1、第七章 微生物的生长繁殖与环境,生物个体物质有规律地、不可逆增加，导致个体体积扩大的生物学过程。,生长：,生物个体生长到一定阶段，通过特定方式产生新的生命个体，即引起生命个体数量增加的生物学过程。,繁殖：,生长、繁殖就是保证微生物获得巨大数量的必要前提,第一节 微生物的个体与群体生长和繁殖,微生物的生长表现在微生物的个体生长和群体生长两个水平上。,一个微生物细胞,合适的外界条件，吸收营养物质，进行代谢。,如果同化作用的速度超过了异化作用,个体原生质的总量（重量、体积、大小）就不断增加。,如果各细胞组分是按恰当的比例增长时，则达到一定程度后就会发生繁殖，引起个体数目的增加。,群体内各个个体的进一
2、步生长,群体的生长,个体生长 个体繁殖 群体生长,在微生物学中提到的“生长”，一般均指群体生长，这一点与研究大生物时有所不同。,在一定时间和条件下细胞数量的增加（微生物群体生长）。,微生物生长:,一、个体生长与繁殖,要研究单个细菌细胞内,所发生的生物化学 变化和细胞学变化,目前使用的方法: 一是用电子显微镜观察细菌细胞的超薄切片 二是使用同步培养技术(Synchronous culture),同步培养:,设法使群体中的所有细胞尽可能都处于同样细胞生长和分裂周期中,然后分析此群体的各种生物化学特征,从而了解单个细胞所发生的变化。,同步生长：,这种通过同步培养而使细胞群体处于分裂步调一致的状态，就
3、称同步生长。,获得细菌同步生长的方法主要有两类：,通过环境条件来诱导同步性,温度 培养基成份控制 其他：如光照和黑暗交替培养,选择性过滤 梯度离心法 硝酸纤维素滤膜法,硝酸纤维素滤膜法是最经典的获得同步生长的方法,由于细胞的个体差异，同步生长往往只能维持2-3个世代，随后又逐渐转变为随机生长。,通过物理学方法从随机的、不同步细菌群体中选择出同步的菌体,（一）无分支单细胞微生物的群体生长特征,无分支单细胞微生物主要包括细菌和酵母菌，其群体生长是以群体中细胞数量的增加来表示的，由一个细胞分裂成为两个细胞的时间间隔称为世代，一个世代所需的时间就是代时（Generation time, G ），代时也
4、就是群体细胞数目扩大一倍所需 时间，有时也称为倍增时间（Doubling time）。,右图表示的是一个细胞经过若干代分裂后的情况。右图可见，每经过一个代时，细胞数目就增加一倍，呈指数增加，因而被称为指数生长，这就是单细胞群体生长的特征。,二、微生物的群体生长规律,（二）生长曲线(Growth Curve),把少量纯种单细胞微生物接种到恒容积的液体培养基中后，在适宜的温度、通气（厌氧菌则不能通气）等条件下，它们的群体就会有规律的生长起来，以细胞数目的对数值做纵坐标，以培养时间为横坐标，就可以画出一条有规律的曲线，这就是微生物的生长曲线。,细菌的生长曲线一般用菌数的对数为纵坐标作图,一条典型的生
5、长曲线至少可以分为： 迟缓期，对数期，稳定期和衰亡期等四个生长时期,根据微生物的生长速率常数（growth rate constant ），即每小时的分裂代数（R）的不同。,又称停滞期、调整期或适应期。指少量微生物接种到新培养基中后，在开始培养的一段时间内细胞数目不增加的时期。,（1）延滞期（lag phase）,生长速率常数等于零。 细胞形态变大或增长例如巨大芽孢杆菌，在迟缓期末，细胞的平均长度比刚接种时长6倍。一般来说处于延滞期的细菌细胞体积最大。 细胞内RNA尤其是rRNA含量增高，原生质呈噬碱性。 合成代谢活跃，核糖体、酶类和ATP的合成加快，易产生诱导酶。 对外界不良条件反应敏感（如
6、：温度、NaCl溶液浓度、抗生素等）。,（1）延滞期（lag phase）,延滞期特点：,影响延滞期长短的因素很多，除菌种外，主要有三个。 接种龄 接种量 培养基成分,延滞期出现的原因：,缺乏细胞分裂的必需因子，所以合成新的酶系和中间代谢产物以适应新环境。,研究延滞期长短的意义？,在生产实践中缩短延滞期的常用手段：,(1)通过遗传学方法改变种的遗传特性使延滞期缩短；,(2)利用对数生长期的细胞作为种子；,(3)尽量使接种前后所使用的培养基组成不要相差太大；,(4)适当扩大接种量；,如何缩短延滞期？,（2）指数期（exponential phase）,又称对数期（logarithmic phas
7、e），是指在生长曲线中，紧接着延滞期的一个细胞以几何级数速度分裂的一段时期。,生长速率常数R最大，因而细胞每分裂一次所需的代时或原生质增加一倍所需的倍增时间最短且稳定。 细胞进行平衡生长，菌体内各种成分最为均匀。 酶系活跃，代谢旺盛。 细菌数目增加与原生质总量增加，与菌液浊度增加呈正相关性 。,指数期特点：,指数生长可以用下式表示：X2= X12n 世代数n可通过上式计算得出，将等式两侧取对数重排后得：lg X2 = lg X1+ nlg2lg X2 - lg X1 lg X2 - lg X1 lg2 0.301,式中： X1 为起始细胞数目， X2 为指数生长某个时刻 t 时的细胞数目，n
8、为世代数,n =,=,（1）繁殖代数（n ）（2）生长速率常数（R）（3）代时（G）,n 3.322（lgx2lgx1） R = = t2t1 t2t1,lgx2lgx1 n = =3.322（lgx2lgx1）lg2,1 t2t1 G = = =R 3.322（lgx2lgx1）,t2-t1,n,在指数生长期中，有三个参数最为重要：,例如：一培养液中微生物数目由开始的12，000（ X1 ），经4h （ t ）后增加到49，000，000（ X2 ）， 这样， n (lg4.9107lg1.2104）0.30112,借助于 n 和 t ，还可以计算出不同培养条件下的代时G，G t / n 在
9、本例中， G 460 / 12 20min 该种微生物的代时为20分钟。在4小时内共繁殖了12代。,思考：大肠杆菌在37的牛奶中每12.5 min繁殖一代，假设牛奶消毒后，大肠杆菌的含量为1个/100 mL，请问按国家标准（30000个mL），该消毒牛奶在37下最多可存放多少时间？,n = 3.322（lgx2lgx1） G = t / n t= G n,代时能够反应细菌的生长速率，代时短，生长速率快，代时长，生长速率慢。在很多微生物学研究中常常要了解微生物的代时。 代时在不同种微生物中的变化很大，另外，同一种微生物，在不同的生长条件下其代时的长短也不同；但是，在一定条件下，每一种微生物的代时
10、是恒定的，因此它是微生物菌种的一个重要特征。,影响指数期微生物代时时间的因素很多，主要有：,菌种：不同的微生物及微生物的不同菌株代时不同；多数微生物的代时为13 h，然而有些快速生长的微生物的代时还不到10min，而另一些微生物的代时却可长达几小时或几天；,一些细菌的代时,菌名 培养基 培养温度 代时min E. coli（大肠杆菌） 肉汤 37 17 E. coli 牛奶 37 12.5 Enterobacter aerogenes（产气肠细菌） 肉汤或牛奶 37 1618 E. aerogenes 组合 37 2944 B. cereus（蜡状芽孢杆菌） 肉汤 30 18 B. therm
11、ophilus（嗜热芽孢杆菌） 肉汤 55 18.3 Lactobacillus acidophilus（嗜酸乳杆菌） 牛奶 37 6687 Streptococcus lactis（乳酸链球菌） 牛奶 37 26 S. lactis 乳糖肉汤 37 48 Salmonella typhi（伤寒沙门氏菌） 肉汤 37 23.5 Azotobacter chroococcum（褐球固氮菌） 葡萄糖 25 34446 Mycobacterium tuberculosis（结核分枝杆菌）组合 37 79293 Nitrobacter agilis（活跃硝化杆菌） 组合 27 1200,温度对微生物的
12、代时有明显影响：E. Coli 在不同温度下的代时 温度（） 代时（min） 温度（） 代时（min） 10 860 35 22 15 120 37 17 20 90 40 17.5 25 40 45 20 30 29 47.5 77,培养温度：,营养成分：同一种细菌，在营养屋丰富的培养基中生长，其代时较短，反之较长； 营养物浓度：在一定范围内，生长速率与营养物浓度呈正比；,凡是处于较低浓度范围内，可影响生长速率的营养物成分，就称为生长限制因子（growyh-limited factor）。,指数期的微生物因其整个群体的生理特性较一致、细胞成分平衡发展和生长速率恒定，故可作为代谢、生理等研究的
13、良好材料，是增殖噬菌体的最适宿主菌龄，也是发酵生产中用作“种子”的最佳种龄。,（3）稳定期（ stationary phase）,又称恒定期或最高生长期。此时培养液中活细菌数最高并维持稳定。,由于营养物质消耗，代谢产物积累和pH等环境变化，逐步不适宜于细菌生长，导致生长速率常数降低直至零(即正生长与负生长相等的动态平衡)。,细胞重要的分化调节阶段： 细胞开始贮存糖原、异染颗粒和脂肪等贮藏物； 多数芽孢杆菌在这时开始形成芽孢； 有的微生物在稳定期时还开始合成抗生素等次生代谢产物。,稳定期特点：,稳定期来到的原因主要是：,1、营养物尤其是生长限制因子的耗尽； 2、营养物的比例失调，例如C/N比值不
14、合适等； 3、酸、醇、毒素或H2O2等有害代谢产物的积累； 4、pH、氧化还原势等物化条件越来越不适宜，等等；,生产上常通过补充营养物质（补料）或取走代谢产物、调节pH、调节温度、对好氧菌增加通气、搅拌或振荡等措施延长稳定生长期，以获得更多的菌体物质或积累更多的代谢产物。,稳定期是以生产菌体或与菌体生长相平行的代谢物为目 的的一些发酵生产的最佳收获期。,（4）衰亡期（ decline或death phase ）,在衰亡期，营养物质耗尽和有毒代谢产物的大量积累，细菌死亡速率超过新生速率，整个群体呈现出负增长。,细胞形态多样，例如会产生很多膨胀、不规则的退化形态； 有的微生物因蛋白水解酶活力的增加
15、就发生自溶； 有的微生物在这时产生或释放对人类有用的抗生素等次生代谢产物； 在芽孢杆菌中，芽孢释放往往也发生在这一时期；,产生衰亡期的主要原因是外界环境对继续生长越来越不利，从而引起细胞内的分解代谢大大超过合成代谢，继而导致菌体死亡。,什么时期菌体代谢产物最多,什么时期细菌细胞代谢活性最强,什么时候细菌细胞总数最多,什么时期细菌细胞生长速度最快,什么时期世代时间短而稳定,对数生长期,最高生长量,最高生长量,对数生长期,对数生长期,小 结,（三）微生物生长与代谢产物形成的关系,微生物发酵形成产物的过程与微生物细胞生长的过程并不总是一致的。一般认为：,初级代谢是给予生物能量和生成中间产物的过程，初
16、级代谢产物的形成往往与微生物细胞的形成过程同步，微生物生长的稳定期是这些产物的最佳收获时机；,次级代谢产物与微生物的生存、生长和繁殖无关。次级代谢产物的形成往往与微生物细胞的形成过程不同步。在分批培养中，它们的形成高峰往往在微生物生长稳定期的后期。,（四）丝状微生物的群体生长,丝状微生物的纯培养采用孢子接种，在液体培养基中振荡培养或深层通气加搅拌培养，菌丝体通过断裂繁殖不形成产孢结构。 以菌丝干重作为衡量生长的指标，即以时间为横坐标，以菌丝干重为纵坐标，绘制生长曲线。 培养时间与菌丝体干重的立方根成直线关系。,可分为三个阶段： 1、停滞期（生长延滞期） 2、迅速生长期（快速生长期） 3、衰亡期
17、（生长衰退期）,第二节 微生物生长与测定方法,一、生长量的测定,既然生长意味着原生质含量的增加，所以测定生长的方法也都直接或间接地以此为根据，而测定繁殖要建立在计数这一基础上。,细胞数目的测定细胞生物量的测定,比例计数法,（B）生物量的测定,（1）细胞干重法（2）总氮量测定法（3）DNA含量测定法（4）代谢活性法,（一）比浊法 细菌培养物在其生长过程中，由于原生质含量的增加，会引起培养物浑浊度的增高。 如果要作精确测定，则可用分光光度计进行。,在一定波长下，测定菌悬液的光密度，以光密度(opticaldensity, 即O.D.)表示菌量。,实验测量时应控制在菌浓度与光密度成正比的线性范围内，
18、否则不准确。,直接计数法只适用于单细胞状态的微生物或丝状微生物所产生的孢子。,1、比例计数法,将已知颗粒浓度的样品（例如血液）与待测细胞细胞浓度的样品混匀后在显微镜下根据二者之间的比例直接推算待测微生物细胞浓度。,（二）直接计数法 直接法就是指在显微镜下直接观察细胞并进行计数的方法，所得的结果是包括死细菌在内的总菌数。,采用细菌计数板或血球计数板，在显微镜下对微生物数量进行直接计数（计算一定容积里样品中微生物的数量）。,缺点：不能区分死菌与活菌； 不适于对运动细菌的计数； 需要相对高的细菌浓度； 个体小的细菌在显微镜下难以观察；,2、血球(细菌)计数板法 用来测定一定容积中的细胞总数目的常规方
19、法。,血球计数板是中有以双线为界划成的方格 25( 或 16) 格，这种以双线为界的格子称为中格，其内有以单线为界的 16 （或 25 ）小格。因此，用于细胞计数的区域的总小格数为：2516 = 400 该 400 个小格排成一正方形的大方格每条边的边长为 1 mm；在进行细胞计数前，先取盖玻片盖于计数方格之上，盖玻片的下平面与刻有方格的血球计数板平面之间留有 0.1mm 高度的空隙。加注在 400 个小格（ 1mm2）之上与盖玻片之间的空隙中的液体总体积应为： 1.0mm1.0mm0.1mm = 0.1mm3,一般表示样品细胞浓度的单位为：亿个 / mL 。因此，在计数后，获得在 400 个
20、小格中的细胞总数，再乘以 104 ，以换算成每 mL 所含细胞数。其计算公式如下： 菌液的含菌数 /mL = 每小格平均菌数 400 10 000 稀释倍数 在进行具体操作时，一般取五个中格进行计数，取格的方法一般有两种： 取计数板斜角线相连的 5 个中格； 取计数板 4 个角上的 4 个中格和计数板正中央的 1 个中格。对横跨位于方格边线上的细胞，在计数时，只计一个方格 4 条边中的 2 条边线上的细胞，而另两条边线上的细胞则不计；取边的原则是每个方格均取上边线与右边线或下边线与左边线。,（三）涂片染色计数用计数板附带的 0.01mL 吸管，吸取定量稀释的细菌悬液，放置刻有 1 cm2 面积
21、的玻片上，使菌液均匀地涂布在 1cm2 面积上，固定后染色，在显微镜下任意选择几个乃至十几个视野来计算细胞数量。根据计算出的视野面积核算出每 1cm2 中的菌数，然后按 1cm2 面积上的菌液量和稀释度，计算每 mL 原液中的含菌数。 原菌液的含菌数 /mL = 视野中的平均菌数 1cm2 / 视野面积 100 稀释倍数,（四）平板菌落计数法一种活菌计数法，是根据活细胞通过生长繁殖会在平板培养基表面形成菌落的原理而设计的方法。,对未知样品进行一系列十倍稀释，然后取一定体积的稀释菌液涂布于琼脂平板上，保温培养直到菌落出现，记录菌落数目并换算成每毫升试样中的活细胞总数。,它是一种最常用的活菌计数法
22、,采用培养平板计数法要求操作熟练 、准确，否则难以得到正确的结果：,样品充分混匀；,每支移液管及涂布棒只能接触一个稀释度的菌液；,同一稀释度三个以上重复,取平均值；,每个平板上的菌落数目合适，便于准确计数；,涂布平板法和稀释倒平板法,一个菌落可能是多个细胞一起形成，所以在科研中一般用菌落形成单位（colony forming units， CFU）来表示，而不是直接表示为细胞数。,以上介绍了若干测定微生物的生长繁殖数的主要方法，其中，最常用的为测浊度（用分光光度计）、用计数板测总菌数以及用平板菌落计数法测活菌数等方法。,在使用前，一定要根据自己的研究对象和研究目的的不同，选用最合适的方法。,3
23、、测含氮量 根据样品中菌体蛋白质含量计算微生物重量的方法。氮是蛋白质的稳定成分 (蛋白质量=6.25总含N量) 4、测含碳量 5、其他（例如：磷、DNA、RNA等）,1、湿重法 2、称干重 可用离心或过滤后干燥，称重，一般干重为湿重的10 % 20%。,二、测定生物量和生理指标,与生长量相平行的生理指标很多，它们都可用作生长测定中的相对值。,微生物的生理指标，如呼吸强度，耗氧量、酶活性、生物热等与其群体的规模成正相关。 样品中微生物数量多或生长旺盛，这些指标愈明显，因此可以借助特定的仪器如瓦勃氏呼吸仪、微量量热计等设备来测定相应的指标。,常用于对微生物的快速鉴定与检测,第三节 微生物生长与环境
24、,影响微生物生长的外界因素很多,除了营养条件外,还有许多物理条件。如温度、pH、氧气、湿度等。,一、温度,由于微生物的生命活动是由一系列生物化学反应组成的， 而这些反应受温度的影响极为明显。,温度是影响微生物生长的最重要的因素之一。,最低生长温度,最适生长温度,最高生长温度,不同微生物生长的温度范围在-12 100 ，每种微生物生长的温度都存在生长温度三基点。,最适生长温度有时也简称“最适温度”，其意义是某菌分裂代时最短或生长速率最高时的培养温度。 最适生长温度并不等于生长量最高时的培养温度，也不等于发酵速度最高时的培养温度或积累代谢产物量最高时的培养温度。,（一）生长温度三基点,菌 名 生长
25、温度 发酵温度 累积产物温度（ ） （ ） （ ） Streptococcus thermophilus 37 47 37 S. lactis 34 40 产细胞：2530产乳酸：30 Streptomyces griseus 37 28 _ Corenybacterium pekinense 32 3335 _ Clostridium acetobutylicum 37 33 _ Penicilium chrysogenum 30 25 20 以青霉素的生产为例： 培养165 h采用分段控制温度的方法，其青霉素产量比始终在30 培养提高了14.7%。 分段控制方式：05 h，30 ；540
26、h，25 ；40125 h，20 ；125165 h，25 。,不同生理生化过程的最适温度,微生物不同生理活动要求不同温度 最适生长温度 发酵速度快、积累代谢产物多,最低生长温度 是指微生物能进行生长繁殖的最低温度界限。处于这种温度条件下的微生物生长速率很低，如果低于此温度则生长可完全停止。最高生长温度 是指微生物生长繁殖的最高温度界限。在此温度下，微生物细胞易于衰老和死亡。致死温度 若环境温度超过最高温度，便可杀死微生物。这种在一定条件下和一定时间内 ( 例如 10 min) 杀死微生物的最低温度称为致死温度。在致死温度时杀死该种微生物所需的时间称为致死时间。在致死温度以上，温度愈高，致死时
27、间愈短。用加压蒸汽灭菌法进行培养基灭菌，足以杀死全部微生物，包括耐热性最强的芽孢。,根据微生物的最适生长温度的不同，可将微生物划为三个类型：,（二）微生物生长温度类型,低温型微生物（嗜冷微生物）：20 一般为15 。 中温型微生物（嗜温微生物）：2045 ，室温菌约25 ， 体温菌约37 。 高温型微生物（嗜热微生物）：45 ，一般5060 。,1、高温对微生物的影响 高温下蛋白质不可逆变性，膜受热出现小孔，破坏细胞结构（溶菌）。 微生物对热的耐受力与以下因素有关: （1）微生物种类及发育阶段 嗜热菌比其它类型的菌体抗热 有芽孢的细菌比无芽孢的菌抗热 微生物的繁殖结构比营养结构抗热性强 老龄菌
28、比幼龄菌抗热,（三）高温与低温对微生物的影响,（2）微生物对热的耐受力还受环境条件的影响 与培养基的营养成分有关 培养基中蛋白质含量高时比较耐热。 与pH 有关 pH适宜时不易死亡，pH不适宜时，容易死亡。 与水分有关 含水量大时容易死亡，含水量小时不容易死亡。 与含菌量有关 含菌量高，抗热性增强，含菌量低，抗热性差。 与热处理时间有关 热处理时间长，微生物易死 亡。,当环境温度低于微生物的最适生长温度时，微生物的生长繁殖停止，当微生物的原生质结构并未破坏时，不会很快造成死亡并能在较长时间内保持活力，当温度提高时，可以恢复正常的生命活动。低温保藏菌种就是利用这个原理。一些细菌、酵母菌和霉菌的琼
29、脂斜面菌种通常可以长时间地保藏在4的冰箱中。当温度过低，造成微生物细胞冻结时，有的微生物会死亡，有些则并不死亡。,2、低温对微生物的影响,造成死亡的原因： 冻结时细胞水分变成冰晶，冰晶对细胞膜产生机械损伤，膜内物质外漏。 冻结过程造成细胞脱水。冻结速度对冰晶形成有很大影响，缓慢冻结，形成的冰晶大，对细胞损伤大；快速冻结，形成的冰晶小、分布均匀，对细胞的损伤小，因此，利用快速冻结可以对一些菌种进行冻结保藏，一般情况下在菌悬液中再加一些甘油、糖、牛奶、保护剂等可对菌种进行长期保藏。,氧对微生物的生命活动有着极其重要的影响，微生物对氧的需要和耐受力在不同的类群中变化很大，根据微生物与氧的关系,可把它
30、们分为几种类群:专性好氧菌好氧菌微好氧菌兼性厌氧菌耐氧厌氧菌厌氧菌(专性)厌氧菌,二、氧气对微生物生长的影响,五类与氧关系不同的微生物在半固体琼脂柱中的生长状态（模式图）,氧浓度对不同微生物生长的影响,（一）专性好氧菌（strict aerobe） 必须在有分子氧的条件下才能生长，有完整的呼吸链，以分子氧作为最终氢受体，细胞含超氧化物歧化酶和过氧化氢酶。,绝大多数真菌和许多细菌都是专性好氧菌,好氧性微生物，在培养时必须保证通气条件良好。实验室中通常采用震荡培养或摇瓶培养，发酵生产中多采用通入无菌空气和搅拌等方法供氧。,（二）兼性好氧菌（facultative aerobe）在有氧或无氧条件下均
31、能生长，但在有氧情况下生长得更好； 在有氧时靠呼吸产能，无氧时借发酵或无氧呼吸产能； 细胞含超氧化物歧化酶和过氧化氢酶；,许多酵母菌和许多细菌都是兼性厌氧菌,（三）微好氧菌（microaerophilic bacteria）只能在较低的氧分压下才能生长的微生物。也通过呼吸链并以氧为最终氢受体而产能。,例如：霍乱弧菌、一些氢单胞菌属、发酵单胞菌属等,一类可在分子氧存在下进行厌氧生活的厌氧菌，即它们的生长不需要氧，分子氧对它们也无毒害。它们不具有呼吸链，仅依靠专性发酵获得能量。 细胞含超氧化物歧化酶和过氧化物酶，但缺乏过氧化氢酶。,一般的乳酸菌多数是耐氧菌,（四）耐氧厌氧菌（aerotoleran
32、t anaerobe）,（五）厌氧菌（anaerobe） 它有以下几个特点： 分子氧对它们有毒，短期接触也会抑制它们生长甚至致死； 只有在深层的无氧或低氧化还原势的环境下才能生长；,生命活动所需能量是通过发酵、无氧呼吸、循环光合磷酸化或甲烷发酵等提供； 细胞内缺乏超氧化物歧化酶和细胞色素氧化酶；,厌氧菌的氧毒害机制 SOD学说： 厌氧菌因缺乏超氧化物歧化酶（SOD），故易被生物体内极易产生的超氧物阴离子自由基而毒害致死。,产甲烷菌等都属于厌氧菌,厌氧性微生物，在培养时必须隔绝空气，通常采取的措施有：用焦性没食子酸吸收氧气、抽真空、加盖覆物以及密闭容器等，或采用厌氧培养箱、发酵罐等。,各类菌所含
33、对氧解毒酶,专性好氧菌 SOD，过氧化氢酶 兼性厌氧菌 SOD， 过氧化氢酶 专性厌氧菌 二种酶均无 微好氧菌 少量SOD 耐氧菌 SOD， 过氧化物酶,影响膜表面电荷的性质及膜的通透性，进而影响对物质的吸收能力。 改变酶活、酶促反应的速率及代谢途径：如：酵母菌在pH4.55产乙醇，在 pH6.5以上产甘油、酸。 环境pH值还影响培养基中营养物质的离子化程度，从而影响营养物质吸收，或有毒物质的毒性。,三、pH值对微生物生长影响,（一）环境pH值对微生物生长的影响,微生物的生长pH值范围极广，从pH10都有微生物能生长。但是绝大多数种类都生活在pH5.09.0之间。 微生物生长的pH值三基点：各
34、种微生物都有其生长的最低、最适和最高pH值。低于最低、或超过最高生长pH值时，微生物生长受抑制或导致死亡。,（二) 不同微生物对pH要求不同,不同的微生物最适生长的pH值不同，根据微生物生长的最适pH值，将微生物分为：,嗜碱微生物：硝化细菌、尿素分解菌、多数放线菌 耐碱微生物：许多链霉菌 中性微生物：绝大多数细菌，一部分真菌 耐酸微生物：乳酸杆菌、醋酸杆菌 嗜酸微生物：硫杆菌属,同一种微生物在不同的生长阶段和不同生理生化过程中，对环境pH值要求不同。 例如：丙酮丁醇梭菌在pH值=5.57.0时，以菌体生长为主在pH值=4.35.3时，进行丙酮丁醇发酵 同一种微生物由于环境pH值不同，可能积累不
35、同的代谢产物。 例如：黑曲霉 pH值=23时，产物以柠檬酸为主，只产少量草酸。 pH值在7左右时，产物以草酸为主，只产少量柠檬酸。,几种抗生素产生菌的生长与发酵的最适pH微生物 生长最适pH 合成抗生素最适pH灰色链霉菌 6.36.9 6.77.3红霉素链霉菌 6.67.0 6.87.3产黄青霉 6.57.2 6.26.8金霉素链霉菌 6.16.6 5.96.3龟裂链霉菌 6.06.6 5.86.1灰黄青霉 6.47.0 6.26.5,（三）微生物细胞内的pH值,虽然微生物生活的环境pH值范围较宽，但是其细胞内的pH值却相当稳定，一般都接近中性。这种维持细胞内稳定中性pH值的特性能够保持细胞内
36、各种生物活性分子的结构稳定和细胞内酶所需要的最适pH值。 微生物胞内酶的最适pH值一般为中性，胞外酶的最适pH值接近环境pH值。,（四）微生物的生命活动对环境pH值的影响,微生物在生长过程中也会使外界环境的pH值发生改变，原因： 由于有机物分解： 分解糖类、脂肪等，产生酸性物质，使培养液pH值下降； 分解蛋白质、尿素等，产生碱性物质，使培养液pH值上升 由于无机盐选择性吸收： 铵盐吸收（(NH4)2SO4 H2SO4）， pH 硝酸盐吸收(NaNO3 NaOH)， pH,培养过程中调节pH值的措施过酸时：加入碱或适量氮源，提高通气量。 过碱时：加入酸或适量碳源，降低通气量。,NH4+被吸收,N
37、O3-被吸收,配制培养基时调整pH值的措施,第四节 微生物对环境的适应性与抗性,微生物在适宜的环境条件下可正常生长与繁殖，而另一方面，微生物在与其所处环境的复杂的相互作用过程中，通过基因突变与环境对突变的选择，以及在其他各种水平上的适应，表现出与原先难于甚至不能生存的环境“和谐相处”或避害趋利的生物性能。,一、微生物的趋向性,微生物对环境变化可作出多种适应性反应。如趋向运动 (tactic movements) 就是其中一种。 当环境中存在某种有利于微生物生长的因子时，它们可以向着这种因子源的方向运动，称为正趋向性。 当环境中存在某种不利于微生物生长的因子时，微生物可以背向运动避开这种因子源，
38、称为负趋向性。,根据引起微生物趋向性诱发因子的不同，趋向性可以分为趋化性、趋光性、趋磁性与趋电性等多种类型。,微生物的趋氧（左）与避氧（右）性生长现象,趋化性 (chemotaxis)：不同种类的化学物质或不同浓度的化学物质溶液对微生物所产生的向性或背向性运动。,细菌细胞表面存在着感受不同浓度梯度的化学物刺激作用的受体，当环境中存在着不同浓度的化学物质时，相应的受体产生相应的感受反应，反应能力的大小依赖于细菌表面受体的数量及受体对化学物质的亲和力，受体多、亲和力强，反应能力也强，反之则弱。,受体有一定的专一性，但专一性不强。不同菌体对同一化合物的趋向性不一样，同一菌体对不同化合物的趋向性也不同
39、。 例如：大肠杆菌对麦芽糖有趋向性而对乳糖却无趋向性，对丝氨酸有很强的趋向性，而对丝氨酸的分解代谢产物丙酮酸则无趋向性。,光合细菌表现出明显的趋光性 (phototaxis) 。光合细菌在一个有光照的培养液中培养，当它偶而离开光照区时，菌体会停住并改变运动方向回到具有光线的区域。光合细菌对光的反应不是光的绝对量，而是光的强度差别，趋光细菌可以区别两个强度仅差 5 的光源。光合细菌耶那硫螺菌 ( Thiospirillum jenese ) 由于趋光而集中生长在细菌叶绿素 a 的吸收波长区域内。,抗逆性（ stress resistance）是指微生物对其生存生长不利的各种环境因素的抵抗和忍耐能
40、力的总称。,二、微生物的抗逆性,微生物的抗逆主要通过自身的生理与遗传适应机制来实现。微生物中的抗性，研究较多的主要是与人类实践关系密切的抗性，如抗药性、抗热性、耐高渗透压、耐酸、耐重金属离子等。,对以抗生素为主的药物的抗性简称为抗药性。 当某种 抗生素 长期作用于一些敏感（病原）微生物时，微生物通过遗传适应，对特定 抗生素 表现出抗药性。,（一）抗药性,微生物产生抗药性有以下几种具体方式：,1 抗性细胞产生酶，使药物失去活性 例如抗青霉素菌株和抗头孢霉素菌株能产生 内酰胺酶，使这两种抗生素结构中的内酰胺键开裂而失去活性。,2 修饰和改变药物作用靶位 例如链霉素是通过结合到菌体核蛋白体的 30
41、亚基上，改变其构型，干扰蛋白质合成，而达到抗菌效果。对链霉素产生抗性的菌株，单个染色体突变，导致 30S 核蛋白体亚单位的 P 10 蛋白质组分的改变，链霉素不能与改变了的 30 亚单位结合。这种失去核蛋白体上与链霉素结合的敏感位点的菌株，成为高度抗性菌株。,3 改变细胞对药剂的渗透性与增强外排作用。此种作用有几种情况： 细胞可以通过代谢作用把药剂转换成一个衍生物，此衍生物外排的速度比原药剂渗入细胞的速度快。 细胞可分泌酶，将药剂转变成不能进入细胞的形式。例如委内瑞拉链霉菌（ S. venezuelae ）由于改变膜透性，阻止四环素进入细胞并使四环素排出细胞，从而对四环素产生抗性。 4 形成救
42、护途径 当某一药物封闭了某终产物合成途径中的一个步骤，而影响了该产物的供应量时，可通过形成另一个途径产生该产物，从而获得抗药性。这类途径通常称为救护途径 (salvage pathway) 。例如，在腺嘌呤核苷酸合成途径中，吖 ( 氮杂 ) 丝氨酸和重氮氧代正亮氨酸，抑制甲酰甘氨酰胺核糖 -5- 磷酸的酰胺化作用。这样细胞可以通过救护途径来获得腺嘌呤核苷酸，而不再需要甲酰甘氨酰胺核糖 -5- 磷酸，微生物就不再受上两药物的抑制。,“超级细菌”更为科学的称谓应该是“产NDM-1耐药细菌”，即携带有NDM-1基因，能够编码型新德里金属-内酰胺酶，对绝大多数抗生素（替加环素、多粘菌素除外）不再敏感的
43、细菌。临床上多为使用碳青霉烯类抗生素治疗无效的大肠埃希菌和肺炎克雷伯菌等革兰氏阴性菌造成的感染。“超级细菌”泛指临床上出现的多重耐药菌，如耐甲氧西林金黄色葡萄球菌（MRSA）、抗万古霉素肠球菌（VRE）、耐多药肺炎链球菌 （MDRSP）、多重抗药性结核杆菌 （MDR-TB），以及碳青霉烯酶肺炎克雷伯菌（KPC）等。此次发现的“产NDM-1耐药细菌”与传统 “超级细菌”相比，其耐药性已经不再是仅仅针对数种抗生素具有“多重耐药性”，而是对绝大多数抗生素均不敏感，这被称为 “泛耐药性”（pan- drug resistance，PDR）。,“超级细菌”,基因突变是产生此类细菌的根本原因，抗生素的滥用
44、对微生物进行了定向选择，导致了超级细菌的盛行。,中国是世界上滥用抗生素最严重的国家之一。由于滥用抗生素，在中国，细菌整体的耐药率要远远高于欧美国家；中国每年生产抗生素原料约21万吨，人均年消费量是美国人的10倍。然而，真正需要使用抗生素的病人人数不到20%，80%以上属于滥用抗生素。一些专家甚至认为，一旦 真正意义上的“超级细菌”爆 发，中国将有可能成为“超级 细菌”的重灾区。,（二）微生物对高温的抗性,在温泉、堆肥以及锅炉排水处等高温环境中，也生长有微生物。按照它们所生长的最高温度又可以将其分为两种类型：生长的最高温度在 75 以上的嗜高温菌 ( 也称高度好热菌 ) ，和生长最高温在 55
45、75 之间的嗜亚高温菌 ( 也称中度嗜热菌 ) 。后一类菌中又可分为在 37 以下环境中不能生长的专性嗜亚高温菌及在 37 以下也能生长的兼性嗜亚高温菌。,嗜高温菌与中温菌的酶在进化上具有同源性，较高的热稳定性与维持其内部的氢键、二硫键等化学键的存在与数量有关。一般是这些键的存在与数量增加，酶的热稳定性也增加。,耐热机制：,嗜高温菌核酸中的 G+C mol% 比中温菌的高，因此使核酸熔点 (Tm) 较高， DNA 的热稳定性也提高。此外，在嗜高温菌的 tRNA 碱基分子里加入硫原子，提高 了tRNA 几个环之间的结合能力，从而提高 tRNA 的热稳定性。,嗜高温菌的细胞膜中的脂肪酸成分以长链饱
46、和脂肪酸含量高，并且主要是一些分支的长链。,高温菌对高温的适应与抵抗，还与一些保护因子的作用相关。保护因子有一些金属离子 (Mg2+ , Ca2+ 等 ) 和一些低分子物质如多胺等。胞内的钙离子可以提高嗜高温菌蛋白酶、淀粉酶的热稳定性，提高镁离子浓度也可以提高高温菌 tRNA 的解链温度。多胺类物质可以提高菌体合成蛋白质与核酸的能力，提高核酸的稳定性，并对某些酶有激活作用。,（三）微生物对极端 pH 值的抗性,一般微生物在 pH 中性左右的范围内生长时，如环境 pH 稍有变化，微生物可以通过自身代谢调节维持细胞内 pH 的相对稳定。如合成一定的氨基酸脱羧酶或氨基酸脱氨酶，催化部分氨基酸分解生成
47、有机胺或有机酸，对环境起到一定的缓冲作用，以免 pH 的剧烈变化。在极端 pH 条件下（ pH 9.0 ）一般微生物的生长受到抑制甚或死亡。而有些耐酸细菌或耐碱细菌仍能继续生长。,（四）微生物对重金属离子毒害的抗性,通过改变细胞膜透性，阻止金属离子进入细胞,产生某种螯合剂，抵抗金属离子的毒害,通过酶促反应，使有毒物质转变成无毒化合物。,例如，在酸性矿泉水里生长的真菌，在 pH 为 2 3 时，即使 CuSO4 的浓度达到 l molL ，也不能进入细胞。,例如，砷、锑等金属，可以在细胞内或细胞外，与微生物产生的螯合剂形成复合物，避免这些金属使酶失活或不被微生物细胞吸收。,例如， HgCl 2
48、是和细胞酶蛋白中的巯基结合，使酶失活。一些微生物可以由甲基钴胺素作辅酶及提供甲基，使 HgCl 2 转变成甲基汞或二甲基汞，不再与巯基结合，避免了其毒害作用，甲基汞可被假单胞菌、金黄色葡萄球菌及肠道细菌还原成金属汞。,第五节 有害微生物的控制,在周围环境中，到处都有各种各样的微生物存在着， 其中是对人类有害的微生物， 我们应采取有效的措施来抑制或消灭它们。,物理方法包括高温、干燥、辐射、过滤等； 化学方法包括消毒剂、防腐剂和化学治疗剂。,灭菌（sterilization） 采用强烈的理化因素使任何物体内外部的一切微生物永远丧失其生长繁殖能力的措施，称为灭菌。 灭菌还可分杀菌（菌体虽死、形体尚存）、溶菌（菌体被杀死后，细胞自溶、裂解消失）。 消毒（disinfection） 采用较温和的理化因素，仅杀死物体表面或内部的一部分对人体有害的病原菌，而对被处理物体基本无害的措施，称为消毒。 防腐（antisepsis） 利用理化因素完全抑制霉腐微生物的生长繁殖，从而达到防止物品发生霉腐的措施，称为防腐。 化疗（chemotheraphy） 即化学治疗。利用具有高度选择毒力的化学物质抑制宿主体内病原微生物的生长繁殖，以达到治疗该传染病的一种措施。,
