1、高效液相色谱知识收藏Agilent1100 高压液相色谱仪基本操作步骤 Agilent1100 液相基本操作步骤Agilent1100 高压液相色谱仪维护保养知识保养事项：高压液相色谱 HPLC 常见故障及排除方法液相色谱柱使用及保养高压液相色谱 HPLC 培训教程(一)高压液相色谱 HPLC 培训教程(七)高效液相色谱仪中反相 HPLC 柱子的清洁和再生HPLC 对流动相的基本要求高效液相色谱Waters 600E-2487 HPLC 系统 SOPWaters 高效液相色谱系统操作规程高效液相色谱仪(Agilent 1100) 操作注意事项色谱扫盲班 Agilent1100 高压液相色谱仪基
2、本操作步骤 Agilent1100 液相基本操作步骤(一)、开机：1、打开计算机,进入 Windows NT （或 Windows 2000）画面,并运行 Bootp Server 程序。2、打开 1100 LC 各模块电源。3、待各模块自检完成后，双击 Instrument 1 Online 图标，化学工作站自动与 1100LC 通讯，进入的工作站画面。24、从“View”菜单中选择“Method and Run control”画面, 单击”View”菜单中的“Show Top Toolbar”，“Show status toolbar”，“System diagram”,”Samplin
3、g diagram”，使其命令前有“”标志，来调用所需的界面。5、把流动相放入溶剂瓶中。6、打开 Purge 阀。7、单击 Pump 图标，出现参数设定菜单，单击 Setup pump 选项，进入泵编辑画面。8 、设 Flow：5ml/min，单击 OK。9、单击 Pump 图标，出现参数设定菜单，单击 Pump control 选项，选中 On，单击 OK，则系统开始 Purge，直到管线内（由溶剂瓶到泵入口）无气泡为止,切换通道继续 Purge，直到所有要用通道无气泡为止。10、单击 Pump 图标，出现参数设定菜单，单击 Pump Control 选项，选中 Off，单击 Ok 关泵，
4、关闭 Purge valve。11、单击 Pump 图标，出现参数设定菜单，单击 Setup pump 选项，进入 Pump 编辑画面，设 Flow：1.0ml/min。12、单击泵下面的瓶图标，输入溶剂的实际体积和瓶体积。也可输入停泵的体积。单击 Ok。（二）数据采集方法编辑：1、开始编辑完整方法：3从“Method”菜单中选择“Edit entire method” 项，如上图所示选中除“Data analysis ”外的三项，单击 Ok，进入下一画面。2、方法信息：在“Method Comments”中加入方法的信息（如：方法的用途等）。单击 Ok 进入下一画面。3、泵参数设定：（以二元
5、泵为例）在“Flow”处输入流量,如 1ml/min，在“Solvent B”处输入 70.0,(A=100-B) ,也可 Insert 一行”Timetable” ,编辑梯度。在“Pressure Limits Max”处输入柱子的最大耐高压，以保护柱子。 单击 Ok 进入下一画面。4、自动进样器参数设定:选择合适的进样方式, 进样体积 1.0ul ,洗瓶位置为 6 号。“Standard Injection”-只能输入进样体积，此方式无洗针功能。“Injection with Needle Wash”-可以输入进样体积和洗瓶位置，此方式针从样品瓶抽完样品后，会在洗瓶中洗针。“Use inj
6、ector program”-可以点击 Edit 键进行进样程序编辑。点击 Ok 进入下一画面。5、柱温箱参数设定:4在”Temperature”下面的方框内输入所需温度,并选中它,点击”more” 键,如图所示,选中”Same as left”-使柱温箱的温度左右一致。点击 ok 进入下一画面。6、VWD 检测器参数设定:在”Wavelength”下方的空白处输入所需的检测波长,如254nm, 在”Peak width (Response time)”下方点击下拉式三角框,选择合适的响应时间, 如0.1min (2s)。在 Timetable 中可以“Insert”一行，输入随时间切换的波长
7、，如 1min ，波长=300nm。点击 ok 进入下一画面。7、DAD 检测器参数设定:检测波长: 254nm,BW=30nm, 参比波长=350nm,BW=100nm; 检测波长：一般选择最大吸收处的波长。样品带宽 BW： 一般选择最大吸收值一半处的整个宽度。参比波长：一般选择在靠近样品信号的无吸收或低吸收区域。参比带宽 BW：至少要与样品信号的带宽相等，许多情况下用 100nm 作为缺省值。Peak width（Response time）：其值尽可能接近要测的窄峰峰宽。Slit狭缝窄，光谱分辨率高；宽时，噪音低。同时可以输入采集光谱方式，步长，范围，阈值。选中所用的灯。点击 Ok 进入
8、下一画面。8、RID 检测器参数设定:色谱条件: 5进样体积: 20ul 。 光学单元温度: Off 。 极性: 正 。 峰宽(响应时间) : 4s 。“Optical Unit Temperature”-若环境温度控制在2,设定为 Off, 若环境温度不稳定,则设定光学单元温度为高于环境温度 5 度,以防样品在池中沉淀。“Peak width”-大多数分析设为 4S，只有在高速分析下设为更短。“Automatic recycling after analysis”-在不进行分析时可以让流动相循环，节省流动相，检测器连续运行，可随时投入使用。点击 RID 图标，选择 RID Control ：
9、Heater 设为 On，若要循环流动相，必须将“Recycling Valve”设为 ON。手动 purge 参比池，将其设为 On，并输入 Purge 时间。 9、FLD 检测器参数设定:色谱条件： 样品：P/N 01018-68704 用甲醇稀释为 1:10。 进样体积：5ul。 柱温箱: 30 。 EX=246nm, EM=317nm ,PMT=10。 响应时间=4s. 停止时间： 出峰完毕。 Excitation A: 激发波长:200-700nm,步长为 1nm,或Zero Order。 Emission: 发射波长: 280-900nm, 步长为 1nm,或Zero Order。
10、 PMT: 大多数应用适当的设定值为 10,若高浓度样品峰被切平头,则减少 PMT 值。6 “Peak width”：大多数应用设为 4s，只有快速分析采用小的设定值。 Multi Ex ： 多波长及光谱（激发）。 Multi Em：多波长及光谱（发射）。 同时可以输入范围 Range、步长 step、采集光谱。10、在“ Run time checklist ”中选中“Data acquisition”，单击 Ok。11、单击“Method”菜单，选中“Save method as”，输入一方法名，如“test”，单击 Ok。12、从菜单 “View”中选中”Online signal” ,
11、选中Windows 1,然后单击 Change 钮,将所要绘图的信号移到右边的框中,点击 Ok.(如同时检测二个信号,则重复 12,选中 Windows 2)。13、从“Run control ”菜单中选择“Sample info”选项，如上图所示，输入操作者名称，在“Data file ”中选择“Manual”或“Prefix”。区别: Manual-每次做样之前必须给出新名字,否则仪器会将上次的数据覆盖。Prefix在 Prefix 框中输入前缀，在 Counter 框中输入计数器的起始位，仪器会自动命名，如vwd0001，vwd0002。14、从 Instrument 菜单选择 Syst
12、em on。15、等仪器 Ready，基线平稳，从 Method 菜单中选择“Run method”，进样。7（三）、数据分析方法编辑:1、从“View”菜单中，单击“Data analysis”进入数据分析画面。2、从“File”菜单选择“Load signal”，选中您的数据文件名，如下图所示。单击 Ok。3、做谱图优化,从“Graphics”菜单中选择“Signal options”选项，。从 Ranges 中选择 Auto scale 及合适的显示时间，单击 ok,或选择”Use Ranges” 调整。反复进行，直到图的比例合适为止。4、积分: (1)、从“Integration”中选
13、择 “Auto integrate”,如积分结果不理想,再从菜单中选择“Integration Events”选项，选择合适的 Slope sensitivity，Peak width，Area reject，Height reject。(2)、从“Integration”菜单中选择“Integrate”选项， 则数据被积分。(3)、如积分结果不理想，则修改相应的积分参数，直到满意为止。(4)、单击左边“”图标，将积分参数存入方法。5、打印报告: (1)、从“Report”菜单中选择“Specify report”选项，进入如上画面。(2)、单击“Quantitative Results”框中
14、 Calculate 右侧的黑三角，选中 Percent（面积百分比），其它选项不变。8(3)、单击 Ok.(4)、从“Report”菜单中选择“Print report”，则报告结果将打印到屏幕上，如想输出到打印机上，则单击 Report 底部的“Print”钮。(四)、关机: 关机前，用 100%的水冲洗系统 20 分钟，然后用有机溶剂冲洗系统 10 分钟（如 ACN），然后关泵，（适于反相色谱柱）。正相色谱柱用适当的溶剂冲洗 退出化学工作站，及其它窗口，关闭计算机（用 shut down 关）。关掉 Agilent 1100 电源开关。Agilent1100 高压液相色谱仪维护保养知识保
15、养事项：1、色谱柱长时间不用，存放时，柱内应充满溶剂，两端封死（如ACN 适于反相色谱柱，正相色谱柱用相应的有机相）2、对于手动进样器，当使用缓冲溶液时，要用水冲洗进样口，同时搬动进样阀数次，每次数毫升。3、流动相使用前必须过滤，不要使用多日存放的蒸馏水（易长菌）。4、带 seal-wash 的 1100，要配制 90%水+10%异丙醇，以每分 23滴的速度虹吸排出，溶剂不能干涸。5、其它主意事项见说明书，或由现场工程师介绍。9维护知识问答1、为什么溶剂和样品要过滤?溶剂和样品过滤非常重要，它会对色谱柱、仪器起到保护作用，消除由于污染对分析结果的影响。色谱柱：由于填料颗粒很细，色谱柱内腔很小，
16、溶剂和样品中的细小颗粒会使色谱柱和毛细管容易堵塞。仪器：溶剂和样品中的细小颗粒会增加进样阀的堵塞和磨损，同时也会增加泵头内的蓝宝石活塞杆和活塞的磨损。样品过滤头的类型：30mm 内径：适用于大进样量的过滤，由 0.2m 和 0.45m 两种规格,材料有纤维素,醋酸纤维,聚四氟乙烯。处理样品体积少于 50l。13mm 内径：适用于范围广的过滤，由 0.2m 和 0.45m 两种规格,材料为纤维素。3mm 内径：适用于小进样量的过滤，由 0.2m 和 0.45m 两种规格。处理样品体积为 7l。滤膜类型：聚四氟乙烯滤膜：适用于所有溶剂，酸和盐，并无任何可溶物。醋酸纤维滤膜：不适用于有机溶剂，特别适
17、用于水基溶液，推荐用于蛋白质和其相关样品。尼龙 66 滤膜：适用于绝大多数有机溶剂和水溶液，可用于强酸，70%乙醇、二氯甲烷、不适用于二甲基甲酰胺。再生纤维素滤膜：具有蛋白吸收低，同样适用水溶性样品和有机溶剂。102、为什么 HPLC 用缓冲盐时要加在线 Seal-wash 选项？HPLC 用缓冲盐时,由于泵头内的缓冲盐溶液存在高压析盐现象,析出的细小盐粒非常坚硬,它附着在蓝宝石活塞杆上,随着蓝宝石活塞杆的往复运动,容易产生划痕,并磨损密封垫,造成漏液等故障现象。在线 Seal-wash 选项能有效的带走可能存在的缓冲盐结晶。缓冲盐的浓度在 0.1mol 或大于 0.1mol 时,必须使用该在
18、线冲洗选项.清洗液配制: 90%水+10%异丙醇.该混合液可抑制菌类生长和减小水的表面张力。以 2-3 滴/min 的速度虹吸流下，不能干涸。3、为什么 Agilent 1100LC 的流动相管路非常细?在使用 HPLC 时,应特别注意”柱外效应”对分析结果的影响，由于样品分子在液体流动相中的扩散系数比在气体中小 45 个数量级，液体流动相的流速也比气相慢 1-2 个数量级。因此，样品进入色谱柱后，在柱子以外的任何死体积（进样器、柱接头、连接管、检测器）中，样品分子的扩散和滞留，都会引起色谱峰的展宽，而使柱效降低。为使柱外效应减之最小，获得理想的分析结果，Agilent 1100LC 使用加工
19、工艺难度高的毛细管线作为流动相管路。毛细管线分类：0.17mm 内径 -绿色 ;0.12mm 内径-红色。PEEK 管线：内径 -0.13mm;0.18mm;0.25mm;0.5mm。毛细管线优点: 柔韧性好. *Agilent 公司同时备有 1/16in 的粗外径毛细管线,适用于不同习惯的用户 ,优点是刚性好,但柔韧性差一些。 114、流动相使用前为什么要脱气？ 流动相使用前必须进行脱气处理 ，以除去其中溶解的气体（如O2），以防止在洗脱过程中当流动相由色谱柱流至检测器时，因压力降低而产生气泡。气泡会增加基线的噪音，造成灵敏度下降，甚至无法分析。溶解的氧气还会导致样品中某些组份被氧化，柱中固
20、定相发生降解而改变柱的分离性能。若用 FLD，可能会造成荧光猝灭。常用的脱气方法比较： 氦气脱气法：利用液体中氦气的溶解度比空气低，连续吹氦脱气，效果较好，但成本高。加热回流法：效果较好，但操作复杂，且有毒性挥发污染。抽真空脱气法：易抽走有机相。超声脱气法：流动相放在超声波容器中，用超声波振荡 10-15min，此法效果最差。在线真空脱气法：Agilent1100LC 真空脱机利用膜渗透技术， 在线脱气，智能控制，无需额外操作，成本低，脱气效果明显优于以上几种方法，并适用于多元溶剂体系。5、如何防止溶剂瓶内溶剂过滤器的堵塞，以及堵塞后的处理？溶剂的质量或污染以及藻类的生长会堵塞溶剂过滤器，从而
21、影响泵的运行，尤其水溶液或磷酸盐缓冲液（PH=47）。以下几种方法可以有效防止溶剂瓶内溶剂过滤器的堵塞。A：请严格执行溶剂过滤。B：请勿使用多日存放的蒸馏水及磷酸盐缓冲液C：如果应用许可，可在溶剂中加入 0.0001-0.001M 的叠氮化钠. 12D:在溶剂瓶内溶剂的上方小流量连续吹氩气,以隔绝空气。E：避免使溶剂瓶暴露在直射阳光下，尽量使用琥珀色的溶剂瓶盛放水溶液或磷酸盐缓冲液。堵塞后的处理法方法：将过滤头从组件中取下，在浓硝酸（35%）中浸泡 1h，然后用二次蒸馏水冲洗干净并超声处理。6、Agilent 1100LC 泵如何维护？Agilent 1100LC 泵给色谱柱提供稳定、无脉动、
22、流量准确的流动相，及时合理的维护非常重要。A：流动相使用前请必须脱气、过滤。B：使用缓冲盐时，要加在线 Seal-wash 选项。C：关机前，用 100%的水冲洗系统 20 分钟，然后用有机溶剂冲洗系统 10 分钟（如甲醇），然后关泵，（适于反相色谱柱）。正相色谱柱用适当的溶剂冲洗D：及时更换 Purge Valve 内的过滤芯。（当打开 Purge Valve 时，压力高于 10bar，表明过滤芯已堵）。E：使用合适的密封圈。7、如何选择合适的泵头活塞密封圈？泵头活塞的标准密封圈能适合于大多数应用，但使用正相溶剂（如正己烷），不适合使用标准活塞密封圈，特别是长时间使用时，需更换另一种不同的密
23、封圈，我们建议使用聚四氟乙烯密封圈。（p/n0905-1420 2/pk）*注意：聚四氟乙烯密封圈的压力范围为：0200bar；建议在泵的压力限制中，将最大压力设为 200bar。138、使用梯度比例发时要注意那些事项？当盐溶液与有机溶剂溶液混合时，盐溶液能与有机溶剂溶液完全混溶，而不会出现沉淀。但是在比例阀的混合点，重力作用使盐颗粒沉淀下来，通常，阀 A 接水相/盐溶液，D 接有机溶剂，此法连接可有效使盐回落到盐溶液中，并被溶解。若颠倒过来，盐可能落在有机溶剂中，出现问题。强烈建议：当使用缓冲盐溶液和有机溶剂时，推荐将缓冲盐通道接在 A 通道上，有机溶剂通道直接接在 A 通道的上方 D 通道
24、上；定期用水冲洗所有的通道，以除去阀口上可能出现的盐沉淀。9、在线真空脱气机使用要注意那些事项？一般来说，Agilent 1100LC 的真空脱气机无需过多维护，只需注意几个注意事项就可以了。A：第一次使用，要用随仪器附带的注射器抽满脱气机腔体；更换不同类型的溶剂时，要先抽空，再抽满。B：不用的通道要充满溶剂或密闭起来。10、更换色谱柱时要注意什么事项?在使用 HPLC 时,应特别注意”柱外效应”对分析结果的影响，由于样品分子在液体流动相中的扩散系数比在气体中小 45 个数量级，液体流动相的流速也比气相慢 1-2 个数量级。因此，样品进入色谱柱后，在柱子以外的任何死体积（进样器、柱接头、连接管
25、、检测器）中，样品分子的扩散和滞留，都会引起色谱峰的展宽，而使柱效降低 。为使柱外效应减之最小，获得理想的分析结果，仪器的流动相管路连接非常重要,一般 Agilent 1100LC 在第一次安装时,均有受过专业14培训的安装工程师负责安装,各种接头会处理的非常完美。客户只需在更换色谱柱时注意接头处理就可以了，一般柱子入口接头为不锈钢卡套接头，柱子出口为不锈钢卡套接头或 PEEK 管线手拧街头，当完成第一次安张后，不锈钢卡套已固定死，当接不同的柱子时，要注意柱子接头处的形状和长度，否则会产生一个非常大的死体积。11、手动进样阀需做那些维护，使用时要注意什么？对于手动进样器，当使用缓冲溶液后，或者
26、进浓度差异比较大的样品时要用专用工具而不是用带针头的注射器冲洗进样口，同时搬动进样阀数次，每次数毫升。注意事项：安装时六通阀的 5，6 出口要与注射器在同一水平线上，以防止虹吸现象的发生，导致进样量的重复性变异。进样量的多少要根据定量管的 LOOP 体积决定。当样品量少时：进样体积由注射器的进样体积决定，但最大进样体积 要小于 1/2loop 体积。当样品量较多时：进样体积由定量管的体积决定，为保证样品完全把定量管的流动相置换干净，需注射 56 倍的 LOOP 体积。要使用专用的液相注射器进样，绝对不可以用气相的注射器。高压液相色谱 HPLC 常见故障及排除方法诊状(一)保留时间变化可能的原因
27、 : 解 决 方 法151.柱温变化 : 柱恒温 2.等度与梯度间未能充分平衡 : 至少用 10 倍柱体积的流动相平衡柱 3.缓冲液容量不够 : 用25mmol/L 的缓冲液 4.柱污染 : 每天冲洗柱 5.柱内条件变化 : 稳定进样条件,调节流动相 6.柱快达到寿命 : 采用保护柱 (二)保留时间缩短可能的原因 : 解 决 方 法1.流速增加 : 检查泵,重新设定流速 2.样品超载 : 降低样品量 3.键合相流失 : 流动相 PH 值保持在 37.5 检查柱的方向 4.流动相组成变化 : 防止流动相蒸发或沉淀 5.温度增加 : 柱恒温 (三)保留时间延长可能的原因 : 解 决 方 法1.流速
28、下降 : 管路泄漏,更换泵密封圈,排除泵内气泡 2.硅胶柱上活性点变化 : 用流动相改性剂,如加三乙胺,或采用碱至钝化柱 3.键合相流失 : 同前(二)3 4.流动相组成变化 : 同前(二)4 5.温度降低 : 同前(二)5 (四)出现肩峰或分叉可能的原因 : 解 决 方 法161.样品体积过大 : 用流动相配样,总的样品体积小于第一峰的 15% 2.样品溶剂过强 : 采用较弱的样品溶剂 3.柱塌陷或形成短路通道 : 更换色谱柱,采用较弱腐蚀性条件 4.柱内烧结不锈钢失效 : 更换烧结不锈钢,加在线过滤器,过滤样品 5.进样器损坏 : 更换进样器转子(五)鬼峰可能的原因 : 解 决 方 法1.
29、进样阀残余峰 : 每次用后用强溶剂清洗阀,改进阀和样品的清洗 2.样品中未知物 : 处理样品 3.柱未平衡 : 重新平衡柱,用流动相作样品溶剂 (尤其是离子对色谱) 4.三氟乙酸(TFA)氧化(肽谱) : 每天新配,用抗氧化剂 5.水污染(反相) : 通过变化平衡时间检查水质量，用 HPLC 级的水 (六)基线噪声可能的原因 : 解 决 方 法1.气泡(尖锐峰) : 流动相脱气,加柱后背压 2.污染(随机噪声) : 清洗柱,净化样品,用 HPLC 级试剂 3.检测器灯连续噪声 : 更换氘灯 4.电干扰(偶然噪声) : 采用稳压电源,检查干扰的来源(如水浴等) 5.检测器中有气泡 : 流动相脱气
30、,加柱后背压 (七)峰拖尾可能的原因 : 解 决 方 法171.柱超载 : 降低样品量,增加柱直径采用较高容量的固定相 2.峰干扰 : 清洁样品,调整流动相 3.硅羟基作用 加三乙胺,用碱致钝化柱增加缓冲液或盐的浓度降低流动相 PH 值,钝化样品 4.同前(四)4 : 同前(四)4 5.同前(四)3 5. : 同前(四)3 6.死体积或柱外体积过大 : 连接点降至最低,对所有连接点作合适调整,尽可能采用细内径的连接管 7.柱效下降 : 用较低腐蚀条件,更换柱,采用保护柱 (八)峰展宽可能的原因 : 解 决 方 法1.进样体积过大 : 同(四)1 2.在进样阀中造成峰扩展 : 进样前后排出气泡以
31、降低扩散 3.数据系统采样速率太慢 : 设定速率应是每峰大于 10 点 4.检测器时间常数过大 : 设定时间常数为感兴趣第一峰半宽的 10% 5.流动相粘度过高 : 增加柱温,采用低粘度流动相 6.检测池体积过大 : 用小体积池,卸下热交换器 7.保留时间过长 : 等度洗脱时增加溶剂含量也可用梯度洗脱 8.柱外体积过大 : 将连接管径和连接管长度降至最小 9.样品过载 : 进小浓度小体积样品 液相色谱柱使用及保养18液相色谱仪由高压液体泵、检测器及液相色谱柱等三部分组成，其中液相色谱柱的正确安装和使用，是液相色谱工作的关键；也是液相色谱工作者获得正确可靠的实验数据的必经之路。一、液相色谱柱的安
32、装：1、液相色谱柱的结构：a、空柱由柱接头、柱管及滤片组装而成。柱接头采用低死体积结构，柱接头是两端螺纹组件，一端是为7/16 英寸外螺纹，另一端是 316 英寸的内螺纹(国内外已规范化)。716 英寸外螺纹与 14 英寸柱管(6.35mm)连接，中间放置压坏用于密封。316 英寸的内螺纹与 116 英寸(1.57mm)的连接管连接，中间也放置压环用于柱接头的密封。为了尽量减少柱外死体积，在安装色谱柱时，用 1.57mm 连接管通过空心螺钉压环后要尽量插到底，然后再拧紧空心螺钉。压环被空心螺钉挤压变形后紧箍在连接管上(连接管通过压环后露出的管长度应严格控制在 25mm 长或其他固定尺寸)。在两
33、端柱接头内，柱管两端各放置一片不锈钢滤片(或滤网)，用于封堵柱填料不被流动相冲出柱外而流失。空柱各组件均为 316#不锈钢材质，能耐受一般的溶剂作用。但由于含氯化物的溶剂对其有一定的腐蚀性，故使用时要注意，柱及连接管内不能长时间存留此类溶剂，以避免腐蚀。b、柱填料：液相色谱柱的分离作用是在填料与流动相之间进行的，柱子的分类是依据填料类型而定。19正相柱：多以硅胶为柱填料。根据外型可分为无定型和球型两种，其颗粒直径在 310 m 的范围内。另一类正相填料是硅胶表面键合CN，-NH2 等官能团即所谓的键合相硅胶。反相柱：主要是以硅胶为基质，在其表面键合十八烷基官能团(ODS)的非极性填料。也有无定
34、型和球型之分。常用的其他的反相填料还有键合 C8、C4、C2、苯基等，其颗粒粒径在 310 m 之间。2，色谱柱的安装：a、拆开柱包装盒，确认色谱柱的类型、尺寸、出厂日期以及柱内贮存的溶剂。b、拧下柱两端接头的密封堵头放回包装盒供备用。c、 按柱管上标示的流动相流向，将色谱柱的入口端通过连接管与进样阀出口相连接(如条件允许，建议在柱前使用保护柱)；柱的出口与检测器连接。连接管是外径为 1.57mm、内径为 0.1-0.3mm 的不锈钢管。连接管的两端均有空心螺钉及密封用压环。在接管时一定要设法降低柱外死体积。连接管通过空心螺钉、压环后尽量用力插到底，然后顺时针拧紧空心螺钉，直到拧不动为止，再用
35、扳手继续顺时针拧14-12 圈，切记不要用力过大。如色谱柱通过流动相加压后有漏液现象，请用扳手继续顺时针拧 14 圈，直至不漏液为止。二、液相色谱柱的使用：色谱柱在使用前，最好进行柱的性能测试，并将结果保存起来，作为今后评价柱性能变化的参考。但要注意：柱性能可能由于所使用的样品、流动相、柱温等条件的差异而有所不同；另外，在做柱性能20测试时是按照色谱柱出厂报告中的条件进行(出厂测试所使用的条件是最佳条件)，只有这样，测得的结果才有可比性。1、样品的前处理：a、最好使用流动相溶解样品。b、使用予处理柱除去样品中的强极性或与柱填料产生不可逆吸附的杂质。c、使用 0.45m 的过滤膜过滤除去微粒杂质
36、。2、流动相的配制：液相色谱是样品组分在柱填料与流动相之间质量交换而达到分离的目的，因此要求流动相具备以下的特点：a、流动相对样品具有一定的溶解能力，保证样品组分不会沉淀在柱中(或长时间保留在柱中)。b、流动相具有一定惰性，与样品不产生化学反应(特殊情况除外)。c、流动相的黏度要尽量小，以便在使用较长的分析柱时能得到好的分离效果；同时降低柱压降，延长液体泵的使用寿命(可运用提高温度的方法降低流动相的黏度)。d、流动相的物化性质要与使用的检测器相适应。如使用 UV 检测器，最好使用对紫外吸收较低的溶剂配制。e、流动相沸点不要太低，否则容易产生气泡，导致实验无法进行。21f、在流动相配制好后，一定
37、要进行脱气。除去溶解在流动相中的微量气体既有利于检测，还可以防止流动相中的微量氧与样品发生作用。3、流动相流速的选择：因柱效是柱中流动相线性流速的函数，使用不同的流速可得到不同的柱效。对于一根特定的色谱柱，要追求最佳柱效，最好使用最佳流速。对内径为 4.6mm 的色谱柱，流速一般选择 1mlmin，对于内径为 4.0mm 柱，流速 0.8mlmin 为佳。当选用最佳流速时，分析时间可能延长。可采用改变流动相的洗涤强度的方法以缩短分析时间(如使用反相柱时，可适当增加甲醇或乙腈的含量)。注意：a由于甲醇廉价，对于反相柱推荐使用甲醇体系(必须使用乙腈的场合除外)。b对于正相柱推荐使用沸程为 30-6
38、0的石油醚或提纯后的己烷作流动相，没有提纯的己烷不得使用。用水最好使用超纯水(电阻率大于 18 兆欧)，去离子水及双蒸水中含有酚类杂质，有可能影响分析结果。c含水流动相最奸在实验前配制，尤其是夏天使用缓冲溶液作为流动相不要过夜。最好加入叠氮化钠，防止细菌生长。d流动相要求使用 0.45 m 滤膜过滤，除去微粒杂质。e使用 HPLC 级溶剂配制流动相，使用合适的流动相可延长色谱柱的使用寿命，提高柱性能。224、柱性能测试：启动液相色谱仪：a、流动相流速设定为 1mlmin。b、UV 检测器波长设定为 254nm。使用出厂测试时使用的流动相组成及测试样品。记录并计算测试结果。*参考(标准 JB52
39、26-91)液相色谱仪测试用标准色谱柱。高压液相色谱 HPLC 培训教程(一) I概论一、液相色谱理论发展简况色谱法的分离原理是：溶于流动相(mobile phase)中的各组分经过固定相时，由于与固定相(stationary phase)发生作用（吸附、分配、离子吸引、排阻、亲和）的大小、强弱不同，在固定相中滞留时间不同，从而先后从固定相中流出。又称为色层法、层析法。色谱法最早是由俄国植物学家茨维特（Tswett）在 1906 年研究用碳酸钙分离植物色素时发现的，色谱法(Chromatography)因之得名。后来在此基础上发展出纸色谱法、薄层色谱法、气相色谱法、液相色谱法。液相色谱法开始阶
40、段是用大直径的玻璃管柱在室温和常压下用液位差输送流动相，称为经典液相色谱法，此方法柱效低、时间长（常有几个小时）。高效液相色谱法(High performance Liquid Chromatography，HPLC)是在经典液相色谱法的基础上，于 60 年代后期引入了气相色谱理论而迅速发展起来的。它与经典液相色谱法的区别是填料颗粒小而均匀，小颗粒具有高柱效，但会引起高阻力，需用高压输送流动相，故又称高压液相色谱法(High Pressure Liquid 23Chromatography，HPLC)。又因分析速度快而称为高速液相色谱法(High Speed Liquid Chromatogr
41、aphy，HSLP)。也称现代液相色谱。二、HPLC 的特点和优点HPLC 有以下特点：高压-压力可达 150300Kg/cm2。色谱柱每米降压为 75 Kg/cm2 以上。高速-流速为 0.110.0 ml/min。高效-可达 5000 塔板每米。在一根柱中同时分离成份可达 100 种。高灵敏度-紫外检测器灵敏度可达 0.01ng。同时消耗样品少。HPLC 与经典液相色谱相比有以下优点：速度快-通常分析一个样品在 1530 min，有些样品甚至在 5 min 内即可完成。分辨率高-可选择固定相和流动相以达到最佳分离效果。灵敏度高-紫外检测器可达 0.01ng，荧光和电化学检测器可达0.1pg
42、。柱子可反复使用-用一根色谱柱可分离不同的化合物。样品量少，容易回收-样品经过色谱柱后不被破坏，可以收集单一组分或做制备。三、色谱法分类按两相的物理状态可分为：气相色谱法(GC)和液相色谱法(LC)。气相色谱法适用于分离挥发性化合物。GC 根据固定相不同又可分为气固色谱法(GSC)和气液色谱法(GLC)，其中以 GLC 应用最广。液相色谱法适用于分离低挥发性或非挥发性、热稳定性差的物质。LC 同样24可分为液固色谱法(LSC)和液液色谱法(LLC)。此外还有超临界流体色谱法(SFC)，它以超临界流体（界于气体和液体之间的一种物相）为流动相（常用 CO2），因其扩散系数大，能很快达到平衡，故分析
43、时间短，特别适用于手性化合物的拆分。按原理分为吸附色谱法(AC)、分配色谱法(DC)、离子交换色谱法(IEC)、排阻色谱法(EC，又称分子筛、凝胶过滤(GFC)、凝胶渗透色谱法(GPC）和亲和色谱法,此外还有电泳。按操作形式可分为纸色谱法(PC)、薄层色谱法(TLC)、柱色谱法。四、色谱分离原理高效液相色谱法按分离机制的不同分为液固吸附色谱法、液液分配色谱法（正相与反相）、离子交换色谱法、离子对色谱法及分子排阻色谱法。1液固色谱法 使用固体吸附剂，被分离组分在色谱柱上分离原理是根据固定相对组分吸附力大小不同而分离。分离过程是一个吸附解吸附的平衡过程。常用的吸附剂为硅胶或氧化铝，粒度 510m。
44、适用于分离分子量 2001000 的组分，大多数用于非离子型化合物，离子型化合物易产生拖尾。常用于分离同分异构体。2液液色谱法 使用将特定的液态物质涂于担体表面，或化学键合于担体表面而形成的固定相，分离原理是根据被分离的组分在流动相和固定相中溶解度不同而分离。分离过程是一个分配平衡过程。25涂布式固定相应具有良好的惰性；流动相必须预先用固定相饱和，以减少固定相从担体表面流失；温度的变化和不同批号流动相的区别常引起柱子的变化；另外在流动相中存在的固定相也使样品的分离和收集复杂化。由于涂布式固定相很难避免固定液流失，现在已很少采用。现在多采用的是化学键合固定相，如 C18、C8、氨基柱、氰基柱和苯
45、基柱。液液色谱法按固定相和流动相的极性不同可分为正相色谱法(NPC)和反相色谱法(RPC)。正相色谱法 采用极性固定相(如聚乙二醇、氨基与腈基键合相)；流动相为相对非极性的疏水性溶剂(烷烃类如正已烷、环已烷），常加入乙醇、异丙醇、四氢呋喃、三氯甲烷等以调节组分的保留时间。常用于分离中等极性和极性较强的化合物(如酚类、胺类、羰基类及氨基酸类等）。反相色谱法 一般用非极性固定相（如 C18、C8）；流动相为水或缓冲液，常加入甲醇、乙腈、异丙醇、丙酮、四氢呋喃等与水互溶的有机溶剂以调节保留时间。适用于分离非极性和极性较弱的化合物。RPC 在现代液相色谱中应用最为广泛，据统计，它占整个 HPLC 应用
46、的 80%左右。随着柱填料的快速发展，反相色谱法的应用范围逐渐扩大，现已应用于某些无机样品或易解离样品的分析。为控制样品在分析过程的解离，常用缓冲液控制流动相的 pH 值。但需要注意的是，C18 和 C826使用的 pH 值通常为 2.57.5（28），太高的 pH 值会使硅胶溶解，太低的 pH 值会使键合的烷基脱落。有报告新商品柱可在 pH 1.510范围操作。正相色谱法与反相色谱法比较表正相色谱法 反相色谱法固定相极性 高中 中低流动相极性 低中 中高组分洗脱次序 极性小先洗出 极性大先洗出从上表可看出，当极性为中等时正相色谱法与反相色谱法没有明显的界线（如氨基键合固定相）。3离子交换色谱
47、法 固定相是离子交换树脂，常用苯乙烯与二乙烯交联形成的聚合物骨架，在表面未端芳环上接上羧基、磺酸基（称阳离子交换树脂）或季氨基（阴离子交换树脂）。被分离组分在色谱柱上分离原理是树脂上可电离离子与流动相中具有相同电荷的离子及被测组分的离子进行可逆交换，根据各离子与离子交换基团具有不同的电荷吸引力而分离。缓冲液常用作离子交换色谱的流动相。被分离组分在离子交换柱中的保留时间除跟组分离子与树脂上的离子交换基团作用强弱有关外，27它还受流动相的 pH 值和离子强度影响。pH 值可改变化合物的解离程度，进而影响其与固定相的作用。流动相的盐浓度大，则离子强度高，不利于样品的解离，导致样品较快流出。离子交换色
48、谱法主要用于分析有机酸、氨基酸、多肽及核酸。4离子对色谱法 又称偶离子色谱法，是液液色谱法的分支。它是根据被测组分离子与离子对试剂离子形成中性的离子对化合物后，在非极性固定相中溶解度增大，从而使其分离效果改善。主要用于分析离子强度大的酸碱物质。分析碱性物质常用的离子对试剂为烷基磺酸盐，如戊烷磺酸钠、辛烷磺酸钠等。另外高氯酸、三氟乙酸也可与多种碱性样品形成很强的离子对。分析酸性物质常用四丁基季铵盐，如四丁基溴化铵、四丁基铵磷酸盐。离子对色谱法常用 ODS 柱（即 C18），流动相为甲醇-水或乙腈-水，水中加入 310 mmol/L 的离子对试剂，在一定的 pH 值范围内进行分离。被测组分保时间与
49、离子对性质、浓度、流动相组成及其 pH值、离子强度有关。5排阻色谱法 固定相是有一定孔径的多孔性填料，流动相是可以溶解样品的溶剂。小分子量的化合物可以进入孔中，滞留时间长；大分子量的化合物不能进入孔中，直接随流动相流出。它利用分子筛对分子量大小不28同的各组分排阻能力的差异而完成分离。常用于分离高分子化合物，如组织提取物、多肽、蛋白质、核酸等。高压液相色谱 HPLC 培训教程(二) II基本概念和理论一、基本概念和术语1色谱图和峰参数色谱图(chromatogram)-样品流经色谱柱和检测器，所得到的信号-时间曲线，又称色谱流出曲线(elution profile)。基线(base line)-经流动相冲洗，柱与流动相达到平衡后，检测器测出一段时间的流出曲线。一般应平行于时间轴。噪音(noise)-基
