1、第七章 微生物的遗传变异与育种,第一节 遗传变异的物质基础第二节 基因突变和诱变育种第三节 基因重组和杂交育种第四节 基因工程第五节 菌种的衰退、复壮与保藏,理想的工业发酵菌种应符合以下要求：,遗传性状稳定；生长速度快，不易被噬菌体等异种微生物污染；目标产物的产量尽可能接近理论转化率；目标产物最好能分泌到细胞外，以降低产物抑制并利于分离；尽可能减少产物类似物的产量，以提高目标产物的产量并利于分离；培养基成分简单、来源广、价格低廉；对温度、pH、离子强度、剪切力等环境因素不敏感；对溶氧的要求低，便于培养及降低能耗。,微生物的独特生物学特性：,（1）个体的体制极其简单；（2）营养体一般都是单倍体；
2、（3）易于在成分简单的组合培养基上大量生长繁殖；（4）繁殖速度快；（5）易于积累不同的中间代谢产物或终产物；（6）菌落形态特征的可见性和多样性；（7）环境条件对微生物群体中各个个体作用的直接性和均一性；（8）易于形成营养缺陷型；（9）各种微生物一般都有相应的病毒；（10）存在多种处于进化过程中的原始有性生殖方式；,遗传与变异的概念,遗传和变异是生物体的最本质的属性之一。遗传(heredity)：亲代生物的性状在子代得到表现；亲代生物传递给子代一套实现与其相同形状的遗传信息。遗传型（genotype）：又称基因型，指某一生物个体所含有的全部基因的总和；-是一种内在可能性或潜力。 遗传型 + 环境
3、条件 表型表型（phenotype）：指生物体所具有的一切外表特征和内在特性的总和;-是一种现实存在，是具一定遗传型的生物在一定条件下所表现出的具体性状。,变异(variation) : 生物体在外因或内因的作用下，遗传物质的结构或数量发生改变。变异的特点：a.在群体中以极低的几率出现，（10-610-10）；b.形态变化的幅度大； c. 变化后形成的新性状是稳定的，可遗传的。饰变（modification）：指不涉及遗传物质结构改变而只发生在转录、转译水平上的表型变化。特点是：a.几乎整个群体中的每一个个体都发生同样的变化；b.性状变化的幅度小；c.因遗传物质不变，故饰变是不遗传的。引起饰变
4、的因素消失后，表型即可恢复。,第一节 遗传变异的物质基础,种质连续理论：18831889年间Weissmann提出。认为遗传物质是一种具有特定分子结构的化合物。基因学说：1933年摩尔根发现了染色体，提出了基因学说，使得遗传物质基础的范围缩小到染色体上。但认为染色体是由核酸和蛋白质两种长链高分子组成。20多种氨基酸经过不同排列组合，能演变出无数种蛋白质，而核酸的组成仅由4种不同的核苷酸组成，它们通过排列核组合只能产生较少种类的核酸，因此当时认为决定生物遗传型的染色体和基因，其活性成分是蛋白质。DNA是遗传变异的物质基础的证明：1944年以后，先后利用微生物为实验对象进行的三个著名实验的论证（肺
5、炎球菌的转化试验、噬菌体感染试验、病毒的拆开与重建试验），才使人们普遍接受核酸才是真正的遗传物质。,Griffith进行了以下几组实验：（1）动物实验对小鼠注射活R菌或死S菌 小鼠存活对小鼠注射活S菌小鼠死亡对小鼠注射活R菌和热死S菌 小鼠死亡 抽取心血 分离 活的SIII菌,一、证明核酸是遗传物质基础的三个经典实验,（一）经典转化实验（transformation ）:1928年， F.Griffith，研究对象：Streptococcus pneumoniae（肺炎双球菌）S型菌株：有荚膜，菌落表面光滑，有致病性R型菌株：无荚膜，菌落表面粗糙，无致病性,Griffith转化试验示意,混合培
6、养,RII型活菌,SIII型活菌,SIII型热死菌,RII型活菌,SIII型活菌,健康,健康,健康,健康,健康,健康,健康,病死,病死,病死,（2）细菌培养实验,（3）S型菌的无细胞抽提液试验,以上实验说明：加热杀死的S型细菌细胞内可能存在一种转化物质，它能通过某种方式进入R型细胞并使R型细胞获得稳定的遗传性状，转变为S型细胞。,热死S菌不生长活 R 菌长出R菌热死S菌长出大量R菌和10-6S菌,活R菌+S菌无细胞抽提液长出大量R菌和少量S菌,+活R菌,平皿培养,加S菌DNA加S菌DNA及DNA酶以外的酶加S菌的DNA和DNA酶加S菌的RNA加S菌的蛋白质加S菌的荚膜多糖,活R菌,长出S菌,只
7、有R菌,1944年O.T.Avery等从热死S型中提纯了可能作为转化因子的各种成分，并在离体条件下进行了转化试验：,只有S型细菌的DNA才能将R型转化为S型。且DNA纯度越高，转化效率也越高。说明S型菌株转移给R型菌株的，是遗传因子。,（二）噬菌体感染实验,A. D. Hershey和M. Chase， 1952年,（1）含32P-DNA的一组：放射性85%在沉淀中,上清液中含15%放射性,沉淀中含85%放射性,沉淀中含25%放射性,以32S标记蛋白质外壳做噬菌体感染实验,（2）含35S-蛋白质的一组：放射性75%在上清液中,上清液中含75%放射性,（三）植物病毒的重建实验,为了证明核酸是遗传
8、物质，H. Fraenkel-Conrat（1956）用含RNA的烟草花叶病毒（TMV）进行了著名的植物病毒重建实验。将TMV在一定浓度的苯酚溶液中振荡，就能将其蛋白质外壳与RNA核心相分离。分离后的RNA在没有蛋白质包裹的情况下，也能感染烟草并使其患典型症状，而且在病斑中还能分离出正常病毒粒子。,选用TMV和霍氏车前花叶病毒（HRV），分别拆分取得各自的RNA和蛋白质，将两种RNA分别与对方的蛋白质外壳重建形成两种杂合病毒：,（1）RNA（TMV） 蛋白质（HRV）（2）RNA（HRV） 蛋白质（TMV） 用两种杂合病毒感染寄主：（1）表现TMV的典型症状并分离到正常TMV粒子（2）表现HR
9、V的典型症状并分离到正常HRV粒子。 上述结果说明，在RNA病毒中，遗传的物质基础也是核酸。,（一）核酸存在的七个水平及质粒细胞水平：存在于细胞核或核质体，单核或多核细胞核水平: 原与真核生物的细胞核结构不同，核外DNA染色体水平: 倍性(真核)和染色体数核酸水平：在原核中同染色体水平、存在部分二倍体 DNA或RNA，复合或裸露，双链或单链基因水平：具自主复制能力的遗传功能单位，长度与信息量，转录翻译密码子水平：信息单位,起始和终止,核苷酸水平：突变或交换单位，四种碱基,二、遗传物质在细胞内的存在部位和方式,基因：能够表达和产生基因产物（蛋白质或RNA）的DNA序列。,原核生物基因系统： 启动
10、子（基因） 操纵子操纵子（基因）基因调控系统 结构基因 调节基因,细胞水平：大部分或全部DNA都集中于细胞核或核质体中，不同种类微生物或同种不同细胞中细胞核的数目不同染色体水平：真核微生物的每个细胞核内含有一定数量的染色体；而原核微生物中一个核质体就是一个裸露的、光学显微镜下不能看到的环状染色体。,一些真核生物和原核生物基因组的比较,生 物 单倍体的 分子量 核苷酸 已知 染色体数 约数（Da） 对数 基因数 人 32 35 1012 57 109 4000 黑腹果蝇 4 7.9 1010 8.0 107 50006000粗糙脉孢菌7 2.8 1010 4.5 107 500 大肠杆菌1 2.
11、5 109 3.8 106 1027 噬菌体T41 1.1 108 2.0 105 135 噬菌体1 3.2 107 4.8 104 35噬菌体MS21 1.1 106 3.5 103 3,遗传密码：指DNA链上各个核苷酸的特定排列顺序,密码子（coden）：由3个核苷酸顺序决定，负载遗传信息的基本单位不对称转录：只有DNA双链的一股才作为有意义链被转录，这种现象又称不对称转录。起始密码子：AUG，甲硫氨酸或甲酰甲硫氨酸终止密码子：UAA、UGA、UAG,核外DNA的种类,核外染色体,真核生物的“质粒”原核生物的质粒,线粒体细胞质基因叶绿体（质体）中心体动 体共生生物：卡巴颗粒酵母菌的2m质粒
12、,F因子R因子Col质粒Ti质粒巨大质粒降解性质粒,质粒：细菌染色体外的遗传物质，由共价闭合环状双链DNA分子组成，能独立于细胞核进行自主复制。大小：分子量约为100 106 D，携带1100个基因, 一个菌细胞可有一至数个质粒。,质粒的特点：可自我复制，稳定遗传。对生存不是必要的。复制与染色体分开，但同步进行。不同质粒携带不同遗传信息。无质粒细菌可通过接合、转化、转导等方式获得，不能自发产生。例：细菌抗药性因子、大肠杆菌的F因子。质粒应用:基因工程，体外重组.,三、原核生物的质粒,性质：独立于染色体之外独立存在（游离态），也可以通过交换掺入染色体上，以附加体（episome）的形式存在；根据
13、质粒复制的控制形式分为严紧型和松弛型两种，严紧型质粒的复制受细胞核控制，与染色体DNA复制相伴随,一般一个寄主细胞内只有少数几个（15）个拷贝；松弛型质粒的复制不受细胞核控制，在染色体DNA复制停止的情况下仍可以进行复制，在细胞内的数量可以达到10200个或更多。可通过转化、转导或接合作用由一个细菌细胞转移到另一个菌细胞中，使两个细胞都成为带有质粒的细胞；质粒转移时，它可以单独转移，也可以携带着染色体（片段）一起进行转移，所以它可成为基因工程的载体。对于细菌的生存并不是必要的功能多样化,三、原核生物的质粒,功能：可通过细胞间接合传递基因，其本身带有一些基因，如产生毒素、抗药性、固氮、产生酶类、
14、降解功能等。重组：在质粒之间、质粒与染色体之间均可发生。存在范围：很多细菌如E.coli、根癌土壤杆菌等制备：包括增殖、裂解细胞、分离质粒与染色体和蛋白质等成分、去除RNA和蛋白质等步骤。鉴定：电镜观察、电泳、密度梯度离心、限制性酶切图谱等方法,三、原核生物的质粒,2.质粒在基因工程中的应用,质粒在基因工程操作中的优点 ：1.体积小，便于DNA的分离和操作；2.呈环状，在化学分离过程中能保持稳定性；3.有不受核基因组控制的独立复制起始点；4.拷贝数多，使外源DNA可快速扩增；5.存在抗药性基因等选择性标记，便于含质粒克隆的检出和选择。,E.Coli 的PBR322质粒的具体优点：,1.体积小，
15、仅4361bp；2.在宿主E.coli中稳定地维持高拷贝数（2030个/细胞）；3.氯霉素抑制宿主蛋白质合成，则每个细胞可扩增到含10003000个质粒；4.分离极其容易；5.可插入较多的外源DNA（不超过10bp）；6.结构完全清楚，各种核酸内切酶可酶解的位点可任意选用；7.有两个选择性抗药标记（氨苄青霉素和四环素）；8.可方便地通过转化作用导入宿主细胞。,E.Coli 的PBR322质粒,质粒的种类：,几种代表性质粒：,1. F因子（fertility factor）：又称致育因子或性因子，是E.coli等细菌决定性别并有转移能力的质粒，62106Da，94.5kb，相当于核染色体DNA2
16、%的环状双链DNA，足以编码94个中等大小多肽，其中1/3基因（tra区）与接合作用有关。存在于肠细菌属、假单胞菌属、嗜血杆菌、奈瑟氏球菌、链球菌等细菌中，决定性别。,最初发现于痢疾志贺氏菌（Shigella dysenteriae），后来发现还存在于Salmonella、Vibrio、Bacillus、Pseudomonas和Staphylococcus中。 R因子由相连的两个DNA片段组成，即抗性转移因子（resistence transfor factor， RTF ）和抗性决定R因子（r-determinant），RTF为分子量约11106Da，控制质粒copy数及复制，抗性决定质粒大
17、小不固定，从几百万到100106Da以上。其上带有其它抗生素的抗性基因。 R-因子在细胞内的copy数可从12个到几十个，分为严紧型和松弛型两种，经氯霉素处理后，松弛型质粒可达20003000个/细胞。,2. R因子（resistence factor）,RTF（含转移和复制基因）,+,IS,R质粒,r决定因子 （含抗药性基因）,产大肠杆菌素因子大肠杆菌素是由E.coli的某些菌株所分泌的细菌素，能通过抑制复制、转录、转译或能量代谢等而专一地杀死其它肠道细菌。其分子量约41048104Da。大肠杆菌素都是由Col因子编码的。Col因子可分为两类，分别以ColE1和ColIb为代表。ColE1分
18、子量约为5106Da，无接合作用； ColE1研究得很多，并被广泛地用于重组DNA 的研究和用于体外复制系统上。ColIb分子量约为80106Da，它与F因子相似，具有通过接合作用的功能，属于严紧型控制。凡带Col因子的菌株，由于质粒本身编码一种免疫蛋白，从而对大肠杆菌素有免疫作用，不受其伤害。,3. Col因子（colicinogenic factor）,即诱癌质粒。 存在于根癌土壤杆菌（Agrobacterium tumefaciens）中,可引起许多双子叶植物的根癌。 当细菌侵入植物细胞中后，在其细胞中溶解，把细菌的DNA释放到植物细胞中。这时，含有复制基因的Ti质粒的小片段与植物细胞中
19、的核染色体发生整合，破坏控制细胞分裂的激素调节系统，从而使它转变成癌细胞。 Ti质粒长200kb，是一个大型质粒。当前，Ti质粒已成为植物遗传工程研究中的重要载体。一些具有重要性状的外源基因可借DNA重组技术设法插入到Ti质粒中，并进一步使之整合到植物染色体上，以改变该植物的遗传性，达到培育植物优良品种的目的。,5. Ti质粒（tumor inducing plasmid）,4.Ri质粒,与Ti质粒相似，存在于发根土壤杆菌或发根农杆菌，其侵染双子叶植物时，可诱发大量称为毛状根的不定根。其中Ri质粒中的一段T-DNA整合到宿主根部细胞核基因组中，使之发生转化，并在宿主细胞内稳定遗传。,是近年来在
20、Rhizobium（根瘤菌属）中发现的一种质粒，分子量为200300106Da，比一般质粒大几十倍到几百倍，故称巨大质粒，其上有一系列固氮基因。,6. 巨大质粒（mega质粒）,只在假单胞菌属中发现。它们的降解性质粒可编码能降解复杂物质的酶，从而能利用一般细菌所难以分解的物质做碳源。这些质粒以其所分解的底物命名，例如有分解CAM（樟脑）质粒，XYL（二甲苯）质粒，SAL（水杨酸）质粒，MDL（扁桃酸）质粒，NAP（奈）质粒和TOL（甲苯）质粒等。,7.降解性质粒,第二节 基因突变和诱变育种,一、基因突变突变（ mutation ）：指细胞内遗传物质的分子结构或数量突然发生的可遗传的变化。 染色
21、体畸变细胞学上可以看到染色体的变化突变 基因突变细胞学上看不到遗传物质的变化突变体（mutant）：发生了突变的微生物细胞或菌株野生型（wild type）：从自然界分离到的任何微生物在其发生突变前的原始菌株,依表型的改变分为：1.营养缺陷型因突变而丧失产生某种生物合成酶的能力，并因而成为必须在培养基中添加某种物质才能生长的突变类型。2.抗性突变型因突变而产生了对某种化学药物或致死物理因子的抗性3.条件致死突变型突变后在某种条件下可正常生长繁殖，而在另一条件下却无法生长繁殖的突变型4.形态突变型由突变引起的个体或菌落形态的变异，一般属非选择性突变。5.抗原突变型因突变而引起的抗原结构发生改变。6.产量突变型通过基因突变而产生的代谢产物产量上明显有别于原始菌株的突变株。7.发酵突变型丧失产生某种生物合成酶能力的突变型。,（一）基因突变的类型,
