而在化学诱变剂中，一般可选用诱变效果最为显著的“超诱变剂”，如NTG（亚硝基胍）。 简便有效的诱变方法：紫外线的照射最为方便。化学诱变剂的种类、浓度和处理方法尤其是中止反应的方法很多，实际工作时可参看有关书籍。,诱变处理方式： 单一因子处理：复合因子处理：,4. 菌种筛选 4.1 筛选方案： 实际工作中，为了提高筛选效率，往往将筛选工作分为初筛和复筛两步进行。 初筛的目的：删去明确不符合要求的大部分菌株，把生产性状类似的菌株尽量保留下来，使优良性状的菌株不至于漏网；因此，初筛工作以量为主，测定的精确性还在其次；初筛手段应尽可能快速、简单。 复筛的目的：确认符合要求的菌株；复筛
29、以质为主，应精确测定每个菌株的生产指标。,筛选是最为艰难的也是最为重要的步骤.,可见，设计和采用效率高的筛选方案和方法极其重要,以选育高产突变株为例，诱变育种的基本环节如下,第一轮： 一个出发菌株选出200个菌株选出50株选出5株,诱变处理,初筛,（每瓶一株）,复筛,（每瓶四株）,第二轮： 5个出发菌株 选出50株 选出5株,40株 40株 40株 40株 40株,诱变处理,初筛,复筛,（每瓶一株）,（每瓶四株）,变异菌的一般筛选方法,平皿快速检测法 变色圈法（筛选淀粉酶高产菌株） 透明圈法（筛选蛋白酶高产菌株） 生长圈法（筛选抗生素抗性菌株） 抑菌圈法（筛选抗生素高产菌株） 梯度平板法 摇瓶
30、培养法,以温度敏感突变为例： 筛选方法： 用途：常用于提高代谢物产量 原因：是由于某一酶蛋白结构改变后，在高温下活力丧失,条件抗性突变型的筛选,特殊变异菌的筛选方法,在富含生物素的培养基中进行发酵时： 先在30（允许条件）中进行培养以得到大量菌细胞，适当时间后提高温度（ 40 ，非允许条件），即能获得谷氨酸的过量生产。,应用举例,由谷氨酸产生菌乳糖发酵短杆菌2256，经诱变处理得到温度敏感变异株Ts88: 30培养时能正常生长 40是死亡，但能在富含生物素的培养基中积累谷氨酸（而野生型却受生物素的反馈抑制）。,影响谷氨酸产生菌细胞膜通透性的物质可分为两大类：一类是生物素、油酸和表面活性剂，其作
31、用是引起细胞膜的脂肪酸成分或量的改变，尤其是改变油酸含量，从而改变细胞膜通透性； 另一类是青霉素，其作用是抑制细胞壁肽聚糖合成中肽链的交联，由于细胞膜失去细胞壁的保护，细胞膜受到物理损伤，从而使渗透性增强。生物素作为脂肪酸生物合成最初反应的关键酶乙酰CoA羧化酶的辅酶，参与了脂肪酸的合成，进而影响磷脂的合成。当磷脂合成减少到正常量的一半左右时，细胞变形，谷氨酸向膜外漏出，积累于发酵液中。一般情况下，生物素作为脱羧酶、羧化酶、脱氢酶的辅基而影响细胞的物质代谢过程。,方法：梯度平板法（gradient plate）,结构类似物抗性突变株的筛选,异烟肼是吡哆醇（维生素B6）的结构类似物 抗药性突变株
32、的应用： 作为菌株的遗传标记 作为生产菌种（结构类似物抗性变异株）,抗生素抗性变异株的筛选,与营养缺陷突变有关的三类遗传型个体： 营养缺陷型：经诱变产生的一些合成能力出现缺陷，而必须在培养基内加入相应有机养分才能正常生长的变异菌株。如：lys -， bio- 野生型：自然界分离到的任何微生物，在其发生营养缺陷突变前的原始菌株，为该微生物的野生型。 原养型 ：指营养缺陷型突变菌株回复突变或重组后产生的菌株，与野生型的表型相同。,营养缺陷型(auxotroph)的筛选,与筛选营养缺陷型突变株有关的三类培养基,基本培养基（MM）-：凡是能满足野生型菌株营养要求的最低成分的合成培养基。 完全培养基（C
33、M）+：满足一切营养缺陷型菌株生长的天然或半合成培养基。 补充培养基（SM）x：在MM中有针对性地加入一或几种营养成分以满足相应营养缺陷型菌株生长的合成培养基。,营养缺陷型诱变筛选步骤及方法,auxo的鉴定,诱变处理,auxo的浓缩,auxo的检出,缺陷型的浓缩,抗生素法 原理：青霉素、制霉菌素等抗生素作用于生长着的微生物细胞，对休止态细胞无作用。 方法：将菌培养在含抗生素的MM基中,菌丝过滤法,适用于：丝状（放线菌、霉菌） 原理：基本培养基上只有发育成菌丝；auxo孢子可通过滤膜，野生型菌丝不能通过。,缺陷型的检出,逐个检出法,影印平板培养法,夹层培养法,生长谱法 方法简便； 回变和污染不影
34、响结果 测定物质可为粉末或纸片,缺陷型的鉴定,测定一般应分两阶段： 测定是哪类物质的缺陷型； 根据第一阶段确定的范围，进一步确定是哪种具体化合物的缺陷型；,组合营养物法,步骤（以氨基酸缺陷型的鉴定为例）： a. 将多种营养因子编组； b. 将组合液的纸片放在涂菌的基本培养基上培养； c. 结果分析；,一组：1 2 3 4 5 二组：2 6 7 8 9 三组：3 7 10 11 12 四组：4 8 11 13 14 五组：5 9 12 14 15,营养因子分组编排时注意； 1）每组内无重复的营养因子 2）每组中应包含只出现一次的因子 3）每组中其他因子应分别出现二次,如：,一组：1 2 3 4
35、5 二组：2 6 7 8 9 三组：3 7 10 11 12 四组：4 8 11 13 14 五组：5 9 12 14 15,缺陷型的应用,作为菌株的遗传标记：进行基因工程、诱变育种、 研究代谢过程时用作亲本标记； 作为生产菌种：aa、核苷酸等生产菌种； 作为aa、维生素、碱基的测定菌株。,Ames test：对化学诱变剂做检测,菌种：鼠伤寒沙门氏菌his -； 原理： his -在基本培养基上不长；而发生回复突变则长。,Ames test 方法示意图,第三节 基因重组,定义：凡把两个不同性状个体内的遗传基因转移到一起，经过遗传分子间的重新组合，形成新遗传型个体的方式，称为基因重组（gene
36、recombination）或遗传重组。 作用：重组可使生物体在未发生突变的情况下，也能产生新遗传型的个体。,微生物中各种形式基因重组的比较,基因重组的意义 杂交育种,杂交育种的优点：杂交育种选用了已知性状的亲本，因此，育种方向明确（比诱变育种前进了一大步）。杂交育种往往可以消除某一菌株在经过长期诱变处理后所出现的产量上升缓慢的现象。 杂交育种的缺点：由于杂交育种的方法较复杂，工作进展较慢，还很难像诱变育种技术那样得到普遍的推广和使用，尤其在原核生物的领域中，应用转化、转导或接合等重组技术来培育可应用于生产实践上的高产菌株的例子还不多见。上个世纪70年代后期，由于原生质体融合技术获得巨大的成功
37、后，才使重组育种技术获得了飞速的发展。,一、原核微生物的基因重组,转化 转导 接合 原生质体融合,R型活菌+S型死菌 S型活菌 定义：受体菌自然或在人工技术作用下直接摄取来自供体菌的游离DNA片段，并把它整合到自己的基因组中，而获得部分新的遗传性状的基因转移过程，称为转化。 有关名词： 受体菌：recipient/receptor，转化基因的接受者 供体菌：donor，转化基因的提供者 转化因子：来自供体菌的DNA片段 转化子：transformant，将转化基因重组进入自身染色体组的重组子,（一）转化(transformation),1. 转化的定义,受体细胞要处于感受态:受体细胞能从环境吸
38、取外源DNA 片段并实 现其转化的一种生理状态 供体DNA片段（转化因子）大小适宜，分子量一般为1 107 D 左右 菌株间的亲缘关系密切,2.转化发生的条件,3.转化的类型,根据感受态建立的方式，可以分为： 自然遗传转化natural genetic transformation 人工转化artificial transformation,感受态,影响感受态的因素：遗传因素，不同菌种的感受态出现在不同生长时期,如Streptococcus pneumoniae的感受态出现在生长曲线中的指数期的中期，Bacillus的一些种则往往出现在指数期末及稳定期的初期。环境因子的影响：cAMP、Ca2+
39、等最明显。如用CaCl2 处理E. coli可以诱发其产生感受态。 感受态细胞的比例：当处于感受态高峰时，群体中呈感受态的细胞因菌种而不同.如Bacillus subtilis不超过1015%，Streptococcus pneumonia和Haemophilus influenzae（流感嗜血杆菌）达到100% 转化DNA的最低浓度：在群体中含有15%感受态细胞时，1gDNA/ml细胞悬液即可有效发生转化,感受态因子：细胞外蛋白，Streptococcus pneumonia和Bacillus中分离的分子量为5,00010,000Dalton，可能存在于细胞膜上，可催化外来DNA分子的吸收或
40、降解细胞表面某种成分，以让细胞表面的DNA受体显露出来；也可能是一种自溶酶。对不同细菌，每个细胞上的DNA结合位点数不同。有人计算，在H. Influenzae上有410个，而在S. Pneumonia上则有3080个。S. Pneumonia的感受态细胞中提取的感受态因子可使同菌株的非感受态细胞变成感受态的，而Bacillus subtilis的感受态因子则无此功能。,转化因子,转化因子：本质是供体DNA片段，每一转化DNA片段的分子量都小于1107D，即约占细菌核染色体组的0.3%，其上平均约含15个基因。而粗制的DNA则分子量较大。 转化频率：一般只有0.11%，最高时亦达10%左右。据
41、研究，呈质粒形式（双链闭合环状）的转化因子，其转化频率最高（因为它进入受体菌中后，可不必与受体染色体进行交换、整合即可进行复制和表达）。,转化的过程,以S.Pneumonia strr为例，大致可分为六阶段： 吸附：双链DNA片段与细胞表面特定位点结合，细胞膜上的胆碱可促进这一过程。 切割：在吸附位点上的DNA被核酸内切酶分解，形成平均分子量为45106D的DNA片段； 入胞：DNA双链中的一条单链被膜上的另一种核酸酶切除，另一条单链逐步进入细胞. 重组：来自供体菌的单链DNA片段在细胞内与受体细胞核染色体组上的同源区配对，接着受体染色体组上的相应单链片段被切除，并被外来的单链DNA交换、整合
42、和取代，于是形成了一个杂合DNA区段。 复制：受体菌的染色体组进行复制，杂合区段分离成两个，其中之一获得了供体菌的转化基因。 转化子形成：当细胞发生分裂后，一个子细胞含供体基因，这就是转化子；另一个细胞与原始受体菌一样。,转化的过程,strr,strs,自然转化的普遍性,Streptococcus pneumoniae、Haemophilus（嗜血杆菌属）、Bacillus、Neisseria（奈瑟氏球菌属）、Rhizobium、Staphylococcus、Pseudomonas和Xanthomonas中多见。在若干放线菌和蓝细菌以及Saccharomyces cerevisiae、Neur
43、ospora crassa（粗糙脉胞菌）和Aspergillus niger中，也有转化现象。 两个菌种或菌株之间能否发生转化，与它们在进化过程中的亲缘关系有着密切的关系。但即使在转化率极高的菌种中，其不同菌株间也不一定都能发生转化。,人工转化,人工转化是通过人为诱导的方法，使细胞具有摄取DNA的能力，或人工地将DNA导入细胞内。方法： CaCl2处理细胞，使其成为能摄取外源DNA的感受态状态. 电穿孔法：用高压脉冲电流击破细胞膜，或击成小孔，使各种大分子（包括DNA ）能通过这些小孔进入细胞。,可转化的形状,荚膜多糖的合成 专一性酶的合成 专一性蛋白质的合成 抗药性,4.转染（transfe
44、ction）,定义：把噬菌体或其它病毒的DNA（或RNA）抽提出来，让它去感染感受态的宿主细胞，并进而产生正常的噬菌体或病毒的后代，这种现象称为转染（transfection）。 与转化的区别： 病毒或噬菌体并非遗传基因的供体菌 中间不发生任何遗传因子的交换或整合 最后不产生具有杂种性质的转化子,(二) 转导（transduction）,J.Lederberg等（1952）在Salmonella typhimurium（鼠伤寒沙门氏菌）中发现的。,1.转导及其发现,定义：以温和噬菌体为媒介，将供体细胞的DNA片段携带到受体细胞中，通过交换与整合，从而使后者获得前者部分遗传性状的现象，称为转导。
45、获得新遗传性状的受体细胞，称转导子。,2.转导的种类,完全普遍转导普遍转导流产普遍转导转导转导低频转导局限转导高频转导,噬菌体裂解宿主时可能有三种情况： 1）包入的完全是噬菌体的DNA（正常噬菌体） 2）包入的完全是细菌DNA（完全缺陷噬菌体） 3）部分带有噬菌体基因的DNA（部分缺陷噬菌体） 转导分别是由后两种噬菌体参与进行的。,噬菌体裂解第一个宿主,过程：供体菌 正常噬菌体 + 完全缺陷噬菌体少量裂解物 + 大量受体菌 遗传稳定的转导子,（1）普遍性转导（generalized transduction）,定义：通过完全缺陷噬菌体对供体菌任何DNA小片段的“误包”而实现其遗传性状传递至受体
46、菌的转导现象，称为普遍性转导。,P22裂解,1952年在鼠伤寒沙门氏菌中发现由P22介导的普遍转导,完全普遍转导,过程： P22在供体菌内增殖时，宿主的核基因组断裂，噬菌体成熟时，极少数（10 6 10 8）噬菌体的衣壳将与噬菌体头部核心大小相似的一段供体DNA片段误包入其中，形成了一个完全不含噬菌体自身DNA的缺陷噬菌体。 把少量供体菌裂解物与大量受体菌群体相混，使其感染复数（m.o.i）1，这种完全缺陷噬菌体就会将这一外源DNA片段导入受体细胞内。 由于一个受体细胞只感染了一个完全缺陷噬菌体，故受体细胞不会发生溶源化，不显示免疫性，不会产生正常的噬菌体；而将导入的外源DNA片段与受体细胞核
47、基因组上的同源区段配对，通过双交换而整合到受体菌染色体组中，所以使后者成为一个遗传性状稳定的转导子。,一个稳定的转导子的形成,第一次交换 第二次交换 交换完成，外源DNA掺入染色体组中,流产普遍性转导（abortive transduction）,概念：受体菌经转导获得的供体DNA片段在受体菌中不发生配对、交换和整合，也不迅速消失，而只是进行转录和转译（性状表达），这种现象就称为流产转导。,所以，能在选择性培养基平板上形成微小菌落就是流产转导的特点。,感染复数由于每一宿主细胞表面的特异性受体有限，因此所能吸附的噬菌体数目也有一个限量。每一敏感细胞所能吸附的噬菌体的数量,m.o.i一般很大，可达
48、250360。 由于超m.o.i的外源噬菌体吸附而引起的、不能产生子代噬菌体的裂解，称为自外裂解,2. 局限性转导,定义：通过部分缺陷的温和噬菌体把供体菌的少数特定基因携带到受体菌中，并获得表达的转导现象。 特点 噬菌体对供体菌和受体菌都是温和噬菌体 只能转导供体菌的个别特定基因，该特定基因由部分缺陷的噬菌体携带 缺陷噬菌体使由于其在形成过程中所发生的低频率（约105）“误切”，或由于双重溶源菌的裂解而形成（约形成50%缺陷噬菌体） 分类：低频转导与高频转导,转导的过程,该溶源菌被诱导裂解时，有极少数（ 105）的前噬菌体发生不正常切离，其结果会将插入位点两侧之一的少数宿主基因（如E.coli 前噬菌体的两侧分别为发酵半乳糖的gal基因或合成生物素的bio基因）连接到噬菌体DNA上（而噬菌体也将相应的一段DNA遗留在宿主的染色体组上），通过衣壳的“误包”，就形成了一种特殊的噬菌体缺陷噬菌体。它们没有将宿主溶源化的能力，而是使宿主成为一个局限转导子，对噬菌体没有免疫性。,
