1、分子标记及其在植物遗传育种中的应用,遗传标记 （genetic marker）具有多型性 易于鉴别 与目标基因紧密连锁,性状标记色泽， 形态细胞学标记倒位，易位，G/N/C带生化标记同功酶分子标记RFLP、RAPD、SSR、AFLP、SNP ,基础- 基因表达 结果 表现型,DNA碱基 序列变异,形态标记,遗传学上稳定、可见的外部特征 -遗传与环境、结构基因与调控基因综合作用的结果。 如穗形、芒长、穗长、粒色、穗形、矮秆、卷叶等。 特点：直观简单 从基因型到表现型存在基因表达、调控、个体发育等环节，表型差异有时难以反映基因型差异。,细胞学标记,染色体数目变异及结构变异，表现在染色体核型（数目、
2、大小、随体、着丝点位置等）和带型（C带、N带、G带等）。 随着分带、细胞原位杂交等研究技术的发展，可在染色体水平揭示更多遗传变异。 特点：直观、快速而经济，但变异十分有限，当染色体数目形态相似时难以分辨。,生化标记贮藏蛋白和同工酶,贮藏蛋白 同工酶 特点：经济、方便、成本较低 结构基因表达产物，对非结构基因无能为力；所检测位点只是基因组一部分；数量有限，有时受发育时期和环境影响。,分子标记,本质是以核苷酸序列作为标记，一般特点： （1）不受季节、环境、基因表达与否的限制； （2）多态性高，存在着丰富的等位变异； （3）数量丰富，多态性遍及整个基因组； （4）表现为“中性”，不影响目标性状的表达
3、，与不良性状无必然的连锁； （5）许多分子标记表现共显性，能鉴别纯合杂合基因型，提供完整的信息。,分子标记的分类（Staub等1996）,植物遗传研究中常用的分子标记,RFLP Restriction Fragment Length Polymorphism RAPDRandom Amplified Polymorphic DNAs (DAF, AP-PCR) SSR Simple Sequence Repeat AFLP Amplified Fragment Length Polymorphism,RFLP,原理： DNA 限制性内切酶酶切电泳 转移到硝酸纤维素滤膜 同位素或非放射标记（如地
4、高辛等）的探针杂交 胶片放射自显影，显示酶切片段大小,酶切：3-5ug DNA，以10U内切酶酶切5小时 电泳：0.6-0.8%琼脂糖胶70V电泳16小时 染色：EtBr染色20分钟 变性：0.25M HCl 20分钟，抽真空，水冼 印迹：加入0.4N NaOH，进行Southern 印迹 冲洗：以2SSC 冼胶，风干,酶切电泳印迹,杂交洗脱,预杂交：将杂交膜放人预杂交液（水、5 HSB、Denhardt）中， 封好后置65温箱中振荡56小时。 杂交：预杂交液中加入标记好的marker和探针，放入杂交膜浸匀。封好杂交盒后，置65温箱中振荡过夜。 洗脱：将膜转入洗脱盒，加入洗脱液65 振荡洗脱两
5、次（15min/次），吸干包好。,放射自显影,将洗脱好的杂交膜置于增感屏上, 于暗室中将 X-光片放于杂交膜上， 再放上另一张增感屏，装人暗袋，并用夹板夹好。置-70超低温冰箱中曝光10天左右。 使用磷屏仪，操作更方便。,RFLP探针,来源：cDNA探针与基因组DNA（gDNA）探针 cDNA探针:保守性较强，探针检测的多态性频率较低。 gDNA探针:检测的多态性频率较高，但不同种属特异性较强。 玉米RFLP探针：http:/www.maizegdb.org/probes. Html,探针标记随机引物法,25 ng变性DNA 5ul 寡聚核苷酸 2ul BSA 3ul -32PdCTP 2ul
6、 Klenow酶 加水至50ul，37温箱中标记2小时,RFLP标记特点,共显性，可以区别纯合和杂合基因型 稳定、重复性强 某些植物中开发探针已遍及整个基因组 缺点：DNA需要量较大，技术复杂；用于做图较费时，难以分析大量样品；在基因组较大、严格自花授粉作物上多态性很低，使遗传图饱和度低。,RAPD,原理： 用一个随机引物（8-10bp）、碱基随机排列的寡核苷酸序列，非定点地扩增基因组DNA，然后电泳分开扩增片段。,Polymerase Chain Reaction-PCR,3,5,TCATGA,CGAGCG,DNA is doubled with each cycle,RAPD的操作,PCR
7、反应：DNA（20ng/l） 1lPrimer 15ng10Buffer 2.0lMg2+（25mM） 1.2lTaq酶（5U/l） 0.15ldNTP（25mM） 0.2l加水至20l，再加入石腊油，进行PCR扩增,Step1 95 2分钟 Step2 95 15秒 Step3 36 30秒 Step4 72 45秒 Step5 GOTO Step2 46循环 Step6 72 5分钟,PCR扩增：,主要特点,无需杂交，设计引物也无须知道序列信息； DNA需要量少，引物便宜，成本较低； 技术简便，操作方便、快速，不涉及分子杂交和放射性自显影等技术。 不同物种间引物通用； 缺点：大多显性遗传，
8、不能鉴别杂合和纯合子；实验重复性较差，结果可靠性较低。,DAF (DNA amplification fingerprinting)：,与RAPD不同的是: 引物浓度更高，引物长度更短（一般58个碱基），且往往用聚丙烯酰胺凝胶电泳，通常会产生非常复杂的带型，谱带信息比RAPDs大得多。（Caetano-Anolles等，1990）,AP-PCR(arbitrarily primed polymerase chain reaction),引物较长（1050bp）； 引物浓度较高； 引物长度不定，并且常常来自为其它目的而设计的引物（如M13通用测序引物）。,ISSR,共同优点：在不需要知道所扩增D
9、NA序列情况下，产生DNA片段的指纹；需DNA量少，产生多态性丰富。缺点：对反应条件非常敏感，重复性差。,SCARs （Sequenced Characterized Amplified Regions）,为提高RAPD标记稳定性，把目标RAPD片段克隆测序，根据片段两末端的序列设计特定引物（通常24个碱基），再进行PCR扩增，可把相应的单一位点鉴定出来。 具有更高的可重复性 共显性,微卫星标记(SSR),真核生物基因组普遍存在，呈随机分布,大约每隔10-50kb就存在一个SSR. 哺乳动物中约为植物的5-6倍;植物中平均23.3kb有一个SSR;双子叶植物SSR数量大于单子叶植物,核DNA
10、SSR数量多于细胞质DNA; 根据核心序列碱基数的不同,可分为单碱基、2碱基、3碱基、4碱基等多种重复型。,不同物种其重复序列及重复单位频率不同。 通过对54个植物种核DNA和28个植物种细胞器DNA SSR(1-4bp)的搜索,发现： (AT)最丰富,然后依次是: (A)n、(T)n、(AG)n、(CT)n、(AAT)n、(ATT)n、(AAC)n、(GTT)n、(AGC)n、(GCT)n、(AAG)n、(CTT) n、(AATT)n、(TTAA)n、(AAAT)n、(ATTT)n及(AC)n、(GT)n。 同一类内碱基种类不同的SSR,丰度差别很大。,SSR的分布特点,SSR的功能,长期以
11、来一直认为SSR是转录哑区，没有明确的生理功能。但随着研究深入，证明并非如此。SSR的主要功能: 编码氨基酸； 染色体末端的SSR，有保护DNA完整性、避免降解、融合及丢失的功能； 提高或降低临近基因转录速率； 基因重组的热点，是基因变异的来源； 部分SSR可产生转录启动复合物或活化染色体,两端序列多是保守的单拷贝序列，可以根据两端序列设计一对特异引物，通过PCR将其间微卫星序列扩增出来，利用电泳技术获得长度多态性。 不同材料重复次数的不同，导致了SSR长度的高度变异性。,SSR分析,SSR分子标记的创制,基因组文库的构建 探针制备-预杂交-带有SSR克隆的选择 测序 引物设计 检测其它方法:
12、 EST-SSR、相关种间SSR. .,Cross-species SSR,Taxonomic Transferability PolymorphismDivergence % (N) % (N)Same subgenus 89.8 (521) 78.3 (299) Same genus 76.4 (1800) 86.0 (773) Same alliance 45.4 (403) 50.4 (141) Same family 35.2 (1683) 58.4 (363),SSR的操作,PCR反应： DNA（20ng/l） 4l Primer（1mM） 0.25l 10Buffer 2.0l
13、Mg2+（25mM） 1.2l Taq酶（5U/l） 0.1l dNTP（25mM） 0.2l 加水至20l,混合后，进行PCR扩增：Step1 95 2分钟 Step2 95 30秒 Step3 56 30秒 Step4 72 60秒 Step5 GOTO Step2 31循环 注：SSR引物退火温度在52-65 不等。,SSR的特点：,两侧顺序保守，在同种间多相同； 数量丰富，在整个基因组均匀随机分布； 实验重复性好，结果可靠； 多数SSR增减重复序列频率高，在品种间具广泛位点变异； 共显性标记，可鉴别杂合子和纯合子； 仅需微量组织，适合PCR分析半自动化,相对的物种专一性； 由于开发时需
14、针对每个座位的微卫星序列，发现其两端的单拷贝序列设计引物，需建立基因文库、克隆识别与筛选、测序等过程，开发困难，费用较高，耗时长； 实际分析时一般每次只分析单个位点； 不同引物退火温度不同，需要探索。,不足：,SSR的检测,琼脂糖凝胶检测（同前） 聚丙烯酰胺凝胶检测 一般采用银染、荧光检测。,银染检测程序,脱色：加1升10%HAC液，脱色20分钟 冲洗：用重蒸水冲洗胶板2次，每次5分钟 染色：加染色液(1%AgNO3，0.075%甲醛)30分钟 冲洗：用重蒸水冲洗胶板不超过5秒钟； 显影：预冷显影液（30g/LNaCO3，0.075%甲醛，0.4mg/mlNa2SO3），轻摇到带纹出现； 定影
15、：在固定/停止液并轻摇3-5分钟； 冲洗：用重蒸水冲洗2次，每次2分钟； 干胶：室温下自然干燥过夜。,AFLP（Amplified Fragment Length Polymorphism),原理：基于RFLP技术和PCR技术的结合,DNAMseI -MseI MseI -EcoRI EcoRI -EcoRIMseI -MseI片段环化，不利小片段扩增； EcoRI -EcoRI 引物的退火温度高； MseI -EcoRI 片段优先扩增,酶切连接,接头序列,Mse 接头、Pst 分别为： Mse： 5-GACGATGAGTCCTGAG-3 3-TACTCAGGACTCAT-5 Pst： 5-C
16、TCGTAGACTGCGTACC-33-CTGACGCATGGTTAA-5 EcoR：5-CTCGTAGACTGCGTACC-33-CTGACGCATGGTTAA-5,M00:5-GATGAGTCCTGAGTAA-3； P00:5- GACTGCGTACCAATTC-3; E00:5-GACTGCGTACCAATTC-3;MseI-primers +3: 5-GATGAGTCCTGAGTAANNN-3 EcoRI-primers +3: 5-GACTGCGTACCAATTCNNN-3 PstI-primers +3: 5-GACTGCGTACATCGAGNNN-3,AFLP技术的特点,（1）由
17、于内切酶及选择性碱基组合数和种类很多，产生标记数无限，可覆盖整个基因组。 （2）多态性远远超过其它分子标记，一般可检测到50-100个AFLP扩增产物，能够在遗传关系十分相近的材料产生多态性，被认为是指纹图谱技术中多态性最丰富的一项技术。 （3）AFLP分析由于扩增片段较短（30-700bp)，分辨率高。,（4）AFLP分析用样量少（0.05-0.5 g DNA），而且对模板浓度的变化不敏感。 （5）由于特定引物扩增，退火温度高，因而假阳性低，可靠性高。 （6）引物在不同物种间是通用的，可用于没有任何分子生物学研究基础的物种。 （7）银染技术具有快速、方便的特点，在1-2天内可以得到指纹。,A
18、FLP操作具体包括三个步骤： 1. 酶切-连接； 2. PCR扩增，使目的序列扩增到0.51g； 3. 电泳分离（利用聚丙烯酰胺凝胶）。 对于基因组较大的物种，需要进行两步扩增预扩增和选择性扩增。,AFLP操作步骤：,模板DNA的酶切与连接,DNA（200ng/l） 2.5l Mse 3单位 Pst 3单位 Mse 接头（50 pmol/l） 1.0l Pst 接头（5 pmol/l） 1.0l 10NEB Buffer 2.5l 100BSA 0.25l ATP（10mM） 2.0l T4-连接酶（3U/l） 0.4l 加水至25l，37酶切-连接4-6小时，或过夜。,AFLP实验程序,DN
19、A片段的预扩增,取2.0l完成的样品，加入18l如下混合液：Mse 引物（M00，50ng/l）0.6lPst 引物（P00，50ng/l） 0.6l10PCR Buffer 2.0lMg2+（25mM） 1.2lTaq酶（5U/l） 0.1ldNTP（25mM） 0.16l 加ddH2O至20l,混合后，在如下PCR条件下扩增：Step1 95 2分钟Step2 95 30秒Step3 56 30秒Step4 72 60秒Step5 GOTO Step2 31 cyclesStep6 72 5分钟,AFLP的选择性扩增,取4l稀释预扩增液，加入16l如下反应液： Pst引物（50ng/l）
20、0.8l Mse引物（50ng/l） 0.8l 10PCR Buffer 2.0l Mg2+（30mM） 1.1l dNTP（25mM） 0.18l Taq酶（5U/l） 0.12l ddH2O 11.0l,混合后按如下PCR程序扩增：Step1 95 2分钟Step2 95 30秒Step3 65 30秒（-0.7/cycle）Step4 72 60秒Step5 GOTO Step2 12循环Step6 95 30秒Step7 56 30秒Step8 72 60秒Step9 GOTO Step6 30 cyclesStep10 72 5分钟,AFLP的检测,银染 荧光 同位素检测,注意事项：
21、,1AFLP酶切反应对模板DNA质量要求较高，要求260/280 在1.8左右，且不能有降解。 2AFLP反应对模板DNA浓度不是很敏感，在50pg-50ng时，均可以观察到多态性带，但为了实验的准确性，DNA浓度不能太低。 3酶切-连接反应可以分开作，也可以合在一起作，但合在一起更方便些。,4AFLP反应对PCR要求较高，要首先摸索优化Mg2+、dNTP条件，达到最佳扩增。 5EcoR受甲基化胞嘧啶的影响较小，而Pst对富含的甲基化胞嘧啶十分敏感，因而Pst-Mse检测的多为表达区域，而EcoR-Mse检测位点聚集在甲基化较高的重复序列区域。,6引物中用作选择性核苷酸的和含量对扩增出的产物数
22、目有影响。一般而言，和含量越高，扩增出的产物数目越少。 7 同位素、荧光标记分辨率较高，但价格昂贵，操作不方便；银染方法方便快捷，掌握好各个环节，同样可以达到很好的效果。,为什么用双酶解?,适合PCR扩增效率与变性胶的分辨率 减少PCR扩增的片段,从而减少使用选择性碱基的数目 使标记单链成为可能 增加PCR扩增的灵活性 增加使用引物的灵活性,为什么要预扩增?,减少选择性碱基的错配 减轻背景 提供足量模板DNA 降低模板浓度的影响,目的： 分子标记辅助选择 (MAS) 筛选BAC文库，进行图位克隆（map-based gene cloning）,AFLP SCAR,遗传相似系数 Gower (1
23、985):,遗传距离的计算：,Rogers（1972）,Rogers-W（Rogers distance as modified by Wright （1978）,两个 随机群体 j 、k间的遗传距离（Nei 1972）:,Xij 为X群体第i个位点第j个等位基因频率 Yij为Y群体第i个位点第j个位点基因频率,在种质资源研究中，大多数采用罗杰斯距离（RD）和改良的罗杰斯距离（MRD）（Rogers，1972；Goodman & Stuber，1983）。 根据遗传特性确定的罗杰斯距离在相关种质的亲缘关系分析中非常有用；而改良的罗杰斯距离还适用于杂种优势研究。,聚类分析,聚类指标：遗传相似系数
24、遗传距离 聚类方法：SAHN （Sequential Agglomerative Hierarchical and Nested）clustering常用UPGMA 分析软件：NTSYS-pc2.02（Rholf，1998）,QTL分析,单标记作图法； 区间作图法； Mapmaker/QTL http:/www-genome.wi.mit.edu/genome_software 复合区间作图法；Cartographer、QTLmapper http:/statgen.ncsu.edu/qtlcart/WQTLCart.htm http:/ Homozygote for the allele f
25、rom A parent B Homozygote for the allele from B parent H Heterozygote carrying both alelles A and B C Either BB or AB genotype D Either AA or AB genotype - Missing data for the individual at this locus,data type F2 intercross 20 5 1 *locus1 BBBHH-AAABBBHHH-AABA *locus2 AB-ABHABHAB-AB-ABHAH *locus3 A
26、BBAHHHBHABHABHBBHH- #Locus3 may be mis-scored in individual 12! *locus4 ABHHABAAAHAB-ABHABHH *locus5 ABHABHAA-ABHABHAHHHB *trait1 6.3 7.7 8.0 6.2 4.1 8.8 6.5 5.4 7.3 8.7 9.0 - 6.8 7.2 7.1 7.6 8.3 8.1 7.5 6.8,EST (Expressed Sequence Tags) SNP（single nucleotide polymophism） cSSR、cSNP DNA微阵列（Microarray
27、） 蛋白质组学 ,新型分子标记,EST 是长约150-400bp的基因表达序列片段，携带着完整基因的某些片段。 mRNA反转录成cDNA，克隆到质粒或噬菌体载体，构建cDNA文库，而后大规模随机挑选克隆，对5或3端进行一步法测序，获得对生长发育、遗传变异、衰老死亡等过程认识的技术。,EST (Expressed Sequence Tags),DNA Databanks,cDNA resources Genbank (NCBI), Nucleotide Sequence Database (EMBL), DDBJ , MGC, Genomic DNA resources HTG, dbGSS,
28、GOLD, ERGO, EST resources dbEST, UniGene, GIs, STACKS, DOTS, Others dbSTS, UniSTS, dbSNP, TransFac, ISIS, Repbase, . .,常用基因组网址：,拟南芥: The Arabidopsis Information Resource (TAIR) http:/www.arabidopsis.org/ 水稻：RiceGene http:/www.gramene.org/ 大豆：SoyBasehttp:/129.186.26.94/ 玉米：MaizeDB, MaizeGDB http:/www
29、.maizegdb.org/ 小麦：GrainGenehttp:/wheat.pw.usda.gov/ 棉花: CottonDBhttp:/algodon.tamu.edu/htdocs-cotton/cottondb.html 苜菽：Alfagenes http:/naaic.org/ 大麦：BarleyDB - http:/ 油菜：BrassicaDB Http:/ 高梁：SorghumDb http:/algodon.tamu.edu/sorghumdb.html,单核苷酸多态（SNP -single nucleotide polymophism）,SNP是由于单个核苷酸改变而导致的核酸
30、序列多态，即基因中的点突变。特点： 双等位基因 在基因组中的发生频率比较高 有些SNP位点还影响基因的功能 SNPs可大大丰富既有的连锁图 成熟自动化技术，有望分析成千上万的SNPs,cSSR、cSNP 从EST中开发SSR、SNP目前某些植物全序列的测定及EST数据库的开发，为SSR、SNP的开发开辟了新的途径。 优点： 表达序列，与特定功能有联系 多态性丰富，可大大丰富标记数目 开发简单、经济,利用DNA芯片技术，将大量探针固定于玻/硅片上，然后用荧光标记样品进行大量分子杂交，以比较不同组织或器官的基因表达水平，筛选突变基因，分析基因表达模式。 优点：密度高、制作方便，解决了传统核酸杂交技
31、术复杂、自动化程度低、检测目的分子数量少、低通量等不足,DNA微阵列（Microarray）,高通量提高信息量,平行化提高信息的可比性,微量化降低待检样品用量,自动化提高工作效率,低成本可迅速普及推广,生物芯片的特征与优点,蛋白质组学为基础的分子标记,蛋白质是基因表达的产物,是基因功能的执行体，决定了生物的生长、发育、繁殖等各种性状。 蛋白质组研究-了解生物体蛋白质表达的时空分布规律, 不同个体/组织间的表达差异 蛋白质分子标记-定位生物的表性变异(如抗病、抗逆等性状)和相关基因,The key technique involves in proteomics,1.Mass spectrome
32、try 2.Two-dimensional gel electrophoresis3.Yeast two-hybrid system,分子标记技术 在植物遗传研究中的应用,利用遗传图和遗传标记可用来加速植物育种进程。 经典遗传图谱：形态、生理和生化标记，数量极为有限，图谱分辨率大都很低，表现标记少，图距大，饱和度低。 分子标记技术的发展，使图谱上标记的密度越来越高。,植物基因组遗传作图,构建遗传图谱 （molecular marker linkage map）,以具有遗传多型性的分子标记为“路标” Polymorphic molecular marker as “route sign” 以减数
33、分裂中发生的遗传重组交换值为图距 Recombination frequency (%) in meiosis as “map distance (cM)” 绘制高密度的分子标记连锁图 Genetic linkage map with high density,QTL作图所需的数据,遗传标记数据,数量性状数据,分子标记连锁图谱的构建,定位群体亲本间多态性分子标记的筛选定位群体的组建定位群体分子标记分析分子标记连锁图谱的绘制,利用3个分离群体，一个人，三个月时间，能完成包括1032个AFLP标记的遗传连锁图谱（ Faye等1995） 。 AFLP不仅能缩小抗病基因与连锁标记之间的距离，而且在RF
34、LP遗传图上，可增加染色体末端标记和填充RFLP空隙，不干扰RFLP标记簇，从而大大增加了遗传图的饱和度。,在植物遗传多样性研究上的应用,对植物种质资源遗传多样性的全面了解，对于拓宽遗传基础的育种策略十分重要。 eg.贾继增等（1997）利用21条染色体上473个RFLP探针对小麦遗传多样性分析发现，小麦不同位点、不同染色体上的遗传多样性各不相同，普通小麦B基因组遗传多样性较高，其中尤以2B、6B、7B更高，而D组的遗传多样性最差。对在小麦育种中引进新的遗传变异具有一定的意义。,eg. 通过288个位点上对338个一粒小麦系群AFLP指纹分析，结合种系分析，发现来源于土耳其东南部Karacad
35、ag山脉的一个野生一粒小麦（T. boeoticum）群体与栽培一粒小麦（T. monococcum ）遗传上最为相近，从而推断该地区为现代栽培一粒小麦的发源地（ Heun等1998） 。,植物起源、分类和进化研究,品种的DNA指纹图谱,定义：能够鉴定作物品种之间差异的电泳图谱。特点：高度的个体特异性、环境的稳定性及丰富的多态性。 用途：鉴定品种真实性和纯度，用于新品种登记和品种知识产权保护等。其中AFLP被推荐为指纹图谱绘制的最佳方法之一。 eg. Law等（1998）利用6个AFLP引物组合产生90多条多态性条带，建立了英国1934-1994广泛种植的55份小麦的指纹图谱。,基因定位 质量
36、性状的基因定位,近等基因系（Near Isogenic Lines, NILs）NILs几乎仅在目标性状上存有差异，一般凡是能在近等基因系间揭示多态性的分子标记，就极可能位于目标基因的两翼附近。 利用NILs方法已定位了许多质量性状基因，eg.番茄抗病毒基因Tm-2a，番茄抗细菌病毒基因及水稻半矮杆基因Sdy等。,原理：将分离群体(F2、BC、DH）中的个体依据目标性状(如抗病、感病)分成两组，在每一组中将若干个体DNA等量混合，形成两个DNA混合池(如抗病池和感病池)。由于分组时仅对目标性状进行选择，因此两个池之间理论上就应主要在目标基因区段存有差异，也称近等基因池法。 优点：克服了许多作物
37、没有或难以创造相应NILs的限制(Michelmore等1991)。 定位基因：莴苣抗霜霉病基因、水稻抗瘿蠓基因水稻抗稻瘟病基因、水稻耐黄丛卷叶病毒病基因等,分离群体分组分析法(Bulked Segregation Analysis),产量、品质、熟期等大多数重要农艺性状，均表现数量性状的遗传特点，受许多数量基因座位（Quantitative Trait Loci, QTLs）和环境因子的共同作用。 数量遗传学无法确定控制数量性状的QTLs数目，也无法确定单个QTL的遗传效应及染色体位置。 分子连锁图谱的发展，可以实现对单个QTL遗传效应的追踪，从而应用于分子标记辅助选择。目前已发展了QTLs
38、定位的多种方法。,数量性状基因的定位,基于图谱的基因克隆,谁最先了解基因的功能，谁就拥有了该基因的知识产权，也就获得了更多的利润。 克隆基因途径正向遗传学和反向遗传学。 前者以欲克隆基因的功能为基础，通过鉴定其产物或某种表型的突变进行； 后者则着眼于基因本身，通过其特定的序列或其在基因组中的特定位置进行。,图位克隆,条件： (1)目标基因附近紧密连锁的DNA标记； (2)知道这些标记与目的基因的位置 一旦建立与目的基因紧密连锁的分子标记图，就可以找到染色体步行的起始点，从而进行定位克隆。,比较基因组研究,利用相同的DNA分子标记（主要是cDNA标记和基因克隆）在相关物种之间进行遗传或物理作图，
39、比较这些标记在不同物种基因组中的分布特点，揭示染色体或染色体片段上的基因及其排列顺序的相同或相似性，并由此对相关物种的基因组结构和起源进化进行分析。,新发现：不同物种之间在标记探针的同源性、拷贝数及连锁顺序上都具有很大程度的保守性。eg 番茄、马铃薯和辣椒（Tanksley等1988；1992）； 水稻、小麦和玉米（Ahn等，1993；1994）； 小麦、大麦和黑麦（Devos等，1993）； 高粱和玉米（Pereira等，1994）； 以及大麦和水稻（Maroof等，1996） ,比较基因组学研究表明，不同物种之间在标记探针的同源性，拷贝数及连锁顺序上都具有很大程度的保守性。 启示：模式植物
40、上遗传作图成果可推而广之。可借助比较基因组共享分子标记，使建立高密度遗传连锁图可资利用的标记显著增加，从而大大提高了获取离目标基因很近分子标记的的可能性。,应用比较基因组学进行基因的克隆,绿色革命Rht1、Rht2基因的克隆拟南芥GAI 水稻EST筛选小麦BAC文库Rht1、Rht2,Blast,探针标记,深远意义比较基因组研究已使得传统的植物遗传学突破了物种的框架限定，发展成了新的系统遗传学。随着最近一些生物的基因组全序列的获得，比较基因组研究也随之步入了一个新的时代。,研究基因表达与调控,传统方法是利用cDNA文库筛选和Northern杂交。 AFLP研究基因表达是非常有效的方法，可同时比
41、较植物发育的不同时期以及分离某些重要基因（cDNA-AFLP）。,利用cDNA-AFLP的方法，阐明了马铃薯块茎在不同发育阶段基因表达的情况，并克隆了2个与块茎脂肪氧合酶高度同源的cDNA片段（Bachem等1996） 。,在植物育种上的应用,在杂交育种中，单单根据育种材料的表型特点选配亲本，往往会受到环境条件的干扰。 辅之以DNA分子标记的差异性分析，将使得亲本选配更为快速、准确，从而提高育种效率。,揭示育种材料之间的亲缘关系,杂种优势利用正成为许多作物提高产量和改善品质的重要途径。 对遗传差异与杂种优势关系的评价方法经历了从形态性状遗传距离，到生化标记遗传差异，亲缘系数，以及分子标记遗传差
42、异等各种尝试。,杂种优势预测及机理研究,DNA分子标记的应用，使得能够在整个基因组范围内对大量亲本材料间的遗传距离进行估测，并在此基础上有效地预测具有强优势的组合（Smith等，1992；Bernardo，1994）。 结果：既有相关性很高的报道，又有完全相反的结果。,张启发认为： 分子标记杂合度与杂种优势的相关性因遗传材料而异，在经过改良的优良种质中，两者之间高度相关，而在一些未经改良的优良种质中，相关程度很低。 提出了“上位性是杂种优势的主要遗传基础”的重要观点。,应用cDNAAFLP技术进行杂种优势机理的研究表明，强优势与弱优势组合间基因表达有明显差异，有增强型、减弱型和沉默型。 杂种优
43、势表现与单亲沉默、双单亲沉默有密切关系。,大量研究表明，虽然分子标记揭示的遗传距离与杂种优势的关系比较复杂，但亲本之间的遗传差异是产生的主要原因。 通过对与杂种优势相关QTLs效应的研究，可以加深对杂种优势机理的了解。,我国玉米种质基础,亚群 类群 标准测验种 四平头 Dom 黄早四 旅大红骨 丹340 BSSS A B73 PA 掖478 Lancaster B Mo17 PB 齐319,分子标记辅助选择 （MAS,marker assisted selection),分子标记辅助选择几乎不受环境条件的影响，还可以跟踪外源基因，克服回交的缺点，可大大提高选择的效率。 长期以来，选择都是基于植
44、株的表型性状进行的。植物的许多性状为数量性状，受许多微效基因的控制，且易受环境的影响。,快速有效地选择出带有目标基因的单株,表现在: 1.不受环境条件及生长发育阶段的影响，在苗期或低世代就可进行筛选; 2.利用共显性标记可直接对隐性目标基因进行选择，无需测交或自交检验; 3.如果目标性状不能在当代进行选择，采用MAS可直接在当代确定。,快速选出以轮回亲本为遗传背景的单株,在回交育种中不仅要考虑优良性状的导入，还必须考虑保持其整个基因组的遗传背景基本不变。 通过MAS技术，借助于饱和的分子标记连锁图，对各选择单株进行整个基因组的组成分析，进而可以选出带有多个目标性状而且遗传背景良好的理想个体。,
45、当回交转移性状由隐性基因控制时，需在选择前先自交一代使其纯合化；而且当选择的是如抗病这样的性状时，还要借助于繁琐的接种鉴定等。 贾继增等（2001）根据AFLP标记进行小麦白粉病抗性的回交选择，对小麦的外源染色质及基因可以进行准确的跟踪鉴定，从而加速种质创新的进程。,计算机模拟表明： 如果从每个回交世代含有目标基因的30个的单株中，通过MAS选出1株带有轮回亲本基因组比率最高的个体作为下一次回交的亲本，则完全恢复到轮回亲本基因组的基因型只需3代。在传统育种方法中，要达到99%轮回亲本比率则需6.5代（Tanksley等1998）。,有效选择目标基因附近发生重组的个体,回交育种中, 传统解决连锁
46、累赘方式是通过扩大选择群体或增加回交次数。但研究表明，即使回交20代，还能发现相当大与目标基因连锁的供体染色体片段。 Tanksley研究表明，用位于目标基因两侧1cM的两个分子标记进行辅助选择，通过两个世代就可获得含目标基因长度不大于2cM的个体，如果采用传统的育种方式则需要100代。,通过对Opaque-2基因中开发的SSR引物，以及与Opaque-2共分离的RFLP标记，我们正在进行QPM分子标记辅助育种。,基因聚合,将多个有利基因通过选育途径聚合到一个品种之中,这些基因可以控制相同的性状也可以控制不同的性状。 基因聚合突破了回交育种改良个别性状的局限,使品种在多个性状上同时得到改良。,
47、数量性状遗传改良,由于数量性状遗传的复杂性，存在以下问题: 1)QTL与环境之间的互作降低了对数量性状基因定位的准确性; 2)由于单个QTL呈微效作用,所以必须同时操作多个QTL才能使性状发生显著变化; 3)QTL之间存在互作关系,使得对QTL的效应估计发生偏差; 4)在对QTL进行转移时,如果没有转移互作QTL,则不会达到预期的结果。,Khan等（2000）以AFLP等分子标记辅助选择，将二粒小麦6BS的高谷蛋白QTL成功地转入普通小麦品种Glupro。 Stuber（1995）把产量有关的QTLs分别从Tx303和oh43转移到B73和Mo17两个玉米自交系中，由这两个改良的自交系组配杂交种，产量比对照杂交种增产15%以上。 Xiao等(1996)利用分子标记从普通野生稻中鉴别出2个增产的QTL,并转移到栽培稻中。 ,成功的报道,
