1、100薄荷不同溶剂提取物抗氧化活性的研究陈智坤 ， 梁呈元 ， 李维林*， 任冰如 ， 马 丽( 江苏省中国科学院植物研究所 ， 江苏南京 210014)摘 要 : 采用 1， 1二苯基 2三硝基苯肼 ( DPPH) 、2， 2联氮基双 ( 3乙基苯并噻唑啉 6磺酸 ) 二铵盐 ( ABTS) 、Fe+还原法 ( FRAP) 三种抗氧化模型对薄荷的水 、甲醇 、70% 乙醇 、正丁醇 、乙酸乙酯五种提取物进行抗氧化活性评价 ， 同时分析抗氧化活性与总酚和总黄酮含量的关系 。结果表明 ， 薄荷不同提取物均表现出良好的抗氧化活性 ， 其抗氧化活性与多酚含量呈极显著相关 ， 与黄酮含量相关性较小 。
2、其中 ， 水提物对 DPPH 自由基清除率最高 ， EC50值为( 0.53 0.04) mg/mL; 甲醇提取物对 ABTS 自由基清除率最高 ， EC50值为 ( 1.57 0.03) mg/mL; 乙酸乙酯提取物的FRAP 值最高为 ( 4.73 0.03) mmol/g; 水提物中总酚含量最高为 ( 58.81 3.10) mg/g， 甲醇提取物中总黄酮含量较高为 ( 162.95 1.91) mg/g。关键词 : 薄荷 ， 抗氧化活性 ， 多酚 ， 黄酮Study on the antioxidant activityof different extracts from Mentha
3、 canadensis L.CHEN Zhikun， LIANG Chengyuan， LI Weilin*， REN Bingru， MA Li( Institute of Botany， Jiangsu Province and Chinese Academy of Sciences， Nanjing 210014， China)Abstract: Five different extracts of Mentha canadensis L.through water， ethanol， 70% ethanol， butanol and ethylacetate were evaluate
4、d by tree models of antioxidant activity: 1， 1diphenyl2picrylhydrazyl( DPPH) ， 2， 2azinobis( 3ethylbenzthiazolne6sulfonic acid( ABTS) and ferric reducing antioxidant potential assay( FRAP) .Therelationship between the antioxidant activity and the content of total phenolics and total flavonoids was a
5、nalysed.The results showed that all the extracts had great antioxidant activity and the content of total phenolics had a highlysignificant correlation with the activity， however， low correlation with the content of total flavonoids.The water extractshowed that the highest radical scavenging rate on
6、DPPH and the EC50was( 0.53 0.04) mg/mL.The methanolextract showed the highest radical scavenging rate on ABTS and the EC50was( 1.57 0.03) mg/mL.The ethylacetate extract showed the highest value of FRAP and EC50was( 4.73 0.03) mmol/g.The highest content of totalphenolics and total flavonoids came fro
7、m water extract and methanol extract and the content of them were( 58.81 3.10) ，( 162.95 1.91) mg/g， respectively.Key words: mint( Mentha canadensis L.) ; antioxidant activity; polyphenol; flavonoids中图分类号 : TS255.1 文献标识码 : A 文 章 编 号 : 10020306( 2013) 03010004收稿日期 : 20120807 * 通讯联系人作者简介 : 陈智坤 ( 1987)
8、 ， 硕士研究生 ， 研究方向 : 天然产物资源与开发 。基金项目 : “十二五 ”国家科技支撑计划项目 ( 2011BAI04B06) ; 江苏省农业科技创新基金项目 ( CX( 11) 1021) 。薄荷 ( Mentha canadensis L.) 为唇形科薄荷属植物 ， 主要分布在中国 、日本 、韩国 、俄罗斯及北美等地区 1， 作为重要的药食两用植物 ， 其被广泛应用于医药 、食品 、化妆品 、香料 、烟草等工业 。我国约有两千年的薄荷药食历史 ， 具有散风热清头目 、利咽喉 、透疹 、解郁等功效 ， 主治风热表证 ， 头痛目赤 ， 咽喉肿痛 ， 麻疹不透 ， 隐疹瘙痒 ， 肝郁胁
9、痛 2。研究表明薄荷属植物主要含有挥发油 、黄酮 、多酚 、萜类 、氨基酸等成分 ， 具有抗氧化 、抗菌 、抗癌 、抗糖尿病等作用 3。现代研究表明 ， 抗氧化剂具有延缓人体衰老 ， 降低多种疾病产生 ， 增强人体免疫能力等多种功能 。因此 ，研究开发广谱 、高效 、安全的天然抗氧化剂已成为当今研究的热点之一 47。目前 ， 薄荷属植物抗氧化活性研究已有相关报道 ， 研究结果显示该属植物表现出良好的抗氧化能力 811。本文采用 DPPH、ABTS、FRAP 三种模型对薄荷的水 、甲醇 、70% 乙醇 、正丁醇 、乙酸乙酯五种提取物进行抗氧化体外活性研究 ，并测定其总酚和总黄酮含量 ， 进行相关
10、性分析 ， 为进一步研究薄荷的抗氧活性及资源开发利用提供依据 。1 材料与方法1.1 材料与仪器薄荷 采自南京中山植物园薄荷资源苗圃 ， 经梁呈元研究员鉴定为薄荷 ( M.canadensis L.) ， 在恒温鼓风干燥箱内 105 杀青 15min， 60 干燥 3h， 粉碎过 60 目筛备用 ; DPPH、ABTS Sigma 公司 ; FRAP试剂盒 碧云天生物技术研究所 ; 没食子酸标准品101国药集团化学试剂有限公司 ; 芦丁对照品 中国药品生物制品检定所 ， 批号 : 100080200306; 其他试剂均为分析纯 。Infinite M200 型酶标仪 TECAN 公司 ; R型
11、旋转蒸发仪 BUCHI 公司 ; EL204 型电子天平Mettler Toledo 公司 ; KQ300DE 型超声仪 昆山超声仪器有限公司 。1.2 实验方法1.2.1 提取方法 薄荷干药材 25g， 料液比 120， 超声功率 100W， 50、30min 下分别用水 、甲醇 、70% 乙醇 、正丁醇 、乙酸乙酯超声提取两次 ， 趁热抽滤并浓缩得到黑色浸膏 ， 置 60 恒温烘箱干燥 24h 至重量不发生改变 ， 得到黑色固体质量分别为 4.2、3.8、3.4、0.7、0.8g。1.2.2 抗氧化活性的测定1.2.2.1 清除 DPPH 自由基实验 取不同提取物 ，DMSO 溶解 ， 配
12、制成 10mg/L 母液 。DPPH 用无水乙醇配制成 0.16mmol/L， 置于棕色瓶中备用 。在 96 孔板中 ， 每孔分别入 20L 不同浓度的样品溶液 ， 80L超纯水和 100L 的 0.16mmol/L DPPH， 反应体系200L。加样后室温避光振荡 15min， 将 96 孔板放入酶标仪中在 517nm 波长处检测样品的吸光度 ( Ai) ;取 20mL DMSO 代替样品溶液测得空白吸光度 ( A0) ;以 100L 无水乙醇代替 DPPH 溶液测得样品本底吸光度 ( Aj) ; 每个浓度做 4 个平行 ， 取其平均值 。以 VC做阳 性 对 照 ， 按 式 ( 1) 计
13、算 清 除 率 ， 并 计 算 出EC50值 12。清除率 ( %) =A0( AiAj)A0100 式 ( 1)1.2.2.2 清除 ABTS 自由基实验 ABTS 混合液的制备 : 将 7mmol/L ABTS 水溶液与 2.45mmol/L 过硫酸钾水溶液 ( 终浓度 ) 混合 ， 将混合液在室温避光条件下放置 1216h， 形成 ABTS 储备液 。将此工作液与乙醇按照约 120( v/v) 的比例混合在 734nm 下调吸光度为 0.700 0.02 即得 ， 于 30下预热备用 。在 96孔板中 ， 每孔分别入 10L 不同浓度的样品溶液 ，190L ABTS 混合液 ， 反应体系
14、 200L。反应 10s， 静置 10min， 将 96 孔板放入酶标仪中在 734nm 波长处检测样品的吸光度 ( Ai) ; 取 10L DMSO 代替样品溶液测得空白吸光度 ( A0) ; 以 190L 无水乙醇代替ABTS 混合液测得样品本底吸光度 ( Aj) ; 每个浓度做4 个平行 ， 取其平均值 。以 VC做阳性对照 ， 按式 ( 1)计算清除率 ， 并计算出 EC50值 13。1.2.2.3 FRAP 法抗氧化实验 按说明书 ， 称取27.8mg FeSO47H2O， 用去离子水溶解 、定容至 1mL，即浓度为 100mmol/L。取适量 FeSO4溶液稀释至0.15、0.3、
15、0.6、0.9、1.2、1.5mmol/L。在 96 孔板中 ， 每孔分别入 180L 现配的 FRAP 工作液 ， 加入 5L 去离子水做空白对照 ， 5L 各种浓度的 FeSO4标准溶液 ， 反应体系为 185L， 在 37 下反应 35min， 在593nm 下测定吸光度 ， 每个检测做 4 个重复 ， 取其平均值 ， 以 Trolox 为阳性对照 。最后根据 FRAP 标准曲线求得各样品的抗氧化能力 。1.2.3 含量测定1.2.3.1 总黄酮含量测定 准确称取 120干燥至恒重的芦丁标准品 20mg， 置于 100mL 容量瓶中 ， 用60%乙醇溶解并定容得到浓度为 0.2mg/mL
16、 的芦丁标准溶液 。准确移取 0、10、20、30、40、50、60L 芦丁标准溶液于 96 孔平板中 ， 每孔先分别用 60% 乙醇补齐至 104L， 再依次加入 8L 5% NaNO2溶液 ， 摇匀 ，静置 6min; 加入 8L 10% Al( NO3)3溶液 ， 摇匀 ， 静置 6min; 再加入 80L 的 1mol/L NaOH 溶液 ， 摇匀 ，静置 15min; 将 96 孔平板放入酶标仪中在 510nm 波长处测吸光值 ， 每个检测做 4 个重复 ， 取其平均值 。最后根据芦丁标准曲线求得各样品的总黄酮含量 。1.2.3.2 总酚含量的测定 精密称取 15mg 没食子酸置于
17、10mL 容量瓶中 ， 用蒸馏水溶解后定容至刻度 ，摇匀 ， 配制成 1.5mg/mL 的标准品溶液 ， 转移至棕色瓶中以备用 ; 配制 100mg/mL Na2CO3溶液 。在 96 孔板中依次加入没食子酸标准品溶液 0、1、2、4、6、8L，用蒸馏水将每个加样孔补至 50L， 然后分别加入50L FolinCiocalteu 试剂 ， 振荡 3min 后加入 50L100mg/mL Na2CO3溶液充分混匀 ， 在室温下放置 5h后 ， 将 96 孔板放入酶标仪中在 760nm 波长处测定各样品的吸光值 ， 每个检测做 4 个重复 ， 取其平均值 。最后根据没食子酸标准曲线求得各样品的总酚
18、含量 。1.3 数据处理实验采用 SPSS17.0 软件进行统计分析 ， 进行单因素方差分析 ( ANOVA 法 ) 和双变量相关性分析 ， 同时进行 LSD 两两比较 ， 以 p 0.05 为差异显著 ， 所有数据均以平均数 标准差 ( 珋x s) 表示 。2 结果与分析2.1 对 DPPH 自由基的清除作用由图 1 和表 1 可见 ， 薄荷五种不同提取物均对 DPPH自由基表现良好的清除能力 ， 在 0.31255mg/mL范围内 ， 抗氧化活性随浓度升高而升高 ， 在水提物浓度为 5mg/mL 时抑制率达到最大为 88.68%，DPPH 自由基清除能力大小顺序为 : 水 正丁醇 乙酸乙酯
19、 甲醇 70%乙醇 。图 1 薄荷不同提取物对 DPPH 自由基清除率 ( %)Fig.1 Percentage of free radical scavenging activityof different extracts from Mentha canadensis L.by DPPH radicals in vitro assay2.2 对 ABTS 自由基的清除作用由图 2、表 2 可见 ， 薄荷五种不同提取部位对ABTS 自由基均具有一定的清除能力 ， 但相对清除102表 1 薄荷不同提取物对 DPPH 自由基清除的 EC50值 ( p 0.05)Table 1 The EC50o
20、f different extracts from Mentha canadensis L.by DPPH radicals in vitro assay( p 0.05)样品 水提取物 甲醇提取物 70%乙醇提取物 正丁醇提取物 乙酸乙酯提取物VCEC50( mg/mL)0.53 0.04d1.17 0.02b7.66 0.14a0.81 0.10c0.88 0.02c0.18 0.02注 : 同行中不同小写字母表示差异显著 ， 表 2表 5 同 。表 2 薄荷不同提取物对 ABTS 自由基的清除的 EC50值 ( p 0.05)Table 2 The EC50of different ex
21、tracts from Mentha canadensis L.by DPPH radicals in vitro assay( p 0.05)样品 水提取物 甲醇提取物 70%乙醇提取物 正丁醇提取物 乙酸乙酯提取物VCEC50( mg/mL)2.15 0.08d1.57 0.03e9.47 0.32a4.93 0.25b2.86 0.25c0.0072 0.0013表 3 薄荷不同提取部位 FARP 值 ( p 0.01)Table 3 The FARP value of different extracts from Mentha canadensis L.by FARP in vitr
22、o assay( p 0.01)样品 水提取物 甲醇提取物 70%乙醇提取物 正丁醇提取物 乙酸乙酯提取物 TroloxFARP 值 ( mmol/g) 3.85 0.14c2.38 0.24d0.80 0.11e4.45 0.09b4.73 0.13a5.00 0.15表 4 薄荷不同提取物中多酚含量 ( p 0.05)Table 4 Total phenolic content in different extracts from Mentha canadensis L.( p 0.05)样品 水提取物 甲醇提取物 70%乙醇提取物 正丁醇提取物 乙酸乙酯提取物总酚含量 ( mg/g) 5
23、8.81 3.10a25.32 0.22c9.94 0.50d33.73 1.87b37.19 0.55b表 5 薄荷不同提取部位中总黄酮含量 ( p 0.01)Table 5 Total flavonoids content in different extracts from Mentha canadensis L.( p 0.01)样品 水提取物 甲醇提取物 70%乙醇提取物 正丁醇提取物 乙酸乙酯提取物总黄酮含量 ( mg/g) 0.69 0.04e162.95 1.91a117.99 1.05b41.13 0.61d78.83 2.45cDPPH 自由基能力较弱 ， 且清除率随浓度的
24、升高和升高 ， 其中甲醇在 10mg/mL 时对 ABTS 自由基清除率达到 95.44%， 提取物对 ABTS 自由基的清除顺序为 :甲醇 水 乙酸乙酯 正丁醇 70%乙醇 。图 2 薄荷不同提取物对 ABTS 自由基清除率Fig.2 Percentage of free radical scavenging activityof different extracts from Mentha canadensis L.by ABTS radicals in vitro assay2.3 FRAP 法测定抗氧化能力样品的抗氧化活性由 FARP 标准曲线为 : Y =0.0286X +0.068
25、6( R2= 0.9907) 换算得来 ， 各提取部位的抗氧化活性如表 3 所示 。由表 3 可见 ， 通过 FARP 法测定薄荷五种不同提取部位总抗氧化能力顺序为 : 乙酸乙酯 正丁醇 水 甲醇 70%乙醇 。2.4 总酚的含量测定样品中的多酚含量由没食子酸标准曲线 : Y =46.9X0.0283( R2=0.9922) 换算得来 ， 各提取部位的多酚含量如表 4 所示 。由表 4 可见 ， 五种提取方法中 ， 总酚含量顺序为 ， 水 乙酸乙酯 正丁醇 甲醇 70% 乙醇 ， 其中水提取物中多酚含量最高 ， 这与大多数多酚属大极性化合物 ， 易溶于大极性溶剂有关 。2.5 总黄酮的含量测定
26、样品中的总黄酮含量由没食子酸标准曲线 : Y =5.834X +0.0416( R2= 0.9992) 换算得来 ， 各提取部位的总黄酮含量如表 5 所示 。由表 5 可见 ， 甲醇提取物中黄酮类化合物含量最高 ， 乙酸乙酯提取物中黄酮含量较多 ， 水提取物中黄酮含量较少 ， 这与薄荷中可能含有中等极性黄酮类成分较多有关 。2.6 抗氧化活性间相关性分析在数据处理时 ， 因在一定范围内 ， EC50越小代表抗氧化能力越强 ， 因此对于计算有关 EC50相关性存在负号 ( ) 现象 ， 应作正相关处理 。由表 6 可见薄荷提取物对 DPPH、ABTS、FRAP 抗氧化活性基本一致 ， 但略有差别
27、 ， 这可能与各抗氧化模型作用机理不同有关 。表 6 薄荷抗氧化活性间相关系数 ( r)Table 6 Correlation coefficient( r)of tree models of antioxidant activity抗氧化能力相关系数 ( r)DPPH ABTS FRAPDPPH( EC50值 ) 1ABTS( EC50值 ) 0.9071FRAP 值 0.8530.613*1注 : * 表示在 0.05 水平上显著相关 ， 表示在 0.01 水平上显著相关 ; 表 7 同 。2.7 多酚 、黄酮含量与抗氧化活性相关性分析现代研究表明抗氧化活性与植物体中多酚和黄酮含量有密切的
28、关系 14， 因此对不同提取部位的多酚和黄酮含量进行测定 ， 并进行相关性分析 ， 通过统计学分析寻找薄荷产生抗氧化活性的主要原因 。由表 7 可见 ， 薄荷各提取物对 DPPH 自由基 、103ABTS 自由基 、FARP 的抗氧化活性与多酚含量均显示出极显著正相关性 ， 即在一定范围内多酚含量越高 ， 对三种抗氧化模型的活性越强 ; 而提取物对 DPPH 和ABTS 的抗氧化活性与黄酮含量显示相关性不高 ，FARP 的抗氧化活性与黄酮含量则显示显著正相关 。表 7 薄荷抗氧化活性与其多酚 、总黄酮含量的相关系数 ( r)Table 7 The relationship between th
29、e antioxidant activityand the content of total phenolics and total flavonoids抗氧化能力相关系数 ( r)多酚含量 总黄酮含量DPPH( EC50)0.7660.400ABTS( EC50)0.6940.144FRAP 值 0.7300.628*3 结论薄荷表现出对 DPPH 自由基 、ABTS 自由基 、FRAP 良好的抗氧化能力 ， 且相关性基本一致 ， 其活性部位主要集中在大极性化合物上 。其中水和甲醇提取部位抗氧化能力相对较高 ， 正丁醇和乙酸乙酯次之 ， 70% 乙醇相对较弱 。经抗氧化活性与多酚和黄酮含量相
30、关性数据分析显示 ， 薄荷抗氧化活性与多酚含量有密切关系 ， 与黄酮含量相关性较小 ， 这一结果与 Tupe 9， 1518等研究薄荷属植物抗氧化结果基本一致 。薄荷属植物作为重要的芳香植物 ， 目前 ， 研究其挥发性成分相对较多 ， 本实验对薄荷的非挥发性提取部位的抗氧化活性研究 ， 将为进一步研究其活性成分奠定基石 ， 为寻找其抗氧化活性机理提供依据 ， 为未来薄荷属植物的资源开发提供依据 。参考文献 1 中国科学院中国植物志英文版编委会 .中国植物志英文版 M .北京 : 科学出版社 ， 1994: 236239. 2 国家中医药管理局 中华本草 编委会 .中华本草 M .上海 : 上海
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