第七章微生物的遗传与变异.ppt

1、第七章 微生物的遗传与变异,微生物的遗传微生物的变异基因重组突变体的检测与筛选分子遗传学新技术在环境工程与环境保护中的应用,1.种瓜得瓜，种豆得豆； 2.龙生龙，凤生凤，老鼠儿子会打洞； 3.虎父无犬子； 4.一母生九子，母子十不同。,第七章 微生物的遗传与变异,第七章 微生物的遗传与变异,遗传（heredity）和变异（variation）是生物界最本质的属性之一。,在应用微生物加工制造和发酵生产各种食品及微生物污染治理过程中，要想有效地大幅度提高产品的产量、质量和处理效果，首先必须选育优良的生产菌种，才能达到目的。而优良菌种的选育是在微生物遗传变异的基础上进行的。遗传和变异是相互关联，同时

2、又相互矛盾对立的两个方面，在一定条件下，二者是相互转化的。认识和掌握微生物遗传变异的规律是搞好菌种选育的关键。,第七章 微生物的遗传与变异,遗传：微生物在繁殖延续后代的过程中，亲代与子代之间在形态、结构、生态、生理生化特性等方面具有一定的相似性，称为微生物的遗传。 遗传的保守性：相对稳定有利：选育出的优良菌种属性稳定地遗传。不利：环境条件改变，微生物会不适应外界环境条件。 保持物种延续。,第七章 微生物的遗传与变异,变异：在微生物繁殖过程中，在世代之间、同代个体之间存在差异的现象，称为变异。 变异的多样性个体形态的变化，菌落形态(光滑型粗糙型)的变异，营养要求的变异，对温度、pH要求的变异，毒

3、性的变异，抗毒能力的变异，生理生化特性的变异及代谢途径、产物的变异等。 两者的关系：遗传是相对的，变异是绝对的，遗传中有变异，变异中有遗传，遗传和变异的辨证关系使微生物不断进化。,第七章 微生物的遗传与变异,意义：遗传和变异是一切生物存在和进化的基本要素育种环境保护领域,第七章 微生物的遗传与变异,两组基本概念： 遗传型（genotype）又称基因型，指某一生物个体所含有的全部遗传因子即基因组所携带的遗传信息。 表型（phenotype）指某一生物体所具有的一切外表特征及内在特性的总和。,遗传型 （可能性）,表型 （现实性）,环境条件,代谢、发育,第七章 微生物的遗传与变异,两组基本概念： 变

4、异（variation）生物体在某种外因或内因的作用下引起的遗传物质结构或数量的改变，即遗传型的改变。特点：群体中几率低，性状变化幅度大，新性状稳定可遗传。 饰变（modification）修饰性改变，即不涉及遗传物质结构改变而只发生在转录、翻译水平上的表型变化。特点：群体中几乎每一个体都同样变化，性状变化幅度小，不遗传，引起饰变的因素消失后，表型即可恢复。,例如：粘质沙雷氏菌：在25下培养，产生深红色的灵杆菌素；在37下培养，不产生色素；如果重新将温度降到25，又恢复产色素的能力。,7.1 微生物的遗传,遗传变异的物质基础DNA（脱氧核糖核酸）,遗传变异的物质基础是蛋白质还是核酸，曾是生物学

5、中激烈争论的重大问题之一。直至1944年后由于连续利用微生物这一有利的实验对象设计了3个著名的实验，才以确凿的事实证实了核酸尤其是DNA才是遗传变异的真正物质基础。,三个经典实验与遗传物质,7.1.1 遗传变异的物质基础DNA,1、经典转化实验,以肺炎链球菌(Streptococcus pneumoniae)作为研究对象，肺炎链球菌可以使人患肺炎，也可以使小白鼠患败血病而死亡； 有荚膜者是致病性的，它的菌落表面光滑(smooth)，称为S型； 有的不形成荚膜，无致病性，菌落外观粗糙(rough)，故称R型。,有荚膜，致病的，菌落表面光滑（smooth）,不形成荚膜，无致病性，菌落外观粗糙（ro

6、ugh),离体转化实验,1944年，O.T.Avery、C.M.Macleod和M.McCarty从热死的S型肺炎链球菌中提纯了可能作为转化因子的各种成分，并在离体条件下进行了转化实验。,Avery等的体外培养实验(1944),分离后的S型细胞物质对R型细胞的转化,分析：S型细菌的DNA能将肺炎链球菌的R型转化为S型。而DNA纯度越高，转化效率也越高，只取纯DNA的610-8的量时，仍有转化能力。这说明，S型菌株转移给R型菌株的是以DNA为基础的遗传因子。,7.1.1 遗传变异的物质基础DNA,2、噬菌体感染实验,1952年，A.D.Hershey和M.Chase发表了证明噬菌体的遗传物质基础

7、的著名实验噬菌体感染实验。 首先，他们将E.coli培养在以放射性32P3O4或35S2O4作为磷源或硫源的合成培养基中。结果,可以获得含32P-DNA(噬菌体核心)的噬菌体或含35S-蛋白质(噬菌体外壳)的两种实验用噬菌体。,7.1.1 遗传变异的物质基础DNA,3、烟花草叶病毒的拆开与重组实验,H.Fraenkel-Conrat(1956)用含RNA的烟草花叶病毒(TMV)进行了著名的植物病毒重建实验。 把TMV和HRV（霍氏车前花叶病毒）的蛋白质外壳与RNA相分离。 用TMV的RNA与HRV的蛋白质外壳，HRV的RNA与TMV的蛋白质外壳重建后的杂合病毒去感染烟草。,三个经典试验结果,细

8、胞生物的遗传物质是双链DNA；病毒的遗传物质可以是单链的或双链的DNA或RNA， 即：ssDNA，dsDNA，ssRNA或dsRNA。,三个经典试验结果,朊病毒的发现和思考无论是DNA还是RNA作为遗传物质的基础已是无可辨驳的事实。但朊病毒的发现对“蛋白质不是遗传物质”的定论也带来一些疑云。PrP是具有传染性的蛋白质致病因子，迄今未发现蛋白内有核酸，但已知的传染性疾病的传播必须有核酸组成的遗传物质，才能感染宿主并在宿主体内自然繁殖。那么这是生命界的又一特例呢？还是因为目前人们的认识和技术所限而尚未揭示的生命之谜呢？还有待于生命科学家去认识和探索。,规则的双螺旋结构,通常呈单链结构,脱氧核苷酸,

9、核糖核苷酸,腺嘌呤（A） 鸟嘌呤（G）,腺嘌呤（A） 鸟嘌呤（G）,胞嘧啶（C） 胸腺嘧啶（T）,胞嘧啶（C） 尿嘧啶（U）,脱氧核糖,核糖,磷酸,磷酸,DNA与RNA分子的比较,7.1.2 DNA的结构与复制,1953年的克里克（Francis Crick)（右）和沃森(James Watson)在实验室里，他们两人因为发现了DNA的分子结构，而在1962年与威尔金斯一起获得诺贝尔生理学和医学奖。,DNA（脱氧核糖核酸）： 高分子化合物,7.1.2 DNA的结构与复制,DNA的结构 DNA由两条多核苷酸组成的链配对而成，两条链彼此互补，方向相反，以右手螺旋的方式围绕一根主轴而互相盘绕形成。四

10、种碱基A（腺嘌呤）、T（胸腺嘧啶）、G（鸟嘌呤）、C（胞嘧啶）相互配对。A T,G C互相间通过氢键连接。,7.1.2 DNA的结构与复制,DNA的结构,每条核苷酸链均由脱氧核糖磷酸脱氧核糖磷酸交替排列而成（磷酸二酯键）。,7.1.2 DNA的结构与复制,DNA的结构,四种碱基结构,7.1.2 DNA的结构与复制,DNA的结构,碱基配对（依靠氢键连接）,G C,A T,脱氧 核糖,磷酸,碱基,大 部 分 DNA 具 有 双 螺 旋 结 构 ， 亦 称 为 B 型 。,7.1.2 DNA的结构与复制,DNA的存在形式,除部分病毒的遗传物质是RNA外，其余病毒和全部具有典型细胞结构的生物体的遗传物

11、质都是DNA。按其在细胞中的存在形式可分成染色体DNA、染色体外DNA、RNA作为遗传物质、朊病毒的遗传物质。,7.1.2 DNA的结构与复制,1.染色体DNA 真核生物的染色体。真核生物的染色体主要由DNA和组蛋白(H1，H2A，H2B，H3，H4)构成。原核生物的染色体。原核生物的染色体的DNA与很少量的蛋白质结合，或者是裸露的。它们大多是双链的，呈环状或线状。,7.1.2 DNA的结构与复制,2.染色体外DNA,真核微生物中的细胞器DNA：叶绿体、线粒体、中心粒、毛基体等原核微生物和真核微生物的酵母菌：质粒插入序列、转座子、Mu噬菌体等,染色体指携带细胞功能所必备的基因的遗传单元。病毒是

12、非细胞生物，它们的全套遗传基因称为基因组，但 不足以形成染色体。原核生物的染色体常为一个环状的DNA分子。 =DNA真核生物的细胞有几条至几十条染色体，各含一个线状的DNA分子。 =DNA+组蛋白,真核生物的染色体结构,细菌染色体DNA的大小和结构,原核生物的质粒,游离于原核生物染色体外，具有独立复制能力的小型共价闭合环状DNA分子，即cccDNA (circular covalently closed DNA)，称为质粒。 质粒具有超螺旋状的结构，携带着某些染色体所没有的基因，赋予原核生物某些对其生存必不可少的特殊功能。 并非细胞必须，仅与某些性状有关; 常作为基因转移的运载工具。,Plas

13、mid pBR322,质粒的主要类型,致育因子 Fertility factor，F因子（致育因子，性因子，约2%核染色体，94.5kb，编码的基因约1/3与接合有关） 抗性因子 Resistance factor，R因子（抗药性因子，其基因编码的物质对抗生素有抗性）,Ti因子诱癌质粒，可同植物细胞中的核染色体整合，破坏控制细胞分裂的激素调节系统，从而使其变成癌细胞。,Col因子大肠杆菌素因子，即使大肠杆菌分泌大肠杆菌素,巨大质粒分子量200300106Da，比一般质粒大几十到几百倍，上面有固氮基因。,降解性质粒可以编码许多降解性酶类，使细菌降解特殊物质。,只在假单胞菌属中发现。 它们的降解性

14、质粒可为一系列能降解复杂物质的酶编码，从而能利用一般细菌所难以分解的物质做碳源。,7.1.2 DNA的结构与复制,基因遗传因子,基因是一切生物体内储存遗传信息的、有自我复制能力的遗传功能单位。它是DNA分子上具有特定碱基顺序，即核苷酸顺序的片断。,遗传物质的最小功能单位。 基因既是一个结构单位，也是一个功能单位。 按功能可把基因分为三种：结构基因、操纵基因、调节基因。,7.1.2 DNA的结构与复制,基因遗传因子,结构基因：编码蛋白质或酶的结构,控制某种蛋白质或酶的合成。 操纵基因：操纵结构基因的表达。 调节基因：控制结构基团。,7.1.2 DNA的结构与复制,遗传信息的传递,DNA遗传信息需

15、要通过一系列物质变化过程才能在生理上和形态上表达出相应的遗传性状。,现代生物遗传学已经证明：亲代的性状是通过脱氧核糖核酸（DNA）将决定各种遗传性状的遗传信息传给子代的。子代根据DNA所携带的遗传信息，产生一定形态结构的蛋白质，由一定结构的蛋白质就可决定子代具有一定形态结构和生理生化特性。,7.1.2 DNA的结构与复制,基因信息的传递,分子遗传学的中心法则,1958年Crick和1970年Temin,7.1.2 DNA的结构与复制,DNA的复制,半保留式的自我复制能力,解旋 复制 分配,4dNTP,注意：复制过程必须有酶的参与，如：解旋酶、聚合酶等。解旋过程中，并不是完全断开后才开始复制，而

16、是解开一段后，就进行复制。复制好的就开始形成双螺旋。每个子代细胞都获得了亲代细胞的一个DNA单链。,7.1.3 DNA的变性与复性,DNA的变性,双链DNA受热或其它因素的作用，两条链之间的结合力被破坏而分开成单链的DNA，即称为DNA变性。,7.1.3 DNA的变性与复性,DNA的变性,加热引起DNA变性是实验室最常用的方法。 A260：260nm波长处DNA对紫外辐射的吸收值。 Tm：解链温度或熔解温度，A260升高达到一半时的温度。 DNA分子越大，G-C碱基越多，Tm值越高。,7.1.3 DNA的变性与复性,DNA的复性,变性DNA溶液经适当处理后重新形成天然DNA的过程叫复性，或叫退

17、火。,注意：DNA的复性是随机的。即复性的DNA不可能完全回复到原来状态。,7.1.4 RNA,RNA（核糖核酸）和DNA很相似，不同的是以核糖代替脱氧核糖，以尿嘧啶(U)代替胸腺嘧啶(T)。,7.1.4 RNA,RNA有四种: tRNA、rRNA、mRNA和反义RNA，它们均由DNA转录而成。分别在蛋白质合成过程中担任不同的角色。mRNA叫信使 RNA，tRNA叫转移RNA，反义RNA起调节作用，决定mRNA翻译合成速度。rRNA（核糖体RNA）,7.1.4 RNA,DNA转录成RNA,非模板链,模板链,mRNA翻译的模板,CAACUGCAGACAUAUAUGAUACAAUUUGAUCAGU

18、AU,5/,3/,-Gln-Leu-Gln-Thr-Tyr-Met-Ile-Gln-Phe-Asp-Gln-Tyr-,7.1.5 遗传密码,mRNA分子中，从5-3每三个相邻的 碱基组成的三联体，代表某个氨基酸,共有64种。,(codon),密码子：,7.1.5 遗传密码,遗传密码表,遗传密码表,密码子的特点,(1)连续性:两个密码子之间无任何核苷酸加以隔开和重叠，如插入/删除碱基，可发生移码突变或框移,密码子的特点,(2)简并性: 除Met（甲硫氨酸），Trp（色氨酸）外，其余氨基酸均由2个以上密码子编码（UUU和UUC都是苯丙氨酸的密码子，UCU、UCC、UCA、UCG、AGU和AGC都是

19、丝氨酸的密码子）。其中 UAG,UAA,UGA是终止密码子,AUG是起始密码子同时又编码甲硫氨酸；但细菌例外，在细菌中GUG表示起始的甲酰蛋氨酸。 (3)通用性:所有的生物使用同一套密码子，仅有少数例外，例如：线粒体起始密码子为AUG、AUU;终止密码为AGA，AGC；色氨酸为UGA等。,密码子的特点,（四）摆动性：反密码子与mRNA的第三个核苷酸配对时，不严格遵从碱基配对原则，可出现U-G,I-C,I-A,此种配对为不稳定配对，又称摇摆性。一般前两个碱基决定其专一性，第三位碱基可有变异。,tRNA反密码环,mRNA,7.1.6 微生物生长与蛋白质合成,微生物生长的主要活动是蛋白质的合成。蛋白

20、质合成(翻译)在核糖体上进行，与RNA的复制（合成）及DNA的复制（合成）有关。,蛋白质合成过程：DNA复制：相应的DNA链进行自我复制；转录mRNA：由DNA转录成mRNA，同时也转录成其他几种RNA；翻译：由tRNA完成；蛋白质合成：合成多肽，最终生成具有特定功能的蛋白质。,7.1.6 微生物生长与蛋白质合成,T,C,A,T,G,A,T,T,A,A,G,T,A,C,T,A,A,T,DNA的平面结构图,细胞核中,A,C,G,游离的核糖核苷酸 4NTP,DNA 解旋，一条链为模板合成RNA,细胞核中,A,C,G,A,G,T,A,C,T,A,A,T,DNA与RNA的碱基互补配对,细胞核中,聚合酶

21、,A,C,G,游离的核糖核苷酸,A,C,G,4NTP,细胞质,核孔,DNA,mRNA在细胞核中合成,细胞核内,U,C,A,U,G,A,U,U,A,mRNA,U,C,A,U,G,A,U,U,A,mRNA,U,C,A,U,G,A,U,U,A,mRNA,细胞核内,密码子,密码子,密码子,密码子,mRNA上决定一个氨基酸的三个相邻的碱基,U,C,A,U,G,A,U,A,mRNA,U,tRNA在氨基酰-tRNA合成酶的帮助下，能够识别相应的氨基酸，并通过tRNA氨基酸臂的3-OH与氨基酸的羧基形成活化酯氨基酰-tRNA。,氨基酰-tRNA 合成酶 氨基酸+ATP+tRNA+H2O 氨基酰-tRNA+ A

22、MP +PPi,3-OH,反密码子,亮氨酸,天冬氨酸,异亮氨酸,氨基酸（原料）,氨基酰-tRNA 合成酶,tRNA的一端运载着氨基酸,氨基酰-tRNA通过反密码臂上的三联体反密码子识别mRNA上相应的遗传密码，并将所携带的氨基酸按mRNA遗传密码的顺序安置在特定的位置，最后在核糖体中合成肽链。,细胞质中,核糖体,细胞质中,核糖体,亮氨酸,U,天冬氨酸,A,C,U,异亮氨酸,A,U,G,细胞质中,核糖体,亮氨酸,U,天冬氨酸,A,C,U,异亮氨酸,缩合,亮氨酸,天冬氨酸,异亮氨酸,以mRNA为模板形成了有一定氨基酸顺序的蛋白质,细胞质中,蛋白质的合成,蛋白质的合成,蛋白质的合成,蛋白质的合成,蛋

23、白质的合成,蛋白质的合成,蛋白质的合成,蛋白质的合成,7.1.7 微生物的细胞分裂,由于DNA复制和蛋白质的合成而使两者成倍增加后的一个有秩序的过程，即微生物细胞的分裂。成倍增加的核物质和蛋白质均等地分给两个子细胞，在细胞中部合成横隔膜并逐渐内陷，最终将两个子细胞分开。,一、变异的实质在微生物遗传过程中，由于某种因素的影响，DNA上的碱基对发生差错，出现碱基的缺失、置换或插入，改变了基因内原有的碱基顺序，导致后代性状的改变。当这种改变可以遗传时，就是发生了突变。所以说基因突变是微生物发生变异的实质。,7.2 微生物的变异,7.2 微生物的变异,突变率：某一细胞（或病毒颗粒）在每一世代中发生某性

24、状突变的频率，称突变率。例如： 突变率为108，表示该细胞在1亿次分裂过程中，平均会发生1次突变。 也可以用某一单位群体在每一世代（即分裂一次）中产生突变株的数目来表示。某一基因的突变一般是独立发生的，它的突变不会影响其它基因的突变率。表明双重或多重基因突变的概率是很低的。,突变,基因突变,基因重组,诱发突变,自发突变,点突变染色体畸变,碱基置换 移码突变,转换 颠换,缺失 添加,缺失 添加 易位 倒位,二、突变的类型,二、突变的类型 根据突变的条件和原因（突变机理） 自发突变：微生物在自然条件下，没有人工参与而发生的基因突变。 多因素低剂量的诱变效应背景因素和环境因素的诱变微生物自身有害代谢

25、产物的诱变 互变异构效应碱基配对A-T、G-C，在DNA复制时出现与前不同的碱基对：G-T、C-A。 环出效应 诱发突变 碱基对的置换 点突变 移码突变 染色体畸变,7.2 微生物的变异,诱发突变,碱基对的置换,7.2 微生物的变异,碱基对的置换可分成两个亚类：一类是DNA 链上的一个嘌呤被另一个嘌呤或是一个嘧啶被另一个嘧啶所置换，称为转换；另一类是DNA 链上的一个嘌呤被另一个嘧啶或是一个嘧啶被另一个嘌呤所置换，称为颠换 . （实线代表转换，虚线代表颠换）,直接引起置换的诱变剂：可直接与核酸的碱基发生化学反应的诱变剂，例如亚硝酸、羟胺和各种烷化剂。间接引起置换的诱变剂：碱基类似物，通过细胞的

26、代谢活动渗入到DNA分子中引起。,腺嘌呤,次黄嘌呤,腺嘌呤氧化脱氨后形成烯醇式次黄嘌呤（He） He通过互变异构效应形成酮式次黄嘌呤（HK） DNA复制时，HK 与胞嘧啶（C）配对 DNA第二次复制时，C与G正常配对，实现了转换。,碱基转换的分子机制以亚硝酸为例HNO2 胞嘧啶（C） 尿嘧啶（U）HNO2 腺嘌呤（A） 次黄嘌呤（H）HNO2 鸟嘌呤（G） 黄嘌呤（X） 这些反应及形成物均可在DNA复制中产生影响，主要是使碱基对发生转换。,移码突变,7.2 微生物的变异,指诱变剂会使DNA序列中一个或少数几个核苷酸发生增添(插入)或缺失，从而使该部位后面的全部遗传密码发生转录和翻译错误的一类突

27、变。能引起移码突变的因素是一些吖啶类染料，包括原黄素、吖啶黄、吖啶橙和-氨基吖啶等，以及一系列“ICR”类化合物。,吖啶类化合物诱发的移码突变及其回复突变图示：,染色体畸变,7.2 微生物的变异,某些强烈理化因子，如X射线等的辐射及烷化剂、亚硝酸等，除了能引起上述的点突变外，还会引起DNA的大损伤染色体畸变，既包括染色体结构上的缺失、重复、插入、易位和倒位，也包括染色体数目的变化。,染色体畸变（chromosomal aberration）,某些理化因子，如X射线等的辐射及烷化剂、亚硝酸等，除了能引起点突变外，还会引起DNA的大损伤（macrolesion）染色体畸变，它包括： 染色体结构上的

28、变化： 缺失（deletion） 重复（duplication） 易位（translocation） 倒位（inversion） 染色体数目的变化,分为染色体内畸变和染色体间畸变两类。 染色体内畸变：只涉及一条染色体上的变化， 如发生染色体的部分缺失或重复时，其结果可造成基因的减少或增加； 如发生倒位或易位时，则可造成基因排列顺序的改变，但数目却不改变。 倒位-是指断裂下来的一段染色体旋转180后，重新插入到原来染色体的原位置上，从而使其基因顺序与其它的基因顺序相反； 易位-是指断裂下来的一小段染色体再顺向或逆向地插入到同一条染色体的其它部位上。 染色体间畸变：指非同源染色体间的易位。,若干诱

29、变剂的作用机制及诱变功能,诱变因素 在DNA上的初级效应 遗传效应碱基类似物 掺入作用 AT=GC双向转换羟 胺 与胞嘧啶起反应 GCAT的转换亚硝酸 A、G、C的氧化脱氨作用 AT=GC双向转换交 联 缺失 烷化剂 烷化碱基（主要是G） AT=GC双向转换烷化磷酸基团 ATTA的颠换丧失烷化的嘌呤 GCCG的颠换糖-磷酸骨架的断裂 巨大损伤（缺失、重复、倒位、易位）丫啶类 碱基之间的相互作用（双链变形） 码组移动（或）紫外线 形成嘧啶的水合物 GCAT转换形成嘧啶的二聚体 码组移动（或） 交 联 电离辐射 碱基的羟基化核降解 AT=GC双向转换DNA降解 码组移动（或） 糖-磷酸骨架的断裂

30、巨大损伤 （缺失、重复、倒位、易位）加热 C脱氨基 CGTA转换Mu噬菌体 结合到一个基因中间 码组移动,紫外辐射诱变作用机制,7.2 微生物的变异,紫外辐射的生物学效应主要是引起DNA的变化。DNA链上的碱基对紫外辐射很敏感，嘌呤和嘧啶吸收的光波波长与紫外辐射波长接近，可强烈吸收紫外辐射。,嘧啶对紫外线的敏感性要比嘌呤强得多，其光化学反应产物主要是嘧啶二聚体和水合物，相邻嘧啶形成二聚体后造成局部DNA分子无法配对，从而引起微生物的死亡或突变。,DNA损伤的修复,7.2 微生物的变异,紫外辐射对DNA的破坏和DNA的修复,DNA损伤的修复,7.2 微生物的变异,光复活和暗复活 重组修复 SOS

31、修复 适应性修复,切补修复暗修复 为把它与光复活作用区分开，切补修复常称为暗修复。它作为许多不同类型的DNA损伤修复的普遍系统，如嘧啶二聚体和错误碱基配对引起的DNA损伤。B、C和基因产物结合形成一个核酸内切酶，它能识别碱基改变所引起的DNA螺旋扭曲。uvrABC内切核酸酶在损伤的任何一边作一切口，聚合酶I切除和替换损伤部位的碱基，DNA连接酶将缺口填补上。,1、由核酸内切酶切开二聚体的5末端，形成3-OH和5-P的单链缺口 2、核酸外切酶从5-P到3-OH方向切除二聚体，并扩大缺口。 3、DNA聚合酶以另一条互补链为模板，从原有链上暴露的3-OH端起合成缺失片段。 4、连接酶将新合成的3-O

32、H与原有的5-P相连接。,细胞在不切除二聚体的情况下，以带有二聚体的这条链为模板合成互补单链，但在每个二聚体附近留有一空隙。通过染色体交换，空隙部位就不在面对着胸腺嘧啶二聚体，而是面对着正常的单链，在这种条件下，DNA聚合酶和连接酶起作用将空隙部位进行修复， 重组修复中的DNA损伤并没有去除，但随着微生物的传代繁殖，损伤的比例逐渐降低。,7.2 微生物的变异,突变与育种,定向培育和驯化定向培育是指用某一特定因素长期处理某一微生物培养物，同时不断对它们进行传代，以达到累积并选择相应的自发突变体的一种古老的育种方法。由于定向培育的自发突变频率较低，变异程度较轻微，所以培育新种的过程十分缓慢。环境工

33、程仍采用定向培育的方法培育菌种，也称为驯化。,7.2 微生物的变异,突变与育种,诱变育种诱变育种是指利用物理或化学诱变剂处理均匀而分散的微生物细胞群，促进其突变频率大幅度提高，然后设法采用简便、快速高效的筛选方法，从中挑选少数符合育种目的的突变株，以供生产实践或科学实验之用。诱变育种不仅能提高菌种的生产性能而增加产品的产量外，而且还可达到改进产品质量、扩大品种和简化生产工艺等目的，故仍是目前使用最广泛的育种手段之一。,7.2 微生物的变异,诱变育种,变异,基因突变,基因重组(gene recombination),诱变,自发突变,点突变染色体畸变,碱基置换 移码突变,转换 颠换,缺失 添加,缺

34、失 添加 易位 倒位,基因重组又称为遗传重组，它是指把两个不同性状个体内的遗传基因转移到一起，经过遗传分子的重新组合后，形成新遗传型个体的过程。,微生物中各种基因重组形式的比较,7.3 基因重组,基因重组时，是否发生基因突变？ 不重组是分子水平上的概念，可以理解成是遗传物质分子水平上的杂交，而一般所说的杂交是细胞水平上的概念。 杂交中必然包含着重组，而重组则不限于杂交一种形式。真核微生物中的有性杂交，准性生殖以及原核微生物中的转化、转导、接合和溶原转变等都是基因重组在细胞水平上的反映。,7.3 基因重组,一、杂交（hybridization）,杂交是通过双亲细胞的融合，使整套染色体的基因重组，

35、或是通过双亲细胞的沟通，是部分染色体基因重组。,有性杂交：一般指不同遗传型的两性细胞间发生的接合和随之进行的染色体重组，进而产生新遗传型后代的一种育种技术。 准性杂交：是一种类似于有性生殖但比它更为原始的两性生殖方式。它可使同一生物的两个不同来源的体细胞经融合后，不通过减数分裂而导致低频率的基因重组。,7.3 基因重组,二、转化（transformation）,受体细胞直接吸收来自供体细胞的DNA片段，并把它整合到自己的基因组中，从而获得了供体细胞的部分遗传性状的现象，称为转化。转化后的受体菌，称为转化子。供体菌的DNA片段称为转化因子。 只有处于感受态的细胞才能接受转化因子，进行转化作用。感

36、受态细胞是能吸收外来的DNA片断，并能把它整合到自己的染色体上以实现转化的细胞。,转化现象是在1928年由Griffith进行肺炎双球菌的研究中发现的。 受体菌直接接受供体菌的DNA片段而获得部分新的遗传性状的现象，就称为转化或转化作用。,7.3 基因重组,二、转化,转化过程： 感受态细胞的出现 DNA的吸附 DNA进入细胞 DNA解链，形成受体DNA供体DNA复合物 DNA复制分离,7.3 基因重组,三、转导（transfection）,转导现象由J.Lederberg等首先在鼠伤寒沙门氏菌中发现，以后又在许多原核微生物中陆续发现。 通过温和噬菌体的媒介，把供体细胞的小片段DNA携带到受体细

37、胞中，通过交换与整合，使后者获得前者部分遗传性状的现象，称为转导。由转导作用而获得部分新遗传性状的重组细胞，称为转导子。,7.3 基因重组,三、转导（transfection）,普遍性转导 由缺陷型噬菌体误包（而非整合）供体细菌DNA中的任何一部分片段（包括核外遗传物质在内）后，当它再次感染受体细菌时，使后者获得了这部分遗传性状的现象，称为普遍性转导。它的转导频率为 105108。,7.3 基因重组,三、转导（transfection）,局限性转导 由温和噬菌体侵染而形成的某一溶源细菌群被诱导裂解时，其中极少数个体的DNA可能与噬菌体DNA 发生若干特定基因的交换，从而被整合到噬菌体的基因组上

38、，当该噬菌体再次感染受体细菌时，就使受体细菌获得了这一特定遗传性状的现象，称为局限性转导，它的转导频率为 10-6。,溶源转变,溶源转变(lysogenic conversion)：是一种与转导相似，但本质上却不相同的特殊现象，即当温和噬菌体感染其宿主后，发生溶源化，因噬菌体的基因整合到宿主的核基因组上，而使后者获得除免疫性以外的新性状的现象，称为溶源转变。 当宿主丧失这一噬菌体时，通过溶源转变而获得的性状也同时消失。 溶源转变与转导有本质上的不同，首先是它的温和噬菌体不携带任何供体菌的基因；其次，这种噬菌体是完整的，而不是缺陷的。,原生质体融合(protoplast fusion),通过人为

39、的方法，使遗传性状不同的两细胞的原生质体发生融合，并进而发生遗传重组以产生同时带有双亲性状的、遗传稳定的融合子(fusant)的过程，称为原生质体融合。,7.4 突变体的检测与筛选,一、突变体的检测,直接检测表现型菌落、影印平板法等 间接检测法 通过控制培养条件获得， 如Ames试验。,影印平板技术,7.4 突变体的检测与筛选,二、突变体的筛选,为什么进行突变体的筛选？ 诱变处理使微生物群体中出现各种突变型，其中绝大多数是负变株。要获得预定的效应表型主要靠科学的筛选方案和筛选方法 。 有效技术是创造一种只允许突变体生长，抑制原养型菌生长的培养基或生长环境条件。,7.5 分子遗传学新技术在环境工

40、程与环境保护中的应用,遗传工程是从分子遗传学,特别是从细菌质粒和限制性酶等研究中发展起来的一个分子遗传学的分支学科。它综合采用了生物化学和微生物学的现代技术和手段,尤其是酶学的方法,将某种生物的基因(DNA片段)转移到另一生物的细胞中去,通过其复制以及表达,使该生物获得新的遗传性状。 遗传工程可分为狭义和广义两种。狭义的遗传工程即指基因工程,广义的遗传工程还包括细胞工程,染色体工程,细胞器工程等。习惯上所说的遗传工程多指基因工程。 基因工程又称重组DNA技术,就是在体外对不同来源的DNA分子进行重组,将此重组DNA引入合适的寄主细胞内,并使之复制和表达。,质粒育种,质粒：染色体外DNA，游离于

41、原核生物染色体外,具有独立复制能力的小型共价闭合环状DNA分子，在细胞分裂过程中能复制将遗传性状传给后代。,质粒上携带着某些染色体上所没有的基因,使细菌等原核生物被赋予了某些对其生存可有可无的特殊功能。 外界因素可使质粒发生丢失或转移，丧失由该质粒决定的某些性状，但菌体不死亡。 质粒可诱导产生。 质粒有重组功能。,7.5 分子遗传学新技术在环境工程与环境保护中的应用,质粒是一种复制子 严紧型复制控制：与核染色体复制同步 松弛型复制控制：与核染色体复制不同步,发现的质粒基因： F因子：致育因子或性因子，大肠杆菌等细菌中决定性别的质粒。 R因子：对多种抗生素表现抗性 Col因子：控制大肠杆菌素产生

42、 降解性质粒：假单胞菌中发现，可编码一系列可降解能降解复杂物质的酶，从而能利用细菌难以利用的物质做C源。,7.5 分子遗传学新技术在环境工程与环境保护中的应用,质粒育种,将两种或多种微生物通过细胞结合或融合技术，使供体菌的质粒转移到受体菌内，使受体菌保留自身功能质粒，同时获得供体菌的功能质粒，即培育出具有两种功能质粒的新品种。,7.5 分子遗传学新技术在环境工程与环境保护中的应用,基因工程特点,打破了物种的界限，突破了亲缘关系的限制。 可进行定向变异与育种。 可创造自然界原来没有的生物。,7.5 分子遗传学新技术在环境工程与环境保护中的应用,基因工程的操作,从供体细胞中选取带有目的基因的DNA

43、片断； 目的DNA的片断和质粒在体外重组； 将重组体转入受体细胞； 重组体克隆的筛选与鉴定； 外源基因表达产物的分离与提纯。,7.5 分子遗传学新技术在环境工程与环境保护中的应用,目的基因的取得,途径有3种： 选择适宜的供体细胞，以便从中采集分离到有生产意义的目的基因； 通过逆转录酶的作用由mRNA合成cDNA(互补DNA)； 用化学方法合成特定功能的基因。,7.5 分子遗传学新技术在环境工程与环境保护中的应用,载体,载体必须具备下列几个条件： 是一个有自我复制能力的复制子，松弛型复制； 抗生素抗性选择； 能在受体细胞内大量增殖，有较高的复制率； 载体上最好只有一个限制性内切核酸酶的切口，使目

44、的基因能固定地整合到载体DNA的一定位置上； 载体上必须有一种选择性遗传标记，赋予宿主细胞易于检测的表型。目前原核受体细胞的载体主要有细菌质粒(松弛型)和噬菌体两类。真核细胞受体的载体主要有SV40病毒（动物）和Ti质粒（植物）。,7.5 分子遗传学新技术在环境工程与环境保护中的应用,目的基因与载体DNA的体外重组,对目的基因与载体DNA均采用限制性内切酶处理，从而获得互补粘性末端或人工合成粘性末端。然后把两者放在较低的温度(56)下混合“退火”。由于每一种限制性内切酶所切断的双链DNA片段的粘性末端有相同的核苷酸组分，所以当两者相混时，凡粘性末端上碱基互补的片段，就会因氢键的作用而彼此吸引，

45、重新形成双链。这时，在外加连接酶的作用下，供体的DNA片段与质粒DNA片段的裂口处被“缝合”，形成一个完整的有复制能力的环状重组体。,7.5 分子遗传学新技术在环境工程与环境保护中的应用,重组载体引入受体细胞,体外反应生成的重组载体只有将其引入受体细胞后，才能使其基因扩增和表达。受体细胞可以是微生物细胞，也可以是动物或植物细胞。把重组载体DNA分子引入受体细胞的方法很多。若以重组质粒作为载体时，可以用转化的手段；若以病毒DNA作为重组载体时，则用感染的方法。,7.5 分子遗传学新技术在环境工程与环境保护中的应用,PCR（聚合酶链反应）技术在1983年，美国Cetus公司人类遗传研究室的科学家.B.Mullis发明的。PCR是一种在体外快速扩增特定基因或DNA序列的方法，有称之为体外扩增法。,7.5 分子遗传学新技术在环境工程与环境保护中的应用,7.5 分子遗传学新技术在环境工程与环境保护中的应用,PCR操作步骤,